一种微小rna启动子活性检测的方法
【专利摘要】本发明公开了一种微小RNA启动子活性检测的方法，该微小RNA启动子活性检测的方法包括以下步骤：利用分子生物学技术，在无启动子、增强子的真核载体基础上，构建含miRNAs启动子、miRNA和3’段侧翼序列在内的重组真核载体；将重组真核载体体外转染真核细胞，利用荧光定量PCR仪检测miRNAs成熟体的表达；通过体外实验观察启动子表达miRNAs后的生物学效应。本发明提供的微小RNA启动子活性检测的方法可以在不依赖昂贵仪器的条件下，广泛用于分子生物学和细胞生物学实验中检测miRNAs启动子活性，方便地观察miRNAs表达后的生物学效应，检测方便并准确反映启动子活性。
【专利说明】—种微小RNA启动子活性检测的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因启动子活性检测领域，尤其涉及一种微小RNA启动子活性检测的方法。
【背景技术】
[0002]目前，公知的微小RNA启动子活性检测方法是利用分子生物学手段，将微小RNA启动子构建到pGL3-Basic载体上,重组载体转染真核细胞后，利用Luminometer突光素酶检测仪检测荧光素酶活性来判断miRNA启动子活性。
[0003]但是，该方法不仅需要依赖昂贵的专业检测仪器Luminometer荧光素酶检测仪，且无法直接观察该启动子是否可以启动miRNAs的表达及其后续的生物学效应，给广大科研工作者带来了极大的不便。
【发明内容】
[0004]本发明实施例的目的在于提供一种微小RNA启动子活性检测的方法，旨在解决目前微小RNA启动子活性检测方法需要依赖昂贵的专业检测仪器Luminometer荧光素酶检测仪，且无法直接观察该启动子是否可以启动miRNAs的表达及其后续的生物学效应的问题。
[0005]本发明实施例是这样实现的，一种微小RNA启动子活性检测的方法，该微小RNA启动子活性检测的方法包括以下步骤:
[0006]步骤一、首先通过GeneBank获得miRNA前段5’端-1064位点到其3’端侧翼+124位点的序列，通过Primer5设计对应引物；根据无启动子、增强子的真核载体pGL3.0-Basic的MCS区的酶切位点，筛选并在引物上游和下游分别引入酶切位点XhoI和BgIII ;接下来抽取人肺癌％D细胞的DNA，利用PCR实验，通过引物扩增目的片度，常规纯化目的片度后，经XhoI和BgIII双酶切、纯化，与同样经XhoI和BgIII双酶切、纯化的真核载体进行连接；30分钟后，将连接产物转化DH5a感受态细胞，常规涂板后，放置37°培养箱培养12小时；挑选单个阳性克隆，在Amp+LB培养基中培养12小时，进行菌液PCR、酶切和测序鉴定；
[0007]步骤二、将构建成功的重组真核载体抽提，鉴定纯度和浓度后，-80C保存；常规培养人肺癌％D细胞，按5X IO4个细胞铺于24孔板中，将IOug重组载体和对照载体体外分别利用Lipofectamine2000瞬时转染细胞后，继续在5% C02，37°C条件下培养，48小时后，抽取各组细胞总RNA，利用Realtime PCR探针法检测miRNA表达水平；
[0008]步骤三、通过体外实验观察启动子表达miRNAs后的生物学效应；利用MTT实验检测各转染组中％D细胞生长的变化。
[0009]进一步,步骤一中真核载体是pGL3.0-Basic。
[0010]进一步，步骤二中miRNA 是 miR_7。
[0011]进一步,步骤二中重组真核载体是pGL3.0-Basic-miR-7-promoter。
[0012]本发明提供的的微小RNA启动子活性检测的方法可以在不依赖昂贵仪器的条件下，广泛用于分子生物学和细胞生物学实验中检测miRNAs启动子活性，方便地观察miRNAs表达后的生物学效应，检测方便并准确反映启动子活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是本发明实施例提供的微小RNA启动子活性检测的方法流程图；
[0014]图2是本发明实施例提供的表达载体构建的设计原理图；
[0015]图中:MCS、多克隆位点(Multiple clone sites) ;pA、多聚腺苷酸化信号(Polyadenylation signal) ;0r1、复制起始位点(origin ofreplication) ;Ampr、氨节西林抗性(AmpICillin resistance) !Promoter、启动子；Luc+、突光素酶基因(Luciferasegene) ;SV40、猴空泡病毒40 (Simian virus40) ；fi or1、fl卩遼菌体复制起始位点(Flphageorigin ofreplication)；
[0016]图3是本发明实施例提供的以miRNA家族成员miR_7和载体pGL3.0-Basic为例的表达载体构建示意图；
[0017]图中:MCS、多克隆位点(Multiple clone sites) ;pA、多聚腺苷酸化信号(Polyadenylation signal) ;0r1、复制起始位点(origin ofreplication) ;Ampr、氨节西林抗性(AmpICillin resistance) !Promoter、启动子；Luc+、突光素酶基因(Luciferasegene) ;SV40、猴空泡病毒40 (Simian virus40) ；fi or1、fl卩遼菌体复制起始位点(Flphageorigin of replication)；
[0018]图4是本发明实施例提供的表达载体构建过程中的PCR、酶切和测序结果；
[0019]图中:A、启动子PCR扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳；B、克隆菌液PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳；C、重组质粒双酶切；D、重组质粒测序；
[0020]图5是本发明实施例提供的表达载体转染细胞后miR-7表达水平检测示意图；
[0021]图6是本发明实施例提供的重组载体转染细胞后miR-7生物学效应检测示意图；
[0022]图中:A、光镜；B、MTT实验。
【具体实施方式】
[0023]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0024]图1示出了本发明提供的微小RNA启动子活性检测的方法的流程，为了便于说明，仅仅示出了与本发明相关的部分。下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述。
[0025]本发明提供的【具体实施方式】如下:
[0026]1.以miRNAs家族成员miR_7和载体pGL3.0-Basic为例，首先通过GeneBank获得miR-7前段5’端-1064位点到其3’端侧翼+124位点的序列，通过Primer5设计对应引物；根据pGL3.0-Basic的MCS区的酶切位点，筛选并在引物(上游和下游)分别引入酶切位点(XhoI 和 BgIII);引物序列:h游，5’ CTAGCTAGCTAGAGCACCAATAGGGAAGGG-3’:下游引物(引A BgIII 位点):5’ GAAGATCTTCGA—GTCTGCCGATGGGTGT-3?。预期产物大小，1302bp。
[0027]2.抽取人肺癌％D细胞的DNA，利用PCR实验，通过引物成功扩增目的片度(图4A)；
[0028]3.常规纯化目的片度后，经XhoI和BgIII双酶切、纯化，与同样经XhoI和BgIII双酶切、纯化的PGL3.0-Basic进行连接；
[0029]4.30分钟后，将连接产物转化DH5a感受态细胞，常规涂板后，放置37°培养箱培养12小时；
[0030]5.挑选单个阳性克隆，共6个，在Amp+LB培养基中培养12小时，进行菌液PCR鉴定，结果显示，所挑取的6个克隆均为阳性(图4B);
[0031]6.常规抽取质粒后，经酶切鉴定后，送测序。如图4C和4D显示，成功构建pGL3.0-Basic-miR-7-promoter 表达载体，命名为 p-miR-7-pro (对应的 pGL3.0-Basic 命名为 p-Cont)。
[0032]7.将质粒p-miR-7-pro大量抽提后，鉴定纯度和浓度。结果显示，0D260/280 =
1.86，浓度为 148mg/L, _80°C保存；
[0033]常规培养人肺癌9?细胞，按5X104个细胞铺于24孔板中，将IOug质粒p-miR-7-pro 和对照质粒 p-Cont (pGL3.0-Basic)体外分别利用 Lipofectamine2000 瞬时转染细胞后，继续在5% CO2, 37°C条件下培养。48小时后，抽取各组细胞总RNA，利用RealtimePCR探针法检测miR-7表达水平。
[0034]结果显示，p-miR-7-pro转染组中，miR-7表达水平明显增加(图5),提示该启动子可以启动miR-7的表达。
[0035]进一步检测了各转染组中％D细胞生长的变化。如图6显示，与p-Cont转染组相t匕，培养72小时后，p-miR-7-pro载体转染组中％D细胞的生长明显减弱(p < 0.05)，提示miR-7表达水平增加，可显著削弱肿瘤细胞体外生长，这与以往的研究报道一致。
`[0036]总之，结果表明，该启动子可以启动miR-7在真核细胞中的表达，同时，也观察到了 miR-7表达后的生物学效应。
[0037]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种微小RNA启动子活性检测的方法，其特征在于，该微小RNA启动子活性检测的方法包括以下步骤: 步骤一、首先通过GeneBank获得miRNA前段5’端-1064位点到其3’端侧翼+124位点的序列，通过Primer5设计对应引物；根据无启动子、增强子的真核载体pGL3.0-Basic的MCS区的酶切位点，筛选并在引物上游和下游分别引入酶切位点XhoI和BgIII ;接下来抽取人肺癌％D细胞的DNA，利用PCR实验，通过引物扩增目的片度，常规纯化目的片度后，经XhoI和BgIII双酶切、纯化，与同样经XhoI和BgIII双酶切、纯化的真核载体进行连接；30分钟后，将连接产物转化DH5a感受态细胞，常规涂板后，放置37°培养箱培养12小时；挑选单个阳性克隆，在Amp+LB培养基中培养12小时，进行菌液PCR、酶切和测序鉴定； 步骤二、将构建成功的重组真核载体抽提，鉴定纯度和浓度后，-80°C保存；常规培养人肺癌％D细胞，按5X IO4个细胞铺于24孔板中，将IOug重组载体和对照载体体外分别利用Lipofectamine2000瞬时转染细胞后，继续在5% C02，37°C条件下培养，48小时后，抽取各组细胞总RNA，利用Realtime PCR探针法检测miRNA表达水平； 步骤三、通过体外实验观察启动子表达miRNAs后的生物学效应；利用MTT实验检测各转染组中％D细胞生长的变化。
2.如权利要求1所述的微小RNA启动子活性检测的方法，其特征在于，步骤一中真核载体是 pGL3.0-Basic。
3.如权利要求1所述的微小RNA启动子活性检测的方法，其特征在于，步骤二中miRNA是 miR—7。
4.如权利要求1所述的微小RNA启动子活性检测的方法，其特征在于，步骤二中重组真核载体是 pGL3.0-Basic-miR-7-promotero
【文档编号】C12Q1/02GK103484544SQ201310421926
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】徐林, 周涯, 廖珍媛, 李永菊, 罗军敏 申请人:遵义医学院