一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建。采用的技术方案是：(1)PCR扩增GST标签蛋白序列、SacR调控序列以及目的蛋白序列；(2)PCR产物与载体pHY300-PLK连接，构建重组质粒；(3)重组质粒转化枯草芽孢杆菌WB600，蔗糖诱导蛋白表达，得到融合蛋白。本发明通过PCR扩增、酶切、连接、转化和筛选，证实未加蔗糖诱导之前，仅有极低的痕量融合蛋白表达，诱导后32小时得到高效表达的融合蛋白，该融合蛋白通过对目的蛋白的抑菌效果检测以及针对GST标签蛋白的Western-Blot检测实验确定两种蛋白正确融合与表达。
【专利说明】一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建
【技术领域】
[0001]本发明涉及大肠-枯草穿梭诱导载体的构建和转化及表达。
【背景技术】
[0002]近些年来，枯草芽孢杆菌基因组的成功测序催化了枯草芽孢杆菌作为外源蛋白分泌载体的研究，成绩斐然。基于全基因组的测定，使得通过信号肽预测软件经生物信息学分析识别信号肽并确认分泌蛋白成为可能。结合信号肽预测结果以及已知的分泌蛋白基因结构，将有可能构建一个新的分泌蛋白组(Secretome),其中包含各种已知的及未知的分泌蛋白信息。通过此种方法，预测得到的枯草芽孢杆菌蛋白质组中已含有4107种蛋白，即占总蛋白25%的蛋白序列含有膜定位信号。
[0003]枯草芽孢杆菌表达系统的优点是:(1)能将蛋白表达产物高效分泌培养基中，在多数情况下，经芽孢杆菌分泌后真核生物的异源重组蛋白就是经过简单折叠的天然构并且具备原有的生物活性；(2)许多芽孢杆菌在传统发酵工业中已经有几十年的历史，它们无致病性而且不产生内毒素；(3)芽孢杆菌的分子遗传背景清楚，生长迅速，培养条件简单。但是由于膜定位能力的缺乏、转移前折叠、转移折叠缓慢、低效转移以及错误折叠和蛋白酶水解等因素，外源蛋白的表`达进展受限。
[0004]外源蛋白的高效表达对于真核蛋白对枯草杆菌表达系统来说并不理想，主要的影响因素是外源蛋白与枯草杆菌的分泌元件不协调。为了达到高表达水平和更广的表达范围的目的，须对其分泌机制进行完整且深入的研究，并通过基因工程等手段加以解决。这方面已有成功的报告，如吴青等构建的枯草杆菌诱导型高效-表达分泌系统，在原有诱导系统上添加正调控基因degU及degQ，获得了 296倍表达的调控基因sacB，并使地衣杆菌a -淀粉酶的表达量达到原有的140倍。
[0005]枯草芽孢杆菌所承载的质粒的结构和分离上的不稳定性直接影响该表达系统在工业生产中的应用，在大规模生产中，质粒容易发生丢失或结构改变的情况，对目的蛋白的产率造成影响。为了解决这一问题，目前的研究方向集中于:①添加多个正调控基因并使用诱导系统调控外源蛋白的表达；②采取整合表达的方式，将外源基因整合到枯草芽孢杆菌染色体，以保证质粒的稳定性。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于构建一种使用无毒物质进行诱导的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，通过该载体进行蛋白的表达。
[0007]1、穿梭质粒的构建
[0008]根据上述目的及载体的克隆位点，利用引物设计软件Primer Premier5设计引物，扩增调控序列SacR、标签蛋白GST序列以及目的蛋白序列，连接为重组序列后连入PHY300-PLK空载体，构建重组质粒，重组质粒转化入枯草芽孢杆菌WB600后提取质粒进行双酶切鉴定并对载体进行测序验证。[0009]2、目的蛋白的表达
[0010]使用枯草芽孢杆菌WB600进行蛋白表达检测，得到融合蛋白。通过SDS-PAGE进行初步验证并获得最优表达时间，对表达产物进行目的蛋白的抑菌效果和GST标签蛋白的Western-Blot验证,证实该载体能够正确表达融合蛋白。
[0011]本发明采用的技术方案是:一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建，方法如下:
[0012]DSacR调控序列的制备:提取枯草芽孢杆菌基因组；根据NCBI公布的SacB序列，以提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计上下游引物PSl及pS2，在两端分别添加Xba I和NdeI酶切位点，PCR扩增获得SacR调控序列；
[0013]所述的上游引物pSl 的序列为 GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC ；
[0014]所述的下游引物pS2 的序列为 GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG ；
[0015]2)制备GST标签 蛋白序列；
[0016]3)获得目的蛋白序列；
[0017]4)各元件的连接以及与载体的连接:连接经Quick Cut Nde I内切酶处理的SacR片段与GST片段，得到SG序列，经Quick Cut Vsp I酶切后与同样经该酶酶切的目的蛋白序列片段进行连接，得到重组序列；将重组序列和提取质粒PHY300-PLK分别经Quick CutHind III和Quick Cut Xba I双酶切后连接，得到重组质粒；
[0018]5)重组质粒的转化:将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中；
[0019]6)目的蛋白在枯草芽孢杆菌WB600中的诱导表达:选取5)步获得的阳性转化子接种于含有Tetracycline的LB液体培养基中，37°C、200rpm活化2h，之后以1%接种量接种于Tetracycline的LB液体培养基中，37°C、180rpm震荡3h, 12000rpm离心IOmin后取上清液，上清液中加入20%蔗糖溶液作为诱导剂至终浓度为2%，持续诱导48h，12000rpm离心IOmin,取上清液。
[0020]本发明中，步骤I)中所述的SacR序列对其后的蛋白表达起到受诱导的调控作用，可控制蛋白是否表达，在表达后自动切断与后续蛋白的连接；步骤2)中所述的GST标签蛋白序列与目的蛋白序列中间以肠激酶酶切位点连接，在动物肠道中可以自行切割，标签蛋白在方便纯化的同时可以起到催化亲核性的谷胱甘肽与各种亲电子性的外源化学物质的结合，从而阻止它们与细胞生物大分子重要成分的共价结合，起到解毒作用。
[0021]本发明的有益效果是:鹿糖诱导系统归属于枯草芽孢杆菌Tat (twin-argininetranslocation)分泌途径,与另一分泌途径Sec(Secratory-type)不同，突破了 Sec途径中不能转移在细胞质中折叠完的蛋白以及外源蛋白转移至膜外折叠缓慢易被降解的瓶颈。通过鹿糖果聚糖酶(Levansucrase)的启动子-信号肽序列(SacB p.s.，SacR)的调控和引导，可以使外源蛋白受控表达并分泌至胞外。本发明通过PCR扩增、酶切、连接、转化和筛选，证实在添加诱导剂蔗糖之前，只有极低的痕量融合蛋白得以表达，蔗糖诱导32小时候得到最高产量的融合蛋白。经抑菌对比试验证实目的蛋白的抑菌效果良好。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1质粒pHY300-PLK结构图。
[0023]图2琼脂糖凝胶电泳鉴定调控序列SacR的PCR结果。[0024]图3琼脂糖凝胶电泳鉴定标签蛋白序列GST的PCR结果。
[0025]图4琼脂糖凝胶电泳鉴定检测AWRK6序列的PCR结果。
[0026]图5琼脂糖凝胶电泳鉴定元件拼接的PCR结果。
[0027]图6琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒pHY300-PLK Hind III单酶切结果。
[0028]图7琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒pHYSGA Hind III/Xba I双酶切结果。
[0029]图8 SacR序列per产物测序部分结果。
[0030]图9 GST标签序列per产物测序部分结果。
[0031]图10 AWRK6序列测序部分结果。
[0032]图11 SGA序列连接产物测序部分结果。
[0033]图12琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子PCR验证。
[0034]图13琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性转化子双酶切结果。
[0035]图14 SDS-PAGE鉴定AWRK6在枯草芽孢杆菌WB600中诱导表达结果。
[0036]其中，M:Premixe d Protein Marker (Broad) ； 1:诱导前上清；2:诱导后 8h 上清；
3:诱导后16h上清；4:诱导后24h上清；5:诱导后32h上清；6:诱导后40h上清；7:诱导后48h上清；8:菌体。
[0037]图15 Western-Blot鉴定AWRK6在枯草芽孢杆菌WB600中诱导表达结果。
[0038]1:未诱导；2:诱导8h上清；3:诱导16h上清；4:诱导24h上清；5:诱导3?上清；6:诱导40h上清；7:诱导48h上清；8:菌体。
【具体实施方式】
[0039]下面结合实施例进一步阐述。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件如Sambrook 等人的《分子克隆实验手册》》(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下面实施例中蛋白质的表达以抗菌肽AWRK6为例，但是并不限制本发明，任何想要表达的目的蛋白都可以按照下述方法实现。
[0040]实施例1大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建
[0041]1.SacR调控序列的制备
[0042](I)枯草芽孢杆菌基因组提取
[0043]以接种环沾取少量冻存的枯草芽孢杆菌WB600，于20mL固体LB培养基上划线，37 °C过夜培养。次日挑取单菌落接种于IOmL液体LB培养基，37°C、220rpm震荡2h，分装保留5mL种子液，其余全部加入95mL液体LB培养基中，37 °C、180rpm震荡4h至0D600nm~1.2。依照说明书使用Axygen细菌基因组DNA小量制备试剂盒提取枯草芽孢杆菌WB600的基因组。
[0044](2)以WB600基因组为模板PCR获得SacB启动子和信号肽序列
[0045]根据NCBI公布的SacB序列:
[0046]I GATCCTTTTT AACCCATCAC ATATACCTGC CGTTCACTAT TATTTAGTGA AATGAGATAT
[0047]61 TATGATATTT TCTGAATTGT GATTAAAAAG GCAACTTTAT GCCCATGCAA CAGAAACTAT
[0048]121 AAAAAATACA GAGAATGAAA AGAAACAGAT AGATTTTTTA GTTCTTTAGG CCCGTAGTCT[0049]181 GCAAATCCTT TTATGATTTT CTATCAAACA AAAGAGGAAA ATAGACCAG [T TGCAAl TCCM
[0050]241 ACGAGAGTCT AATAGAATGA GGTCGAAAAG TAAATCGCGC GGGTTTGTTActgRtaaagcI
[0051]301 |agg{ caagacc taaaatgtgt aaagggcaaa gtgtatactt tggcgtcacc
CCTTACATAT
[0052]361 TTTAGGTCTT TTTTTATTGT GCGTAACTAA CTTGCCATCT TCAAACAGGA GGGCTGGAAG
[0053]421 AAGCAGACCG CTAACACAGT ACATAAAAAA GGAGACATGA ACGATGAACA TCAAAAAGTT
[0054]481 TGCAAAACAA GCAACAGTAT TAACCTTTAC TACCGCACTG CTGGCAGGAG GCGCAACTCA
[0055]541 AGCGTTTGCG AAAGAAACGA ACCAAAAGCC ATATAAGGAA ACATACGGCA TTTCCCATAT
[0056]序列中以框线表示启动子元件，阴影表示核糖体结合位点(RBS),下划线指示的是
蔗糖果聚糖酶的信号肽序列。以上述序列为模板，设计上下游引物PSl及pS2，在两端分别
添加Xba I,Nde I酶切位点，引物序列见表1:
[0057]表1
[0058]
【权利要求】
1.一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建，其特征在于方法如下: 1)SacR调控序列的制备:提取枯草芽孢杆菌基因组；根据NCBI公布的SacB序列，以提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计上下游引物PSl及pS2，在两端分别添加Xba I和Nde I酶切位点，PCR扩增获得SacR调控序列； 所述的上游引物 PSl 的序列为 GCGTGCTCTAGAGATCCTTTTTAACCCATC ； 所述的下游引物PS2的序列为GAATTCCATATGCGCAAACGCTTGAGTTG ； 2)制备GST标签蛋白序列； 3)获得目的蛋白序列； 4)各元件的连接以及与载体的连接:连接经QuickCut Nde I内切酶处理的SacR片段与GST片段，得到SG序列，经Quick Cut Vsp I酶切后与同样经Quick Cut Vsp I酶酶切的目的蛋白序列片段进行连接，得到重组序列；将重组序列和提取质粒PHY300-PLK分别经Quick Cut Hind III和Quick Cut Xba I双酶切后连接,得到重组质粒； 5)重组质粒的转化:将重组质粒转入枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中； 6)目的蛋白在枯草芽孢杆菌WB600中的诱导表达:选取5)步获得的阳性转化子接种于含有Tetracycline的LB液体培养基中，37°C、200rpm活化2h，之后以1%接种量接种于含有Tetracycline的 LB液体培养基中，37°C、180rpm震荡3h, 12000rpm离心IOmin后取上清液，上清液中加入20%蔗糖溶液作为诱导剂至终浓度为2%，持续诱导48h，12000rpm离心I Omin,取上清,得融合多肽。
2.如权利要求1所述的一种大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭诱导表达体系的构建，其特征在于步骤I)中所述的枯草芽孢杆菌基因组是枯草芽孢杆菌WB600基因组。
【文档编号】C12R1/125GK103614409SQ201310412096
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】王秋雨, 金莉莉, 王宇, 王铮 申请人:辽宁大学