一种碱性热稳定酯酶K91 Est8及其基因的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种来源于耐热芽孢杆菌（Bacillussp.）的酯酶K91Est8，本发明还提供了上述酯酶的编码基因K91Est8及其重组载体和重组菌株。本发明的酯酶具有以下性质：最适温度50℃；最适pH9.0；在37℃和50℃下保温60min，酶活分别保持在85%和40%以上；经pH9.5的硼砂-NaOH缓冲液在37℃下处理60min后，仍能保持40%以上的活性；具有良好的热稳定性和耐碱性。除乙酸-4-硝基苯酯为其最适水解底物外，还可以水解α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、4-硝基苯丁酸酯、己酸4-硝基苯酯和4-硝基苯基辛酸酯，可应用于农药残留或农药污染治理等方面。
【专利说明】—种碱性热稳定酯酶K91 Est8及其基因
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体地说是一种耐热芽孢杆菌来源的酯酶K91Est8及其基因。
【背景技术】
[0002]酯酶(esterase, EC 3.1.1.1)是一类能够催化酯键水解和形成的酶类，广泛分布于动物、植物和微生物中(Melloney J, et al., Journal of Molecular CatalysisB: Enzymatic.2005, 32: 261-270)。酯酶能够水解或者合成酰基链长度小于10的水溶性的甘油酯类，而脂肪酶一般以酰基链长度大于等于10个碳原子的甘油酯为底物，不过大多数脂肪酶也能水解酯酶的底物。大部分酯酶属于典型的α/β水解酶超家族，含有典型的GxSxG的保守序列，其中在S(serine)位点构成了一个serine-aspartate-histidine的催化三联体结构(Kakugawa S，et al., Appl Microbiol Biotechnol.2007, 74: 585 -591)。此外，还有一类酯酶序列中含有不同于传统GxSxG的保守序列、其含有独特的GDSL的保守序列，是一类新家族的酯酶。⑶SL家族的酯酶含有5段保守序列区(five consensussequence blocks I_V),在5段保守序列区中含有4个较保守的催化位点Ser, Gly, Asn和His,因此又可以分为 SGNH 亚家族酯酶(John M, et al., The Journal of BiologicalChemistry.·2013, 288: 2605-2613)。本发明的酯酶K91 Est8 属于⑶SL 酯酶家族中 SGNH亚家族酯酶。
[0003]酯酶是一种重要的工业酶类，在催化酯水解、酯合成、酯交换等过程中有重要应用价值，具有良好的区域选择性和立体选择性(Ramos Tombo, et al., Agricultural andBiological Chemistry.1987, 51: 1833-1838)。目前已从链霉菌属(Sire/--ο焊cessp.)、假单胞菌属 iPseudomonas sp.)、乳杆菌属(Xactobacillus sp.)、微球菌属{Micrococcus sp.)等微生物中克隆到酯酶基因，已经应用于食品、化工、洗漆、皮革、纸张等工业中，主要用于水解反应。此外，酯酶还被应用于制药、染料、杀虫剂和杀菌剂等工农业废水中硝基苯酚类毒性污染物的降解，在生物【技术领域】扮演着极其重要的角色(JaegerK.E, et al., Trends in Biotechnology.1998, 16(9): 396-403)。
[0004]然而，天然菌株产酶低、难以大量生产，生产成本高，限制了其推广应用，且从微生物中克隆到的酯酶也仍然较少，难以满足食品、化工等工业快速发展，以及环境可持续、健康发展的需求。此外，一般酯酶由于稳定性差，易失活，也限制了其广泛利用。嗜热及耐热菌来源的酯酶由于在高温和有机溶剂中很好的稳定性，不仅可以延长酯酶的使用时间，还能扩大其应用范围，已成为生物技术应用领域关注的焦点。因此，开发在高温环境下具有较高催化活力的酯酶应用于工业领域，有很好的前景和价值，也有利于研究酯酶的催化机制。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种碱性热稳定酯酶K91 Est8。
[0006]本发明的再一目的是提供编码上述酯酶的基因。[0007]本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0008]本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009]本发明从耐热芽孢杆菌K91基因组中克隆到酯酶基因似7 访，属于⑶SL酯酶家族中的SGNH-serine水解酶亚家族。K91 Est8与表达载体pEASY?_E2连接后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并对其酶学性质进行了初步研究，为进一步研究酯酶K91 Est8对农药的降解奠定了理论基础。
[0010]本发明所述酯酶K91 Est8可得自芽抱杆菌sf)，如Bacillus sp.ATCC 31072，K91 Est8的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]本发明的酯酶K91 Est8总共含有217个氨基酸，理论分子量为24.52kDa，包含其C端的6个HIS组氨酸标签，总分子量大小约为25.35kDa。以乙酸-4-硝基苯酯(pNPC2)S底物:最适温度50°C ;最适pH 9.0 ;在37°C和50°C下保温lh，酶活分别保持在85%和40%以上；在？117.5 - pH9.5的范围内处理Ih后，仍能保持40%以上的活性；具有很好的碱耐受性和热稳定性。
[0012]本发明提供了编码上述酯酶的基因K91 Est8,该基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0013]本发明通过PCR方法克隆了热稳定性酯酶基因似7 &访，其全长654bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA。经BLAST 比对，该酯酶基因似2 &访编码的氨基酸序列与GeneBank 中 Clostridium thermocellum ATCC27405 来源的酯酶(ΥΡ_001039529.I)具有最高的一致性，为 61% ?，与Acetivibrio cellulolyticus 来源的酯酶(WP_010243524.1)有55% 一致性；与 Streptomyces sp.PAMC26508 来源的酯酶(YP_007863706.1)有 44% 的一致性。说明碱性热稳定酯酶Κ91 EstS是一种新的酯酶。
[0014]本发明还提供了包含上述热稳定性酯酶基因似2 &访的重组载体，优选为pEASY?-E2-7 Est8。将本发明的酯酶基因与pEASY?_E2进行T-A连接，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEASY?-E2- K91 Est8。
[0015]本发明还提供了包含上述酯酶基因似2 &访的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21 (DE3)/ K91 Est8。
[0016]本发明制备酯酶K91 EstS的方法按以下步骤进行:
1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组酯酶表达；
3)回收并纯化所表达的酯酶K91Est8。
[0017]其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21 (DE3)/ K91 Est8。
[0018]本发明提供了一个新的酯酶基因，其编码的酯酶以PNPC2为底物:最适温度50°C ；最适pH 9.0 ;在37°C和50°C下保温lh，酶活分别保持在85%和40%以上；在ρΗ7.5 - pH9.5的范围内处理Ih后，仍能保持40%以上的活性；具有很好的碱耐受性和热稳定性。此外，酯酶Κ91 EstS也能够水解α -乙酸萘酯、β -乙酸萘酯、4-硝基苯丁酸酯(pNPC4)、己酸4_硝基苯酯(PNPC6)和4-硝基苯基辛酸酯(PNPC8)等；可应用于农药残留或农药污染治理方面。在高温环境下具有较高催化活力的酯酶应用于工业领域，有很好的前景和价值。
【专利附图】
【附图说明】[0019]图1:在大肠杆菌中表达的重组酯酶K91 Est8的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白质Marker ；1:BL21 (DE3)/似7 诱导后表达的总蛋白；2:纯化前的重组酯酶K91Est8 ；3:纯化后含6个HIS标签的重组酯酶K91 Est8。
[0020]图2:重组酯酶K91 Est8的最适温度。
[0021]图3:重组酯酶K91 Est8的热稳定性。
[0022]图4:重组酯酶K91 Est8的最适pH。
[0023]图5:重组酯酶K91 Est8的pH稳定性。
[0024]图6:lmM金属离子及部分化学试剂对重组酯酶K91 Est8活性的影响。
[0025]图7 =IOmM金属离子及部分化学试剂对重组酯酶K91 Est8活性的影响。
[0026]图8: 1%和5%终浓度有机溶剂对酶活的影响。
[0027]图9:重组酯酶K91 Est8以pNPC2为底物时的动力学。
【具体实施方式】
[0028]实验材料和试剂
1、菌株及载体:芽孢杆菌(也sp.)同文献报道菌种性质，如sp.ATCC31072 ;大肠杆coli BL21 (DE3)购于Novagen公司；表达载体pEASY?_E2购于全式金生物有限(TransGen)公司。
[0029]2、酶类及其它生化试剂:限制性`内切酶、DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；T4连接酶购自PiOmega公司；坚固蓝B、α -乙酸萘酯、β -乙酸萘酯、4_硝基苯丁酸酯(PNPC4),己酸4-硝基苯酯(PNPC6)和4-硝基苯基辛酸酯(PNPC8)购自Sigma公司；其它试剂均购自国药集团。
[0030]3、培养基:
LB培养基:胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化钠1%，pH自然(约为7.0)。固体培养基在此基础上加2.0% (w/v)琼脂。
[0031]说明:以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0032]实施例1:酯酶基因K91 Es访的克隆
采用天根细菌基因组提取试剂盒(DP302)提取芽孢杆菌K91基因组DNA。
[0033]根据芽孢杆菌K91全基因组测序及基因注释分析酯酶基因似2 访并设计表达引物CarF和CarR:
上游引物 CarF: 5，-GCAAATCATATTTATCTTGC - 3，
下游引物 CarR: 5’ -CCTTTCTTTG ATGATCGATT C-3’
上游引物 17: 5 ’ -TAATACGACTCACTATAGGG -3，
下游引物 17 ter: 5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’
T7和T7 ter为PCR检测阳性克隆子引物。
[0034]以耐热芽孢杆菌K91基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应参数为:95°C预变性5 min ;然后95°C变性30 sec ；57 °C退火(每个循环降0.5°C )30 sec ；72 °C延伸I min ;30个循环后95°C变性30 sec ；43 °C退火30sec ;72°C延伸I min ;7个循环后72 °C保温IOmin0取4yL PCR产物与I μ L表达载体pEASY?_E2进行T-A连接，25°C连接lOmin，连接产物全部转入Trans-1感受态细胞中，37 1:温箱过夜培养。从转化板上挑取几株单菌落，使用引物(本基因上游引物，T7ter)进行菌落PCR扩增筛选正向连接的阳性克隆子。对菌落PCR验证正确的克隆子采用T7和T7 ter引物测序，由北京华大基因测序完成。测序正确的阳性克隆子接种提取质粒pEASY?-E2-似7 &访，取0.0luL pEASY?-E2-似7 访质粒转化到100 uL BL21(DE3)表达感受态细胞中，涂布于含Amplr的LB固体平板上，37 °C温箱过夜培养，从转化板上挑取几株单菌落，进行菌落PCR扩增筛选阳性克隆子，从而获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/似7 Est8。
[0035]实施例2:重组酯酶K91 Est8的制备
取含有重组质粒pEASY?-E2-似7 Est8的BL21 (DE3)菌株和只含有pEASY?_E2的空质第LBL210E3)菌株，以0.1%的接种量接种于LB (含100 ug/mL Amplr)培养液中，37 °C快速振荡16 h。然后将此活化的菌液以1%接种量接种到新鲜的LB (含100ug/mL Amplr)培养液中，快速振荡培养约2 - 3 h(OD6tltl达到0.4-0.7)后，加入终浓度0.7 mM的IPTG进行诱导，于20°C继续振荡培养约20 h。12000 rpm离心10 min，收集菌体。用适量的pH 7.0柠檬酸-Na2HPO4缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经12, 000 rpm离心10 min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组酯酶在大肠杆菌中得到了表达，经Nickel-NTA Agarose纯化后为单一条带。
[0036]实施例3:纯化的重组酯酶K91 Est8的性质测定 1、重组酯酶K91 Est8的活性分析
纯化的重组酯酶K91 Est8采用对硝基苯酹法(/7-nitrophenol)进行活性测定:取4只
·1.5mL离心管,分别编号1、2、3、4，其中1、2、3号试管为实验组(3个重复),4号为对照组。向四只离心管中分别加入420 μ L ρΗ8.0的50mM Tris-HCL缓冲液和30 μ L IOmM底物pNPC2,37°C预热5min后，每隔IOs分别向1、2和3号管中加入50 μ L稀释适当倍数的酶液，4号对照管加等量水，37°C反应5min后每隔IOs向1、2、3实验管中加入50 μ L 0.1M Na2CO3终止反应，4号对照管同样加入等体积终止液后立即将4只离心管插到冰上，酶标仪405nm读取OD值。I个酶活单位(U/mL)定义为一定条件下，每分钟分解底物PNPC2生成I μ moL对硝基苯酚所需要的酶量。以pNPC4、pNPC6、pNPC8、α -乙酸萘酯和β -乙酸萘酯为底物测定方法及酶活力计算同PNPC2。
[0037]2、重组酯酶Κ91 Est8的最适温度和热稳定性的测定
酶的最适温度测定:将重组酯酶K91 Est8在50mM pH9.0的Tris-HCL缓冲液条件下，分别在 20 0C >30 °C、37°C、40 °C >45 °C >50 °C、55°C、60 °C、70°C、80°C、90°C、95°C下进行酶促反应。温度稳定性的测定:将重组酯酶K91 Est8在50mM pH9.0的Tris-HCL缓冲液条件下,在37°C、50°C和60°C三个温度下分别保温5min、10 min,20 min,30 min和60 min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以PNPC2为底物，反应5 min,测定重组酯酶K91Est8的酶学性质。结果表明:K91 Est8的最适温度50°C，但此酶在37°C时也具有80%以上的活性(图2) ；37 °C下保温Ih后，酶活性保持在85%以上，50°C和60°C保温lh，酶活仍保持在35%以上(图3)。
[0038]3、重组酯酶K91 Est8的最适pH和pH稳定性的测定酶的最适pH的测定:将酯酶K91 Est8在37°C，分别在1/15 mo I/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液不同 ρΗ6.5、7.0、7.5 ；50mM Tris-HCL 缓冲液不同 ρΗ7.5、8.5、8.8、9.0、9.3、9.5 ；50mM硼砂-NaOH缓冲液不同pH9.5、10.0、11.0、12.0条件下进行酶促反应。pH稳定性的测定:将重组酯酶K91 Est8用ρΗ2.0、4.0、5.0的0.1M柠檬酸-Na2HPO4缓冲液；ρΗ6.5、
7.0,7.5 的 1/15 mo I/L 磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液；pH7.5,8.5,8.8,9.0,9.3,9.5 的50mM Tris-HCL缓冲液；pH9.5,10.0,11.0,12.0的50mM硼砂-NaOH缓冲液稀释适当倍数后分别在37°C下耐受60 min后进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPC2为底物，反应5 min，测定纯化的重组酯酶K91 Est8的酶学性质。结果表明:K91 Est8的最适pH为9.0 (图 4) #5ρΗ7.5、8.5、8.8、9.0、9.3、9.5 的 50mM Tris-HCL 缓冲液；ρΗ9.5 硼砂-NaOH缓冲液37°C条件下处理60min后仍然保持40%以上的活性(图5)，说明重组酯酶K91 EstS具有很好的碱耐受性。
[0039]4、不同金属离子及化学试剂对重组酯酶K91 Est8活性的影响
在酶促反应体系中加入终浓度I mM和10 mM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。以PNPC2为底物，在50°C，pH9.0条件下，反应5 min，测定纯化的重组酯酶K91Est8的酶活力。结果(图6)表明，终浓度I mM的金属离子Co2+、K1+、Na1+、Al3+、Li2+、Ba2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、终浓度I mM化学试剂EDTA、CTAB, urea、终浓度1%的有机溶剂Tween-80、TritonX-100、ethanol、cyclohexane、n-hexane、isopropanol 和终浓度 5% 的 Tween-80 对酶有较强的激活作用；Fe3+对酶有轻微的促进作用；1 mM的Ni2+、Mn2+、Fe2+、Ag+、DTT、SDS’终浓度 10 mM 的 K1+、Na1+、Li2+、Mg2+、Ni2+、SDS、urea，终浓度 1% 的 DMS0、methanol 和终浓度5% 的 DMS0、methanol、ethanol、cyclohexane、isopropanol 对酶有一定的抑制作用；10 mM的Hg2+、CTAB、DTT和终浓度5%的TritonX-100、n-propanol对酶有较强的抑制作用(图7);ImM 的 Mg2+、Hg2+、urea, 10 mM 的 EDTA, 1% 的 n_propanol、5% 的 n-hexane、n-propanol 对酶几乎无影响(图8)。
.[0040]5、重组酯酶K91 Est8的动力学参数的测定
在50°C，pH9.0条件下，以PNPC2为底物，依次在酶促反应的1_10 min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用0.1mM-L 2mM的PNPC2为底物([S])，在50°C，pH9.0和一级反应时间下测定酶活，计算出相应的反应速度(V )，如图9,根据Lineweaver-Burk方法测定心?和Vmax0经测定，在50°C，pH9.0条件下，重组酯酶K91 Est8对乙酸_4_硝基苯酯(pNPC2)的心?和Vmax 分别为 0.1882mM 和 117.647U/mg。
[0041]6、重组酯酶 K91 Est8 对底物 pNPC2、pNPC4、pNPC6、pNPC8 水解
在 50°C，ρΗ9.0 条件下，重组酯酶 Κ91 Est8 对 IOmM 的 pNPC2、pNPC4、pNPC6、pNPC8 的比活力分别为 45.382U/mg、l.317U/mg、0.131U/mg、0.033U/mg。
【权利要求】
1.一种碱性热稳定酯酶K91 Est8，其特征在于:它具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
2.—种编码权利要求1所述的酯酶基因似2 &访，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
3.一种包含权利要求2所述酯酶基因似7 的重组载体。
4.一种包含权利 要求2所述酯酶基因似7 的重组菌株。
【文档编号】C12N1/19GK103436506SQ201310426998
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】黄遵锡, 丁俊美, 于婷婷, 谢振荣, 李俊俊, 周峻沛 申请人:云南师范大学