一种基因工程菌及其生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法
【专利摘要】一种基因工程菌及其生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，是用来自吸水链霉菌CCTCC?M203062的谷氨酰胺转胺酶酶原，构建重组表达载体pINA1297-proTG，并将其转化解脂耶氏酵母得到基因工程菌，并用基因工程菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。本申请构建的基因工程菌具有谷氨酰胺转胺酶酶原表达量高的优点，适于在工业生产中应用。
【专利说明】一种基因工程菌及其生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因工程菌及其生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，属于酶工程【技术领域】。
技术背景
[0002]微生物谷氨酞胺转胺酶(TransglutaminaseEC2.3.2.13 全称 R-glutaminyl-peptide: amine- Y -glutayle-transferase简称TGase),能够催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的Y-羧酰胺基与各种酰基受体发生酰胺基转移反应，形成ε-(Υ-谷氨酰基)赖氨酸共价键，引起蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酞胺基的水解。目前，链霉菌TGase已广泛用于食品工业，适量添加TGase可显著改善各类食品蛋白质的功能性质和营养价值，应用范围包括肉制品、水产品、乳制品、植物蛋白制品等。此外，TGase在一些非食品工业领域也具有较大的应用前景，如组织工程、纺织工业及生物学研究等。然而，依靠优势菌种选育和过程优化的传统发酵技术对TGase产量的提高已十分有限，远不能满足市场需求。
[0003]在前期研究中，本研究室筛选出一株产谷氨酰胺转胺酶(简称TGase)的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062),通过基因克隆方法，得到了MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子(Genebank:EU477523),并实现了 MTG和其酶原区在大肠杆菌中的高效表达(Liu S，Zhang D, Wang M, Cui W，ChenK, Liu Y, Du G, Chen J, Zhou Z (2011)The pro-region of Streptomyces hygroscopicustransglutaminase affects its secretion by Escherichia col1.FEMS MicrobiolLett324(2):98-105)。`
[0004]解脂耶氏酵母于1942年首次被分离得到，先后被命名为Candida lipolytica、Endomycopsis lipolytica、 Saccharomycopsis lipolytica,最终定名为 Yarrowialipolytica(解脂耶氏酵母)。解脂耶氏酵母是研究的最广泛的非常规酵母之一，曾相继用于工业化规模生产单细胞蛋白、柠檬酸。由于它具有很强的分泌蛋白的能力，因此是一种很有潜力的表达异源蛋白的宿主生物。由于强有力的基因扩增系统的发展，逆转录转座子的发现，调控型和组成型的强启动子的鉴定，近年来解脂耶氏酵母作为异源蛋白表达宿主的研究进展很快，迄今已有42个异源蛋白在解脂耶氏酵母中得到了表达，而且大多数蛋白的表达都能达到晕克/升。
【发明内容】
[0005]为解决上述技术问题，本发明提供了一种高效表达谷氨酰胺转胺酶酶原的基因工程菌，是用来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus) CCTCC M203062的谷氨酰胺转胺酶酶原(proTG)，构建重组表达载体pINA1297-proTG，并将其转化解脂耶氏酵母 Yarrowia lipolytica WSH-Z06,得到基因工程菌 pINA1297_proTG/Y.lipolyticaWSH-Z06。[0006]本发明所使用菌种为解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica WSH-Z06,来源于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M207143。
[0007]本发明还提供了一种利用上述重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，步骤如下:
[0008]1)扩增得到谷氨酰胺转胺酶酶原(proTG)的PCR产物；
[0009]2)将回收的proTG的PCR产物片段和质粒pINA1297分别进行SfiI单酶切，然后加入KpnI酶切，酶切片段进行柱回收，酶切质粒PINA1297进行胶回收，将二者连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子；
[0010]3)将经验证构建成功的重组质粒pINA1297-proTG用NotI线性化，胶回收片段转化至解脂耶氏酵母；
[0011]4)利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。
[0012]proTG可扩增自本实验室前期构建载体pET22b(+)/proTG (已发表文章)或根据Genebank:EU477523相关信息人工合成。
[0013]具体而言，重组菌株构建方法如下:
[0014](l)proTG 引物设计
[0015]根据pET22b(+)/proTG基因序列设计proTG基因的PCR引物Pl和P2。
[0016]Pl:5’ -TTGGGCCGTTCTGGCC GCCAGCGGCGGCGACG-3’ (SfiI)
[0017]P2:5 ’ -CGCGGATCCTTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3’ (BamHI)
[0018](2)重组表达载体pINA1297_proTG的构建
[0019]利用引物Pl，2，以pET22b(+)/proTG质粒为模板，扩增得到proTG的PCR产物，按照Fermentas的胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，将回收到的片段和质粒pINA1297分别进行SfiI单酶切，50°C，lh，然后加入KpnI酶切，37°C，45min后，酶切片段进行柱回收，酶切质粒PINA1297进行胶回收，将二者按一定比例连接过夜，转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经SfiI单酶切，50°C, Ih,再经KpnI酶切，37°C，45min，释放出大小为5.2kb和1.1kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为P INA1297-proTG。
[0020](3)重组质粒 P INAl297_proTG 转化菌株 Y.lipolytica WSH-Z06
[0021]将经验证构建成功的重组质粒P INA1297-proTG用NotI线性化，胶回收片段转化至菌株Y.lipolytica WSH-Z06中。转化方法为醋酸锂法。
[0022](4)转化子基因组插入片段检测
[0023]挑取YNB平板上单菌落接种于YPD液体培养基中，提取菌株的基因组DNA，具体操作步骤按照天根提酵母基因组试剂盒说明书进行。以Pl，2为引物，基因组DNA为模板，进行PCR验证。
[0024]本发明所用到的培养基:
[0025]LB 培养基:胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaC110g/L，ρΗ7.0 ；
[0026]YPD培养基:葡萄糖2.0g，蛋白胨2.0g,酵母菌粉1.0g,溶于100.0ml蒸馏水中，固体培养基另加入琼脂2.0g。
[0027]YNB培养基YNB-N5wtl (w/v):0.17%酵母提取物(不含氨基酸与硫酸盐)，葡萄糖
.1.0%，硫酸铵0.5%。其中葡萄糖单独灭菌，然后充分混合。固体培养基需要加入2.0%的琼脂粉。
[0028]PPB 培养基(w/v):蔗糖 2.0%,酵母菌粉 0.132%, NH4C10.132%, KH2PO4 0.032%,MgSO4.7H20 0.024%，硫胺素0.33mg/ml，溶于终浓度为0.02M的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(ρΗ6.0)中。
[0029]pro-TGase 的活化:
[0030]取100 μ L含重组pro-TGase的发酵上清与0.6 μ L的蛋白酶K(20mg/mL)溶液混合均匀，37 °C恒温15min。
[0031]本发明中谷氨酰胺转胺酶活力的测定:
[0032]比色法测定酶活:以N- a -CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-Y单羟胺酸做标准曲线。I个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为:37°C时每分钟催化形成lymol L-谷氨酸-Y单羟胺酸的酶量(U/mL)。
[0033]试剂A:1OOmg 的 N a -CBZ-GLN-GLY 溶解于 2mL0.2moL/L 的 NaOH 溶液中，加入0.2mol/L pH6.0 的 Tris-HC 缓冲液 4mL，0.lmol/L 羟胺 2mL，0.01mol/L 的还原型谷胱甘肽2mL,并调节pH至6.0。
[0034]试剂B:3mol/L 的 HCL，12%TCA, 5%FeCL3 按 1:1:1 混合。
[0035]配制0-4 μ mol/mL的L-谷氨酸-Y -单异羟肟酸标准溶液。取ImL试剂A与0.4mL不同浓度的L-谷氨酸-Y -单异羟肟酸标准溶液混合，37°C水浴10分钟。加0.4mL试剂B终止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以0.4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100°C加热10分钟的离心后的上清液为空白。酶活力(u/mL) = (6.8548X0D525-0.0164) X 稀释倍数
[0036]本发明的优点和积极效果是:
[0037](I)本发明探索了吸水链霉菌来源的微生物谷氨酰胺转胺酶酶原基因在Y.lipolytica WSH-Z06中的表达，构建了高产微生物谷氨酰胺转胺酶酶原的基因工程菌株，适用于工业化的生产和应用，具有一定的理论价值和应用价值。
[0038](2)本发明探索微生物谷氨酰胺转胺酶酶原基因工程菌构建的可操作对象，所构建的工程菌采用Y.lipolytica WSH-Z06发酵培养基，发酵所产生的酶活达到2.0U/mL。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1基因工程菌构建图。
[0040]图2重组表达载体pINA1297_proTG的双酶切验证；
[0041](1:Maker，2 和 3:质粒 pINA1297_proTG 分别经过 Sfi 1.BamH I 酶切后的片段)。
[0042]图3以酵母转化子基因组为模板的PCR电泳图；
[0043](1:转化子 Y.l-pINA1297-proTGl,2:转化子 Y.l-pINA1297-proTG2, 3:转化子Y.l-pINA1297-proTG3，4:转化子 Y.l-pINA1297_proTG4，5:以质粒 pINA1297_proTG 为模板，6:Maker)0
【具体实施方式】
[0044]实施例1:proTG引物设计
[0045]根据pET22b(+)/proTG基因序列设计proTG基因的PCR引物Pl和P2。[0046]Pl:5’ -TTGGGCCGTTCTGGCC GCCAGCGGCGGCGACG-3’ (SfiI)
[0047]P2:5’ -CGCGGATCC TTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3’ (BamHI)
[0048]实施例2:proTG基因的克隆
[0049]利用引物Pl，2，以pET22b(+)/proTG质粒为模板，扩增条件为:95°C预变性，5min，一个循环；95°C变性，308，581:退火，308，721:延伸，808，34个循环；72°C，lOmin，一个循环；12°C，10min，一个循环。PCR 扩增体系:5XPCR buffer (Mg2+Plus) 10 μ L, dNTP Mix4 μ L,模板I μ L,上下游引物各0.1 μ L,灭菌的双蒸水35 μ L, Prime Star DNA聚合酶0.5 μ L0采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，_20°C冰箱保存备用。
[0050]实施例3:重组表达载体pINA1297-proTG的构建
[0051]将回收到的片段和质粒PINA1297分别进行SfiI单酶切，50°C，lh，然后加入BamHI酶切，37°C，45min后，酶切片段进行柱回收，酶切质粒pINA 1297进行胶回收，将二者按一定比例连接过夜，转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经SfiI单酶切，50°C，Ih,再经BamHI酶切，37°C，45min，释放出大小为5.2kb和1.1kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为P INA1297-proTG。实施例 4:重组质粒 p INA1297_proTG 转化菌株 Y.lipolytica WSH-Z06
[0052]将经验证构建成功的重组质粒P INA1297-proTG用NotI线性化，胶回收片段转化至菌株Y.lipolytica WSH-Z06中。转化方法为醋酸锂法。转化步骤如下:
[0053](I)菌株Y.lipolytica WSH-Z06在YPD固体培养基上划线，28°C培养2d ；
[0054](2)挑一环单菌落溶于ImlTE中，1000Orpm, Imin,去上清；
[0055](3)加入600 μ 10.lmol/L ρΗ6.0醋酸锂LiAc，28°C水浴lh，注意不要晃动样品；水浴结束后，3000rpm下离心2min,弃上清；
[0056](4)轻轻将菌体重新悬浮于80.0 μ 10.lmol/1的醋酸锂(ρΗ6.0)中；
[0057]至此，酵母菌感受态细胞制备完成。
[0058](5)取40.0 μ I上述酵母菌感受态，加入2.0 μ I单链鱼精DNA和3.0 μ I经NotI线性化的DNA片段；28°C水浴15min，注意水浴过程中不要晃动样品；
[0059](6)上述样品中加入 350.0 μ 140% (w/v)的 PEG4000 (溶于 0.lmol/1 ρΗ6.0 乙酸锂中)与16.0μ llmol/Ι的DDT ;28°C水浴lh，注意不要晃动样品；
[0060](7)逐滴加入40.0μ I DMS0，轻轻混匀，然后置于39°C水浴中热休克IOmin ；
[0061](8)向上述样品中加入600.0 μ 10.lmol/1的醋酸锂(ρΗ6.0)，轻轻晃动混匀；
[0062](9)将酵母菌悬液稀释成不同浓度涂布YNB平板，28°C培养5d，得到单菌落。
[0063]实施例5:转化子基因组插入片段检测
[0064]挑取YNB平板上单菌落接种于25mL YPD液体培养基中，28 V，200rpm,培养24h，取500 μ I菌液于装有500 μ I灭过菌的甘油管中，甘油的终浓度为(ν/ν) 18%,，-80°C冰箱保藏备用。同时取菌液少许，用于提取菌株的基因组D`NA，具体操作步骤按照天根提酵母基因组试剂盒说明书进行。以Pl，2为引物，基因组DNA为模板，进行PCR验证。扩增程序与实例2中的相同。将获得的阳性转化子命名为Y.l-pINA1297-proTG。
[0065]实施例6:重组菌Y.l-pINA1297-proTG发酵培养，酶活测定。
[0066]取保存于甘油管中的阳性菌Y.l-pINA1297-proTG100y I接于25mL YI3D液体培养基中，28°C，200rpm，培养18h，然后按10%的转接量接于25mL PPB液体培养基中，28°C，200rpm，分别在发酵第4天、第5天、第6天取样测酶活。酶活结果如表1。
[0067]表1重组菌Y.l-pINA1297-proKexTG发酵上清活化后酶活
[0068]
【权利要求】
1.一种高效表达谷氨酰胺转胺酶酶原的基因工程菌，其特征在于，用来自吸水链霉菌CCTCC M203062的谷氨酰胺转胺酶酶原，构建重组表达载体pINA1297-proTG，并将其转化解脂耶氏酵母，得到基因工程菌pINA1297-proTG/Y.1ipolytica WSH-Z06。
2.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酰胺转胺酶酶原扩增自载体 pET22b (+) /proTG 或根据 Genebank:EU477523 合成。
3.一种发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原的方法，其特征在于，用来自吸水链霉菌CCTCCM203062的谷氨酰胺转胺酶酶原，构建重组表达载体pINA1297-proTG，并将其转化解脂耶氏酵母得到重组菌，利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤如下: 1)将谷氨酰胺转胺酶酶原基因和质粒PINA1297分别进行SfiI单酶切，然后加入KpnI酶切，酶切片段进行柱回收，酶切质粒PINA1297进行胶回收，将二者连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子； 2)将经验证构建成功的重组质粒pINA1297-proTG用NotI线性化，胶回收片段转化至解脂耶氏酵母得到重组菌； 3)利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤如下: 1)扩增得到谷氨酰胺转胺酶酶原的PCR产物； 2)将回收的谷氨酰胺转胺酶酶原的PCR产物片段和质粒pINA1297分别进行SfiI单酶切，然后加入KpnI酶切，酶切片段进`行柱回收，酶切质粒pINA1297进行胶回收，将二者连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子； 3)将经验证构建成功的重组质粒pINA1297-proTG用NotI线性化，胶回收片段转化至解脂耶氏酵母得到重组菌； 4)利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述谷氨酰胺转胺酶酶原扩增自载体pET22b (+)/proTGο
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述谷氨酰胺转胺酶酶原扩增引物为:
Pl:5’ -TTGGGCCGTTCTGGCC GCCAGCGGCGGCGACG-3’
P2:5’ -CGCGGATCC TTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3’。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)谷氨酰胺转胺酶酶原引物设计 根据pET22b (+)/proTG基因序列设计谷氨酰胺转胺酶酶原基因的PCR引物Pl和P2
Pl:5’ -TTGGGCCGTTCTGGCC GCCAGCGGCGGCGACG-3’
P2:5’ -CGCGGATCC TTACGACCAGCCCTGCTTCACCTC-3J ； 2)重组表达载体pINA1297-proTG的构建 利用引物Pl，P2，以pET22b(+)/pix)TG质粒为模板，扩增得到谷氨酰胺转胺酶酶原的PCR产物，按照胶回收试剂盒说明书回收PCR产物，将回收到的片段和质粒PINAl297分别进行SfiI单酶切，50°C，lh，然后加入KpnI酶切，37°C，45min后，酶切片段进行柱回收，酶切质粒PINA1297进行胶回收，将二者按一定比例连接过夜，转化E.coli JM109感受态细胞，使用卡那霉素抗性平板筛选阳性转化子，提取转化子质粒，重组质粒经SfiI单酶切，50°C，Ih,再经KpnI酶切，37°C，45min，释放出大小为5.2kb和1.1kb的基因片段，证明重组质粒构建成功，重组质粒命名为P INA1297-proTG ； 3)重组质粒PINA1297-proTG转化解脂耶氏酵母 将经验证构建成功的重组质粒P INA1297-proTG用NotI线性化，胶回收片段转化至解脂耶氏酵母中； 4)转化子基因组插入片段检测 挑取YNB平板上解脂耶氏酵母单菌落接种于YPD液体培养基中，提取菌株的基因组DNA，具体操作步骤按照天根提酵母基因组试剂盒说明书进行，以P1，P2为引物，基因组DNA为模板，进行PCR验证； 5)利用重组菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶酶原。
【文档编号】C12R1/645GK103497904SQ201310428446
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】陈坚, 堵国成, 王淼, 刘松, 万丹 申请人:江南大学