Myb28的遗传标志物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于确定十字花科蔬菜植物的基因型以获得具有增加的硫代葡萄糖苷水平的植物的方法，包括从所述植物或其部分获得核酸样品并在所述核酸样品中检测与增加的硫代葡萄糖苷水平遗传关联的Myb28基因座处的多态性。该多态性可包括以下至少一种：a)在对应于SEQ?ID?NO：1的核苷酸83、136、226、563、610、830、995、1116、1513、1577、1606、1620、1825、1863、1877或2026的位置处的单核苷酸多态性(SNP)或b)在SEQ?ID?NO：1的核苷酸323和332之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的核苷酸数目的多态性或c)在SEQ?ID?NO：1的核苷酸836和837之间、核苷酸867和868之间或核苷酸943和944之间存在的核苷酸数目的多态性。
【专利说明】Myb28的遗传标志物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2012年9月13日提交的美国临时申请61 / 700，731号的利益，该申请通过引用全文并入。
[0003]序列表的并入
[0004]包含在微软视窗操作系统中测量的21kb的名称为“SEMB009US_ST25”的文件中和于2012年9月12日生成的序列表在此电子提交并通过引用并入。
【技术领域】
[0005]本发明涉及与赋予增加的硫代葡萄糖苷水平的转录因子Myb28基因座密切关联的分子标志物的鉴定，及用于产生具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜植物的方法。
【背景技术】
[0006]十字花科蔬菜植物(例如芸苔属(Brassica)植物,如花椰菜)积聚4_甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖 苷(萝卜硫苷)和3-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(屈曲花苷)。这些硫代葡萄糖苷水解成异硫氰酸盐。流行病学研究使富含十字花科蔬菜的饮食与癌症风险的降低相关联。高硫代葡萄糖苷的十字花科蔬菜(例如，高硫代葡萄糖苷的花椰菜)已经如W099 / 52345和PCT / GB2009 / 001648中所述产生。硫代葡萄糖苷在十字花科蔬菜植物中的产生是复杂的，如可从图4中所示的植物中硫通量的图中看到的。在本发明之前，甲基硫代烷基苹果酸合酶(methylthioalkylmalate synthase) (MAM)代谢或分子标志物用于育种计划中。已知MAMl和MAM3与高硫代葡萄糖苷性状密切相关。
[0007]本发明人令人惊异地观察到一些具有高硫代葡萄糖苷(例如，萝卜硫苷)表型的芸苔属栽培种尽管与该性状相关，但不具有MAM标志物等位基因，因此得出结论，MAM标志物并不必然与高硫代葡萄糖苷特性密切关联或对于高硫代葡萄糖苷特性是关键的，且因此其在育种中用作标志物对于追踪这一性状并不是可靠的。
[0008]因此本发明人寻找到高硫代葡萄糖苷的标志物，其可以可靠地和一致地用于确定具有增加的硫代葡萄糖苷水平的植物的基因型。
[0009]发明简沭
[0010]本发明的基本发现是转录因子Myb28基因座是十字花科蔬菜植物(如芸苔属植物，例如花椰菜)中产生增加水平的硫代葡萄糖苷(特别是4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(萝卜硫苷))和3-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(屈曲花苷))的关键基因座。
[0011]本发明人首次证明在高硫代葡萄糖苷十字花科蔬菜植物(例如甘蓝麦(Brassicavillosa))和不显示高硫代葡萄糖苷表型的十字花科蔬菜植物(例如甘蓝(Brassicaoleracea))之间的转录因子Myb28基因座中可以观察到多态性，且这些多态性可以用作用于确定十字花科蔬菜植物(如芸苔属植物，例如花椰菜)的改变(例如增加)的硫代葡萄糖苷水平的分子标志物和/或用于具有改变(例如增加)的硫代葡萄糖苷水平的植物的标志物辅助育种。
[0012]在本发明的第一方面，提供了一种用于确定具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜植物的基因型的方法，包括从所述植物或其部分获得核酸样品并在所述核酸样品中检测与增加的硫代匍萄糖昔水平遗传关联的Myb28基因座处的多态性。
[0013]本发明的进一步的方面提供了一种用于产生具有Myb28_介导的增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜植物的方法，该方法包括选择包含与增加的硫代葡萄糖苷水平遗传关联的Myb28基因座处的多态性的第一后代植物。
[0014]在再进一步的方面，本发明提供了通过本发明的方法产生的植物或其部分(例如，花序)。
[0015]本发明进一步提供了本发明的植物的种子或通过本发明的方法产生的植物的种子。
[0016]在进一步的方面，本发明提供一种分离的核酸，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ IDN0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:1U SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:2U SEQID NO:22 和 SEQ ID NO:23 的序列。
[0017]在另一个方面，本发明提供一种引物或探针，其扩增和/或杂交在对应于SEQ IDNO:1 的核苷酸 8 3、136、226、563、610、830、995、1116、1513、1577、1606、1620、1825、1863、1877或2026的位置处的至少一个多态性；或扩增和/或杂交在对应于SEQ ID NO:1的核苷酸323和332的位置之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、核苷酸1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的多态性；或扩增和/或杂交在SEQ ID NO:1的核苷酸836和837之间、核苷酸867和868之间或核苷酸943和944之间存在的多态性。
[0018]在某些实施方式中，检测或选择的步骤包括PCR和/或DNA杂交。
[0019]在一些实施方式中，确定基因型包括共显性分析。
[0020]在一个实施方式中，筛选方法包括检测共显性遗传标志物。
[0021]在一个实施方式中，多态性包括以下至少一种:
[0022]a.在对应于 SEQ ID NO:1 的核苷酸 83、136、226、563、610、830、995、1116、1513、1577、1606、1620、1825、1863、1877或2026的位置处的单核苷酸多态性(SNP)，或
[0023]b.在SEQ ID NO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、核苷酸1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的核苷酸数目的多态性，或
[0024]c.在SEQ ID NO:1的核苷酸836和837之间、核苷酸867和868之间或核苷酸943和944之间存在的核苷酸数目的多态性。
[0025]在一个实施方式中，所述多态性包括在对应于SEQ ID NO:1的核苷酸83、136、226、563、610、830、995、1116、1513、1577、1606、1620、1825、1863、1877 或 2026 或其组合的
位置处的单核苷酸多态性(SNP)的至少一种。
[0026]在另一个实施方式中，所述多态性包括在SEQ ID NO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的一个或多个核苷酸的缺失。
[0027]在另一个实施方式中，所述多态性包括在SEQ ID NO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的两个或更多个核苷酸的缺失。
[0028]在另一个实施方式中，所述多态性包括在SEQ ID NO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸909和914之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的三个或更多个
核苷酸的缺失。
[0029]在另一个实施方式中，所述多态性包括在SEQ ID NO:1的核苷酸323和332之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的四个或更多个(例如，5个或更多个，6个或更多个，或者7或更多个)核苷酸的缺失。
[0030]在另一个实施方式中，所述多态性包括在SEQ ID NO:1的1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的八个或更多个核苷酸的缺失。
[0031]在另一个实施方式中，所述多态性包括在SEQ ID NO:1的核苷酸323和332之间存在的所有核苷酸、或核苷酸521和524之间存在的所有核苷酸、或核苷酸783和786之间存在的所有核苷酸、或核苷酸909和914之间存在的所有核苷酸、或核苷酸1365和1369之间存在的所有核苷酸、或1811和1821之间存在的所有核苷酸或核苷酸2046和2056之间存在的所有核苷酸的缺失。
[0032]在另一个实施方式中，所述多态性包括在SEQ ID NO:1的核苷酸323和332之间存在的至少一个核苷酸 、或核苷酸521和524之间存在的至少一个核苷酸、或核苷酸783和786之间存在的至少一个核苷酸、或核苷酸909和914之间存在的至少一个核苷酸、或核苷酸1365和1369之间存在的至少一个核苷酸、或1811和1821之间存在的至少一个核苷酸、或核苷酸2046和2056之间存在的至少一个核苷酸或其组合的缺失。
[0033]在进一步的实施方式中，所述多态性包括对应于SEQ ID NO:1的核苷酸324、325、326、327、328、329、330、331、522、523、784、785、910、911、912、913、1366、1367、1368、1812、1813、1814、1815、1816、1817、1818、1819、1820、2047、2048、2049、2050、2051、2052、2053、2054或2055的位置处至少一个核苷酸的缺失。
[0034]在一个实施方式中，所述多态性包括以下位置处核苷酸的缺失:SEQ ID N0:1的324-331、522-523、784-785、910-913、1366-1368、1812-1820 或 2047-2055 或其组合。
[0035]在一个实施方式中，所述多态性包括SEQ ID NO:1的核苷酸836和837之间、867和868之间或943和944之间一个或多个核苷酸的插入。
[0036]当所述多态性是核苷酸836和837之间一个或多个核苷酸的插入时，该插入适当地是两个核苷酸的插入。当在核苷酸836和837之间插入两个核苷酸时，该核苷酸适当地可以是TT。
[0037]当所述多态性是核苷酸867和868之间一个或多个核苷酸的插入时，该插入适当地是一个核苷酸的插入。当在核苷酸836和837之间插入一个核苷酸时,该核苷酸适当地可以是A。
[0038]当所述多态性是核苷酸943和944之间一个或多个核苷酸的插入时，该插入适当地是最多13个核苷酸和包括13个核苷酸的插入。当在核苷酸943和944之间插入13个核苷酸时，该核苷酸适当地可以是TATTAAAAAAGTA (SEQ ID NO:25)。[0039]在一些实施方式中，所述多态性是以下多态性中的一种以上(适当地2种以上，适当地3种以上，适当地4种以上，适当地5种以上或适当地全部):
[0040]a.在对应于 SEQ ID NO:1 的核苷酸 83、136、226、563、610、830、995、1116、1513、1577、1606、1620、1825、1863、1877或2026的位置处的单核苷酸多态性(SNP)，或
[0041]b.在SEQ ID NO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的核苷酸数目的多态性，或
[0042]c.在SEQ ID NO:1的核苷酸836和837之间、核苷酸867和868之间或核苷酸943和944之间存在的核苷酸数目的多态性。
[0043]在特定的实施方式中，所述多态性通过包括使用选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:1U SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23的至少第一序列的筛选方法来检测。
[0044]在一个实施方式中，产生十字花科蔬菜植物的方法包括以下步骤:(a)使具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜植物与第二十字花科蔬菜植物杂交；和(b)选择包含与增加硫代葡萄糖苷水平遗传关联的Myb28基因座处的多态性的至少第一子代十字花科蔬菜植物。
[0045]在一个实施方式中，选择第一后代包括基于一种或多种来自与至少第一附加性状遗传关联的第二十字花科蔬菜植物的遗传标志物的存在选择所述后代。在该方法的进一步的实施方式中，所述附加性状可以选自产量、疾病抗性、突出体活力(emergence vigour)、生长性活力、应激耐受性、植物高度、花序质量、花序直径、花序重量、花序大小、花序形状、花序颜色和开花天数。
[0046]在一个实施方式中，产生具有Myb28_介导的增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜的方法可以进一步包括步骤(C)使所述后代植物与其自身或第三植物杂交以产生后续世代的后代植物，且可以进一步包括以下步骤:(d)使所述后续世代的后代植物与其自身或第二植物杂交；和(e)重复步骤(C)和(d)另外3-10个世代以产生包含增加的硫代葡萄糖苷水平的近交的十字花科蔬菜植物，其中筛选至少一个后续世代的后代植物作为与硫代匍萄糖昔广生遗传关联的Myb28基因座处多态性的存在。在一个实施方式中，基于硫代葡萄糖苷和所需性状的存在选择后续世代的后代植物用于杂交。在该方法中，步骤(e)以足够的近交进行重复以获得包括增加的硫代葡萄糖苷性状并另外包括第二花椰菜植物的农学性状的近交十字花科蔬菜植物。
[0047]在特定的实施方式中，本发明的方法可以进一步包括分析增加的硫代葡萄糖苷水平的花椰菜植物的表型。
[0048]在本发明的一个优选的实施方式，硫代葡萄糖苷是4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)。
[0049]在一个优选的 实施方式，十字花科蔬菜植物(例如，芸苔属植物，如花椰菜)包含至少10微摩尔/ g干重的量的至少一种硫代葡萄糖苷。
[0050]在一个实施方式，十字花科蔬菜植物包含至少10微摩尔/ g干重的量的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)、3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP)或其组合。
[0051]在一个实施方式，十字花科蔬菜植物包含至少10微摩尔/ g干重的量的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)。
[0052]在一个实施方式，术语“具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜植物”是指包含至少10微摩尔/g干重的量的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)、3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP)或其组合的十字花科蔬菜植物。
[0053]在一个实施方式，术语“具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜植物”是指包含至少10微摩尔/ g干重的量的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)的十字花科蔬菜植物。
[0054]在一个实施方式，根据本发明的十字花科蔬菜植物是芸苔属植物。
[0055]在一个实施方式,根据本发明的十字花科蔬菜植物是花椰菜。
[0056]在再另一个实施方式中，本发明提供包括在计算机可读介质上记录的根据本发明检测的植物或植物群体的至少第一多态性的基因型的方法。本发明还提供包含这种信息的计算机可读介质。
[0057]在再进一步的实施方式中，本发明提供产生十字花科蔬菜植物(例如，芸苔属植物，如花椰菜)的可食用部分的方法，包括:(a)通过本发明的方法获得植物；和(b)收集由所述植物产生的可食用部分(例如，花序)。
[0058]在本发明的进一步方面，提供了一种分离的核酸，其包含比对时在SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:24之间保守的至少18个连续核苷酸的序列。
[0059]本发明还进一步提供`分离的核酸，其包含SEQ ID NO:1的至少18个连续核苷酸的序列，其中所述序列不存在于SEQ ID N0:24中。
[0060]在再进一步的方面，本发明提供分离的核酸，其包含SEQ ID NO:24的至少18个连续核苷酸的序列，其中所述序列不存在于SEQ ID N0:1中。
[0061]为避免疑问，本文中使用的核苷酸位置的所有编号对应于SEQ ID NO:1中给出的或通过与SEQ ID NO:1比对得到的核苷酸编号。
[0062]附图的简要i兑明
[0063]图1显示具有增加的硫代葡萄糖苷水平的花椰菜(如甘蓝麦)(FT69)与不具有增加的硫代葡萄糖苷水平的花椰菜(如甘蓝)(Oleracea)的Myb28基因座共有序列之间的序列比对。在总长2202bp的序列中检测到总共26种单征多态性(SFP)(其中有16种SNP和10种插入缺失(indel))。SFP加阴影显示在图1的序列比对中。这些SFP指示了甘蓝麦渗入。
[0064]图2a显示SEQ ID NO:1 ;包含来自不具有增加的硫代葡萄糖苷水平的甘蓝(花椰菜)的Myb28基因座的核酸片段的序列。SFP (包括SNP和indel，例如可被删除的核苷酸)加阴影。在其之间可插入SFP (indel插入)的核苷酸加下划线。
[0065]图2b显示SEQ ID NO:2，包含来自不具有增加的硫代葡萄糖苷水平的甘蓝(花椰菜)的Myb28基因座的核酸片段的序列。SFP (包括SNP和indel，例如可被删除的核苷酸)加阴影。括号〈> 中的片段(及小写字母核苷酸)对应于甘蓝序列中的SFP (indel，其是插入)，所述插入在高硫代葡萄糖苷的花椰菜(例如甘蓝麦)中发现。
[0066]图3显示花椰菜栽培种(1199、1639和HGl栽培种都是高硫代葡萄糖苷(例如，高萝卜硫苷)的栽培种)的叶中的Myb28表达。
[0067]图4显示芸苔属植物中硫通量的示意图。以黄色显示的代谢物是主S池。
[0068]图5显示SEQ ID NO:24，包含来自具有增加的硫代葡萄糖苷水平的甘蓝麦FT69的Myb28基因座的核酸片段的序列。加阴影的核苷酸表示与SEQ ID NO:1比对时的SFP (包括 SNP 和 indel)。
[0069]图6显示来自于验证标志物在追踪种质组中的表型的设计用于芸苔属的Myb28的TaqMan (TM)分析的数据。
[0070]本发明优选实施方式的详细i兑明
[0071]除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。Singleton 等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY,20ED., John Wiley and Sons, New York(1994)和 Hale&Marham, THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
[0072]本发明不限于本文中公开的示例性方法和材料，而且类似于或等同于本文中描述的方法和材料的任何方法和材料可以用于实施或测试本发明的实施方式。
[0073]数值范围包括限定该范围的数字。在提供了值的范围的情况中，除非上下文另外明确指出，应理解其也特别地包括在该范围的上限和下限之间的、达到下限的十分之一单位的各插入值。在任何指明的值或指明的范围中的插入值之间的各较小范围及在该指明范围中的任何其它指明的或插入的值涵盖在本公开内。
[0074]本文中提供的标题不是对通过引用作为整体的说明书而可能具有的本发明各个方面或实施方式的限制。因此，在紧接下面定义的术语通过引用作为整体的说明书更完整地定义。
[0075]术语的其它定义可能在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施方式之前，应理解本公开不限于所描述的特定实施方式，因为这类实施方式显然可以改变。也应理解本文中使用的技术是仅用于描述特定实施方式的目的，而不意图是限制性的，因为本公开的范围仅由所附的权利要求限定。
[0076]必须注意，如本文中和所附权利要求中所用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数的指代，除非上下文清楚地另有指定。
[0077]本文中讨论的出版物仅提供用于在本申请提交日之前的公开。本文中没有任何意图表示承认这些出版物构成本文所附权利要求的现有技术。
[0078]本发明涉及鉴定可扩增和可分析的多态性基因座Myb28，其为与赋予植物增加的硫代葡萄糖苷水平密切关联的转录因子基因。这一多态性基因座可以称为“Myb28-FT69”或“FT69”基因座或者“甘蓝麦”基因座。因此，在这一基因座的一种或多种遗传标志物如DNA多态性，例如一种或多种单核苷酸多态性(SNP)或插入/缺失(“indel”)，可以用作检测闻硫代匍萄糖昔性状基因座的存在的遗传标志物。
[0079]多态性基因座可以定义为包含与增加的硫代葡萄糖苷水平的表型遗传关联的和鉴别该表型的等位基因，或者与不存在增加的硫代葡萄糖苷水平的表型遗传关联的和鉴别该表型的等位基因。
[0080]因此，本发明提供在 Myb28基因座处与增加的硫代甸甸糖昔水平基因等位基因的存在或不存在相关的特定分子单倍型。
[0081]在一个实施方式中，Myb28_FT69(增加的硫代葡萄糖苷)序列表示为图1中所示的FT69序列。
[0082]在另一个实施方式中，Myb28-FT69 (增加的硫代葡萄糖苷)序列表示为如SEQ IDNO:24所示的FT69序列(图5中)。
[0083]株系FT-69是由John Innes Center, UK产生的株系，其具有升高的3_甲基硫丙基硫代葡萄糖苷(MSP)(屈曲花苷)水平。它通过使相对于驯化的花椰菜野生的植物(甘蓝麦)与驯化的花椰菜(甘蓝)杂交而产生。FT-69与适应的花椰菜植物株系BRM51-19回交。在各次杂交后，基于与轮回亲本BRM51-19的表型相似性选择植物，并分析MSP和其它的植物化学4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)(萝卜硫苷)的水平。该完成的株系命名为 BRM51-1162。
[0084]发明人确定花椰菜(甘蓝)贡献基因以产生目标硫代葡萄糖苷，例如4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)(萝卜硫苷)，且甘蓝麦贡献基因以增加目标硫代葡萄糖苷的浓度。
[0085]因此，本发明允许利用Myb28基因座处的多态性位点有效地选择具有增加的硫代葡萄糖苷水平的植物，甚至在对于其它性状如产量、疾病抗性、突出体活力、生长性活力、应激耐受性、植物高度、花序质量、花序直径、花序重量、花序大小、花序形状、花序颜色和开花天数的高选择压力下。
[0086]本发明还提供PCR引物和反应条件，由此对于包含增加的硫代葡萄糖苷水平的植物特异性的标志物如 SN或indel可以以显性或共显性方式检测。通过使用该标志物，本领域技术人员可以在十字花科蔬菜植物(例如芸苔属植物，如花椰菜)的育种过程中选择增加的硫代葡萄糖苷水平。
[0087]之前描述的与高硫代葡萄糖苷性状关联的标志物未能提供足够的选择工具，因为例如之前描述的标志物不与增加的硫代葡萄糖苷水平紧密关联。
[0088]在另一个方面，本发明提供将增加的硫代葡萄糖苷水平渗入到十字花科蔬菜植物(例如芸苔属植物，如花椰菜)中的方法，包括:(a)使具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜植物与第二十字花科蔬菜杂交以形成隔离的群体；和(b)选择至少一个表现出增加的硫代葡萄糖苷性状的群体成员，其中选择是基于Myb28-FT69基因座处可检测的单倍型的存在。在一个方面，具有增加的硫代葡萄糖苷性状的胡椒株系与第二十字花科蔬菜植物(例如芸苔属植物，如花椰菜)株系杂交至少两代(例如产生F2或BClSl群体)。在另一个方面，植物在杂交前鉴定为具有增加的硫代葡萄糖苷表型。在一个方面，隔离的群体自交并筛选增加的硫代葡萄糖苷水平的后续群体。
[0089]如本文中所用的，“标志物”是至少一种表型、基因型或多态性存在的指示。标志物包括，但不限于单核苷酸多态性(SNP)、酶切扩增多态序列(CAPS)、扩增片段长度多态性(AFLP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、简单重复序列(SSR)、插入/缺失(INDEL)、间简单重复序列(ISSR)、序列特征性扩增区域(SCAR)标志物及随机扩增多态性DNA(RAPD)序列。
[0090]标志物可以以共显性方式(二倍体杂合子中基因座处的等位基因都是可容易地检测的)遗传，没有环境变异的成分，即遗传力为I。
[0091]本文中使用的“核酸标志物”是指能够作为用于检测与增加的硫代葡萄糖苷水平相关的多态性、表型或两者的标志物的核酸分子。
[0092]Myb28基因座处标志物的使用提供了候选株系的快速和可靠的分子筛选，并允许对十字花科蔬菜(例如芸苔属植物，如花椰菜)育种株系进行增加的硫代葡萄糖苷水平的基因型筛选而无需表型植物化学分析。
[0093]一旦产生了具有增加的硫代葡萄糖苷水平的植物，植物本身可以按照常规的程序栽培。后代可以通过有性繁殖获得。从有性繁殖获得的种子可以从具有增加的硫代葡萄糖苷水平的植物回收并作为繁殖手段进行栽种或以其它方式生长。子代也可以由植物通过无性繁殖获得。原生质体或繁殖体(例如插条、接穗或砧木)可以从具有增加的硫代葡萄糖苷水平的植物或其部分回收并可以用于繁殖具有增加的硫代葡萄糖苷水平的植物。
[0094]本发明还提供通过前述方法产生的、具有增加的硫代葡萄糖苷水平的植物后代植物。如本文中所用的，后代不仅包括(但不限于)两个植物之间的任何杂交(其为回交或其它方式)的产物，而且包括所有其谱系回溯至初次杂交的所有后代。在本发明的一个方面，后代包含约50%、25%、12.5%或更少的来自具有增加的硫代葡萄糖苷水平的植物的核DNA并表达提供增加的硫代葡萄糖苷水平的遗传物质。
[0095]如本文中所用的，两种核酸序列(包括核酸标志物序列和赋予所需性状如增加的硫代葡萄糖苷水平的基因位点的核酸序列)的关联可以是遗传的或物理的或两者。
[0096]在本发明的一个方面，核酸标志物和赋予增加的硫代葡萄糖苷性状的遗传位点是遗传关联的，例如表现出高于2.0的LOD得分，如通过基于Lander和Botstein,1989(Geneticsl21:185-199)描述的最大似然方法并在软件包MAPMAKER(例如，Lander等，(1987)Genomicsl:174_181，缺省参数)中执行的增加的硫代葡萄糖苷性状的区间作图所评价的。在其它实施方式中，标志物和赋予增加的硫代葡萄糖苷性状的区域是遗传关联的并表现出大于3.0的LOD得分或者大于6.0,9.0、12.0、15.0或18.0的LOD得分。
`[0097]在另一个方面，核酸分子可以与Myb28基因座物理关联。在一些方面，核酸标志物特异性地与具有Myb28基因座之内的序列的核酸分子杂交。
[0098]如本文中所用的，如果两个核酸分子能够形成反向平行的双链核酸结构，则称这两个分子能够彼此杂交。常规严格性条件由Sambrook等，(1989) (Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)和 Haymes 等，(1985)(Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press,Washington,D.C.)描述。因此偏离完全互补性是允许的，只要这种偏离不完全排除分子形成双链结构的能力。因此，为了核酸分子用作引物或探针，它仅需要序列充分互补以能够在所采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
[0099]促进DNA杂交的适宜的严格性条件，例如约45°C下6.0*氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后50°C下2.0*SSC洗涤，是本领域技术人员已知的或可以在Ausubel等(1989)(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons,N.Y.),6.3.1-6.3.6 节中发现。在一些实施方式中，杂交条件可以是高、中等或低严格性条件。示例性的条件包括使用50%甲酰胺、5.0*SSC、I % SDS和在42°C下温育14小时，然后使用0.2*SSC、I % SDS洗涤和在65 °C下温育的那些条件。
[0100]杂交的特异性可以受杂交后洗涤的影响。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以从50°C下约2.0*SSC的低严格性到50°C下约1.0*SSC的中等严格性到50°C下约0.2*SSC的高严格性中选择。另外，洗涤步骤中的温度可以从室温(约22°C)的低严格性条件到约50°C的中等严格性条件和到约65°C的高严格性条件。温度和盐浓度两者都可以变化，或者温度或盐浓度任一可以保持恒定而另一变量发生变化。在一些方面，洗涤步骤可以进行5、10、15、20、25、30或更多分钟。在另一方面，洗涤步骤进行约20分钟。在再另一方面，洗涤步骤可以使用所选择的盐浓度、温度和时间重复1、2、3、4或更多次。在另一方面，洗涤步骤重复两次。
[0101]植物的遗传标记谱可以指示使用该近交系产生的杂种的农学性状。例如，如果已知遗传标记谱和表型的近交植物与已知遗传标记谱和表型的第二近交植物杂交，有可能基于亲本近交植物的综合遗传标记谱预测Fl杂种的表型。用于从遗传标记数据预测杂种性能的方法公开于美国专利N0.5，492，547中，其公开内容特别地通过引用全部并入本文。这种预测可以使用任何合适的遗传标志物进行，例如SSR、INDEL、RFLP, AFLP, SNP、ISSR或同功酶。
[0102]可以使用与具有Myb28_介导的增加的硫代葡萄糖苷水平遗传连锁或相关的另外的标志物，如SSR、AFLP标志物、RFLP标志物、RAI3D标志物、表型标志物、SNP、SCAR标志物、同功酶标志物或微阵列转录谱。分离这类标志物的方法是本领域中已知的。
[0103]例如，基因座特异性的SSR可以通过筛选基因组文库以寻找对于在基因组克隆Myb28-FT69上发现的序列特异性的标志物，对“阳性”克隆测序，设计侧邻该重复序列的引物和利用这些引物扩增基因组DNA而获得。
[0104]如本文中所用的，后代不仅包括(但不限于)两个植物之间的任何杂交(其为回交或其它方式)的产物，而且包括所有其谱系回溯至初次杂交的所有后代。特别地，非限制地，这种后代包括具有50%、25%、12.5%或更少的来自两个原始杂交植物之一的核DNA的植物。
[0105]如本文中所用的，如果第二植物的谱系包括第一植物，则第二植物源自第一植物。
[0106]本发明提供本文描述的十字花科蔬菜(例如芸苔属，如花椰菜)株系的遗传互补(genetic complement)。进一步提供了杂种遗传互补,其中该互补通过来自本文描述的优良近交十字花科蔬菜(例如芸苔属，如花椰菜)株系的单倍型遗传互补和另一单倍型遗传互补的组合来形成。确定这种遗传互补的方法是本领域中公知的。
[0107]如本文中所用的，短语“遗传互补”意思是核苷酸序列的集合体，其表达限定了植物的表型，如花椰菜植物或者该植物的细胞或组织。举例来说，花椰菜植物经基因分型以确定其具有的经遗传得到的标志物的代表性样品。标志物可以以共显性方式遗传以使得二倍型基因座处的两个等位基因的存在可很容易地检测，且它们没有环境变异，即它们的遗传力接近于或等于I。这种基因分型优选在还确定了一种或多种目标性状的数值的至少一代后代植物上进行。单个基因座基因型的阵列表达为标志物等位基因的谱，对于双倍体植物各基因座处有两个等位基因。各基因座的标志物等位基因组成可以是纯合的或杂合的。纯合性是其中基因座处的两个等位基因的特征在于基因组在基因座处具有相同情况(即相同的核苷酸序列)的状态。杂合性是指基因组在基因座处具有不同的情况。潜在地，可以使用任何类型的遗传标志物，例如，简单重复序列(SSR)、插入/缺失多态性(INDEL)、限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)和同功酶。
[0108]值得注意的遗传信息可以使用共显性标志物系统(例如，Mather,1938Measurements of Linkage in Heredity:Meuthuen&Co)从完全分类的 F2 群体获得。F2群体是产生杂种种子后自花授粉或近缘授粉的第一代。通常单一 Fl植物经自花授粉或近缘授粉以生成以孟德尔(I:2:1)方式隔离核编码基因的群体。
[0109]与使用共显性标志物相反，使用显性标志物经常需要后代测试(例如F3或回交自交家系)以鉴别杂交个体。收集的信息可以等同于在完全分类的F2群体中获得的信息。然后分子标记辅助选择可以基于标志物-性状图谱相关性而应用于后续后代(F2，F3)，其中连锁还未通过重组事件完全分离(即最大不平衡)。
[0110]重组近交系(RIL)(遗传相关系；通常〉F5)可以用作作图群体。RIL可以通过使F2植物自交，然后使所得的F3植物自交并重复这一世代自交过程而产生，从而提高纯合性。从显性标志物获得的信息可以通过使用RIL最大化，因为所有基因座是纯合的或基本如此。在紧密连锁(即约〈10%重组)的情况下，在RIL群体中评价的显性和共显性标志物相对于回交群体中任一标志物类型提供了每个个体更多的信息(例如，Reiter等，1992 (Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 89:1477-1481)。然而，由于标志物之间的距离变得更大(即，基因座变得更独立)，RIL群体中的信息与共显性标志物相比时显著减少。
[0111]回交群体可以用作作图群体。回交群体(Be)可以通过使Fl与其亲本之一杂交而产生。通常，产生回交群体以从轮回亲本系(在回交中采用的亲本)恢复所需性状(其可以包括大多数基因)而同时从第二亲本系(其通常被称为供体)添加一种或一些性状。可以进行与轮回亲本的一系列回交以恢复轮回亲本的大多数所需性状。因此产生了由近似类似于轮回亲本的个体组成的群体，其中各个体携带变化量的或参差不同的(a mosaic of)来自供体亲本的基因组区域。回交群体可用于对显性标志物作图，特别是如果轮回亲本中的所有基因座是纯合的且供体和轮回亲本具有相反的多态性标志物等位基因(Reiter等，1992)。 [0112]使用共显性或显性标志物从回交群体获得的信息小于从完全分类的F2群体获得的信息，因为涉及一个而不是两个配子的重组事件进行每植株采样。但是回交群体与RIL相比提供更多的信息(以较低的标志物饱和度)，因为连锁的基因座之间的距离在RIL群体中增加(即约15%重组)。增加的重组可能有益于紧密连锁的解析，但在构建具有低标志物饱和度的图谱中可能是不希望的。
[0113]近等基因系(NIL)通过次回交建立以产生在遗传组成上除了所关注的性状或基因组区域外近似相同的个体的阵列，该近等基因系(NIL)可用作作图群体。在用NIL作图过程中，仅一部分基因座在亲本系之间是多态性的且预期在高度纯合的NIL群体中分离。但是，在NIL群体中多态性的那些基因座很可能与目标性状关联。
[0114]使用本发明的方法产生的植物可以是育种计划的部分或由育种计划产生。育种方法的选择取决于植物繁殖的方式、待改善的性状的遗传力和商业应用的栽培种的类型(例如，Fl杂种栽培种、纯系栽培种等)。用于本发明植物育种的选择的非限制性方法在下面给出。育种计划可以使用任何杂交的后代的标志物辅助选择进行增强。应进一步理解，可以在育种计划中使用任何商用和非商用的栽培种。例如，该选择一般地由诸如产量、疾病抗性、突出体活力、生长性活力、应激耐受性、植物高度、花序质量、花序直径、花序重量、花序大小、花序形状、花序颜色和开花天数的因素决定。
[0115]对于高度可遗传的性状，在单一位置处评估的优良个体植物的选择将是有效的，而对于低遗传力的性状，选择应基于从相关植物家系的重复评价获得的统计分析(例如，平均值)。通用的选择方法通常包括谱系选择、改良的谱系选择、混合选择和轮回选择。在优选的实施方式中，进行回交或轮回育种计划。
[0116]遗传的复杂性影响育种方法的选择。回交育种可用于将高度可遗传性状的一个或一些有利基因转移到所需栽培种中。各种轮回选择技术用于改善通过多种基因控制的定量遗传性状。在自花授粉作物中轮回选择的应用取决于授粉的容易度、来自各次授粉的成功杂种的频率和来自各次成功杂交的杂种后代的数目。
[0117]育种系可以在商用目标区域典型的环境中对两个或更多个世代进行测试并与适宜的标准进行比较。最佳系是作为新的商用栽培种亲本的候选者，而仍存在性状缺陷的那些系可以用作杂种的亲本或产生用于进一步选择的新群体。
[0118]鉴别优良植物的一种方法是观察其相对于其它试验植物及广泛种植的标准栽培种的性能。如果单次观察是不确定的，则重复观察可以提供其遗传价值的更好估计。育种者可以选择两种或更多种亲本系并杂交，随后重复自花授粉或近缘授粉并选择，从而产生许多新的遗传组合。
[0119]新的十字花科蔬菜(例如芸苔属，如花椰菜)系的开发需要十字花科蔬菜(例如芸苔属，如花椰菜)品种的产生和选择、这些品种的杂交及优良杂种杂交的选择。杂种种子可以通过选择的雄性不育亲本之间的人工杂交或通过使用雄性不育系产生。杂种可以针对特定单基因性状进行选择。关于亲本系以及杂种表型的其它数据影响育种者是否继续特定杂种杂交的决定。
[0120]谱系育种和轮回选择育种方法可用于从繁殖群体产生栽培种。育种计划将来自两个或更多个栽培种或者繁殖池中各种广泛来源的所需性状与亲本系中所需表型的选择结合，栽培种 通过自交从繁殖池产生。这些系用于产生新的栽培种。新的栽培种可以进行评估以确定哪一种具有商业潜力。
[0121 ] 谱系育种通常用于改良自花授粉作物。具有有利的互补性状的两个亲本杂交以产生FI。F2群体通过一个或几个Fl自交产生。进行最佳家系中最佳个体的选择。家系的重复测试可以开始于F4代以提供具有低遗传力的性状的选择效率。在近交的高级阶段(即F6和F7)，测试最佳系或表型相似系的混合作为新栽培种发行的潜能。
[0122]回交育种和杂交育种已用于将简单遗传的、高度可遗传的性状的基因转移到所需的纯合栽培种或近交系(其为轮回亲本)中。待转移的性状的来源称为供体亲本。从成功的回交计划获得的最终植物预期具有轮回亲本(例如栽培种)的属性和从供体亲本转移的所需性状。在初次杂交后，选择具有供体亲本的表型的个体并与轮回亲本重复杂交(回交)。在经过选择的多个回交世代后，所得的系预期具有轮回亲本(例如栽培种)的属性和从供体亲本转移的所需性状。
[0123]通过本发明产生的植物可以使用单种子传代程序(single-seed descentprocedure)产生。在严格意义上来说，单种子传代程序是指种植隔离的群体，然后选择在这一世代和各后续世代中的一个植株以自交和产生下一世代。当群体已经从F2发展到所需的近交水平，该系由其所起源的植物各追溯到不同的F2个体。由于一些种子不能发芽或一些植物不能产生至少一粒种子，群体中植物的数目在各代下降。结果，在世代进展完成时，不是所有原先在群体中采样的F2植物通过后代表示。[0124]通常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可以在现有的几本参考书之一中找到(例如，Fehr, 1987, Principles of Cultivar Development Vol.1, pp.2-3) ?
[0125]在另一个方面，具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(例如，芸苔属，如花椰菜)系可以用于育种计划中以将增加的硫代葡萄糖苷水平与其它目标性状组合。
[0126]如本文中所用的，所述的具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如具有增加的硫代葡萄糖苷水平的花椰菜)和/或其至少一种衍生物是指具有增加水平的选自以下列表的至少一种植物化合物的花椰菜:4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷、3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷、4-甲基硫丁基硫代葡萄糖苷、3-甲基硫丙基硫代葡萄糖苷、莱菔硫烧(sulforaphane)、芥酸精、蒜头素、3-甲磺酰基丙基异硫氰酸酯(iberin)、β -苯基乙基异硫氰酸酯(PE-1TC)、3_甲基硫丙基异硫氰酸酯。
[0127]具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(例如花椰菜)描述于W099 /52345和PCT / GB2009 / 001648中，这两者通过引用并入。
[0128]适当地，具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如具有增加的硫代葡萄糖苷水平的芸苔属或花椰菜)可以包含增加水平的一种或多种硫代葡萄糖苷和/或一种或多种异硫氰酸酯。
[0129]在一个实施方式中，用于本发明中的具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如具有增加的硫代葡萄糖苷水平的芸苔属或花椰菜)包含增加水平的一种或多种以下化合物:4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)、3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP),4-甲基硫丁基硫代葡萄糖苷、3-甲基硫丙基硫代葡萄糖苷。
[0130]在一个实施方式中，用于本发明中的具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如具有增加的硫代葡萄糖苷水平的芸苔属或花椰菜)包含增加水平的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)和`/或3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP)。
[0131]优选地，具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如具有增加的硫代葡萄糖苷水平的芸苔属或花椰菜)的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)水平是在相似条件下生长的标准十字花科蔬菜(如标准芸苔属或标准花椰菜)中发现的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)水平的2-3倍。
[0132]适当地，具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如具有增加的硫代葡萄糖苷水平的芸苔属或花椰菜)的4-3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP)水平是在相似条件下生长的标准十字花科蔬菜(如标准芸苔属或标准花椰菜)中发现的4-3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP)水平的2-3倍。
[0133]适当地，具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如具有增加的硫代葡萄糖苷水平的芸苔属或花椰菜)可以包含至少10微摩尔/ g干重的量的至少一种硫代葡萄糖苷。更优选地，至少约14微摩尔/ g干重，至少约16微摩尔/ g干重，至少约20微摩尔/ g干重,至少约25微摩尔/ g干重，至少约30微摩尔/ g干重，至少约50微摩尔/ g干重或至少约75微摩尔/ g干重。
[0134]适当地，在一个实施方式中，具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如具有增加的硫代葡萄糖苷水平的芸苔属或花椰菜)可以具有至少10微摩尔/ g干重的量的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)和/或3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP) ο更优选地，至少约14微摩尔/ g干重，至少约16微摩尔/ g干重，至少约20微摩尔/ g干重，至少约25微摩尔/ g干重，至少约30微摩尔/ g干重，至少约50微摩尔/ g干重或至少约75微摩尔/ g干重。
[0135]硫代葡萄糖苷是一类含硫、氮和衍生自葡萄糖的基团的有机化合物。它们作为十字花目(Brassicales)(特别是十字花科(Brassicaceae))的许多植物如十字花科蔬菜的次级代谢产物而存在。
[0136]硫代葡萄糖苷是水溶性的阴离子且属于葡糖苷类。每一种硫代葡萄糖苷包含通过硫原子与糖苷配糖基键合(形成硫酸化酮肟)和通过氮原子与硫酸根基团键合的中心碳原子。另外，中心碳与侧基键合；不同的硫代葡萄糖苷具有不同的侧基。
[0137]大约120种不同的硫代葡萄糖苷已经在植物中天然存在。
[0138]根据本发明的硫代葡萄糖苷优选是脂族的。
[0139]在本发明中，设想一种或多种以下硫代葡萄糖苷可能是重要的:4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷、3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷、4-甲基硫丁基硫代葡萄糖苷和3-甲基硫丙基硫代葡萄糖苷。
[0140]在一个实施方式中，硫代葡萄糖苷优选是4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)和/或3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP)。
[0141]在一个实施方式中，硫代葡萄糖苷优选是4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)。
[0142]许多有用的性 状可以通过遗传转化技术引入。因此遗传转化可以用于将选择的转基因插入本发明的芸苔属植物中或可选地可以用于制备可通过回交引入的转基因。用于植物(包括芸苔属)转化的方法是本领域技术人员公知的。
[0143]用于植物细胞转化的载体不受限制，只要载体可以在细胞中表达插入的DNA。例如，使用包含用于在芸苔属细胞中组成型基因表达的启动子(例如花椰菜花叶病毒35S启动子)和可通过外源刺激诱导的启动子的载体。合适的载体的实例包括PBI 二元载体。载体引入其中的“芸苔属细胞”包括各种形式的芸苔属细胞，如培养的细胞悬浮物、原生质体、叶切片和愈伤组织。
[0144]载体可以通过已知的方法如聚乙二醇法、聚阳离子法、电穿孔、农杆菌介导转化、微粒轰击和原生质体的直接DNA摄取引入芸苔属细胞中。
[0145]为实现电穿孔转化，可以采用易碎组织如细胞的悬浮培养物或胚胎发生愈伤组织或者可选地可以直接转化不成熟胚或其它有机组织。在这一技术中，通过将选择的细胞暴露于果胶降解酶(果胶酶)部分地降解细胞壁或者以受控的方式机械损伤组织。
[0146]将转化DNA片段递送到植物细胞的一种有效方法是微粒轰击。在这种方法中，微粒用核酸包被并通过推动力投送到细胞中。示例性的微粒包括由钨、钼和优选的金构成的微粒。对于轰击，悬浮的细胞在过滤器或固体培养基上浓缩。或者，不成熟的胚或其它靶细胞可以排列在固体培养基上。待轰击的细胞可以设置在微粒停止板下方的适当距离处。微粒轰击技术可广泛适应，且可以用于实质地转化任何植物物种。
[0147]农杆菌介导的转化是另一种用于将基因座引入植物细胞中的广泛应用的系统。该技术的优势是DNA可以引入完整植物组织中，从而不需要从原生质体再生完整植物。现代农杆菌转化载体能够在大肠杆菌以及农杆菌(和其它根瘤菌)中复制，从而允许方便地操作。此外，用于农杆菌介导的基因转移的载体中的最近技术进展改进了基因和限制性位点在载体中的排列以利于构建能够表达各种多肽编码基因的载体。所描述的载体具有方便的多接头区域，其侧邻用于直接表达插入的多肽编码区域的启动子和多腺苷酸化位点。另外，含有武装和非武装Ti基因的农杆菌可用于转化。
[0148]在其中农杆菌介导的转化有效的那些植物株系中，由于基因座转移的脆弱和限定特性，农杆菌介导的转化是特别的方法。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞中是本领域中公知的(美国专利N0.5，563，055)。例如，美国专利N0.5，349，124描述了使用农杆菌介导的转化来转化植物细胞的方法。通过插入具有编码全长B.t.毒素蛋白的DNA编码序列的嵌合基因(其表达对于鳞翅目幼虫毒性的蛋白质)，这一方法获得了具有对这种昆虫的抗性的植物。[0149]多种启动子对于任何目标基因(包括，但不限于选择标志物、可评分标志物、用于害虫耐受性、疾病抗性、营养增强的基因及任何其它具有农艺学意义的基因)具有植物基因表达的用途。可用于芸苔属植物基因表达的组成型启动子的实例包括，但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV) P-35S启动子(其在大多数植物组织(包括单子叶植物)中导致组成型的高水平表达)、CaMV35S启动子的连续重复形式、增强的35S启动子(P_e35S)、胭脂氨酸合酶启动子、章鱼氨酸合酶启动子和如美国专利N0.5，378，619中所述的玄参花叶病毒(P-FMV)启动子，及FMV启动子的增强形式(P-eFMV)(其中P-FMV的启动子序列串联地重复)、花椰菜花叶病毒19S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄斑驳病毒启动子及其它已知在植物细胞中表达的植物DNA病毒启动子。
[0150]可以引入本发明的植物中的示例性的核酸包括，例如，来自另一物种的DNA序列或基因，或甚至在同一物种中起源或存在于同一物种中的基因或序列，但通过遗传工程方法而不是经典繁殖或育种技术引入受体细胞中。但是，术语“外源的”也意图指非正常存在于被转化的细胞中的基因，或者也许不是简单地以如在转化DNA片段或基因中发现的形式、结构等存在的基因，或者不是正常存在的且希望以不同于天然表达模式的方式(例如，过表达)表达的基因。因此，术语“外源的”基因或DNA意图指引入到受体细胞中的任何基因或DNA片段，不论是否相似的基因可能已存在于这样的细胞中。包括在外源DNA中的DNA类型可以包括早已存在于植物细胞中的DNA、来自于另一植物的DNA、来自于不同生物体的DNA或外部产生的DNA，如含有基因的反义信使的DNA序列或编码基因的合成或修饰形式的基因的DNA序列。
[0151]数百种(如果不是几千种的话)不同基因是已知的且可以潜在地引入根据本发明的芸苔属植物中。
[0152]在一个实施方式中，具有一种或多种本文教导的多态性的myb28基因可以通过用所述基因转化芸苔属植物而引入芸苔属植物中。
[0153]在一个实施方式中，本发明涉及用除了至少一种选自以下的多态性外包含SEQ IDNO:1的myb28基因转化芸苔属植物:
[0154]a)在对应于 SEQ ID NO:1 的核苷酸 83、136、226、563、610、830、995、1116、1513、1577、1606、1620、1825、1863、1877或2026的位置处的单核苷酸多态性(SNP)，或
[0155]b)在SEQ ID NO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的核苷酸的多态性，或[0156]c)在SEQ ID NO:1的核苷酸836和837之间、核苷酸867和868之间或核苷酸943和944之间存在的核苷酸的多态性。
[0157]在一个实施方式中，本发明涉及用包含SEQ ID NO:24或与SEQ ID NO:24具有至少97% (如至少98%或至少99% )同一性的序列的myb28基因转化芸苔属植物。
[0158]在一些实施方式中，可以将进一步的基因和相应的表型引入芸苔属植物中，包括例如一个或多个用于昆虫耐受性(如苏云金芽胞杆菌(B.t.)基因)、害虫耐受性(如用于真菌病控制的基因)、除草剂耐受性(如赋予草甘膦耐受性的基因)的基因及用于质量改善的基因，如产量、营养强化、环境或应激耐受性或者植物生理、生长、发育、形态或植物产物的任何希望的改变。例如，结构基因包括任何赋予昆虫耐受性的基因(包括，但不限于芽胞杆菌昆虫控制蛋白质基因)，如通过引用全文并入的W099 / 31248、通过引用全文并入的美国专利N0.5，689，052、通过引用全文并入的美国专利N0.5，500，365和5，880，275中所述的。在另一个实施方式中，结构基因可以赋予对除草剂草甘膦的耐受性，如由包括，但不限于如通过引用全文并入的美国专利N0.5，633，435中所述的农杆菌菌株CP4草甘膦抗性EPSPS基因(aroA:CP4)或如通过引用全文并入的美国专利N0.5，463，175中所述的草甘膦氧化还原酶基因(GOX)的基因所赋予的。
[0159]或者，DNA编码序列可以通过编码引起内源基因表达的靶向抑制的非翻译RNA分子来影响表型，例如通过反义-或共抑制-介导的机制。RNA也可以是经工程化以切割所需的内源mRNA产物的催化的RNA分子(即核酶)。因此，产生表达目标表型或形态变化的蛋白质或mRNA的任何基因可以用于本发明中。
[0160]增加的硫代葡萄糖苷水平
[0161]适当地，术语“具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜植物”或“具有增加的硫代葡萄糖苷水平的花椰菜”分别是指与十字花科蔬菜植物或花椰菜的常规品种相比具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜或花椰菜植物。在花椰菜中，常规品种可以是甘蓝⑶33、育种者系560216或育种者ID田间编号2153。
[0162]在一个实施方式中，术语“增加的硫代葡萄糖苷水平”意思是十字花科蔬菜(如花椰菜)的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)和/或甲基亚磺酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP)的水平是在相似条件下生长的标准(常规品种的)十字花科蔬菜(如标准(常规品种的)花椰菜)中发现的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)和/或甲基亚磺酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP)的水平的2-3倍。
[0163]适当地，在一个实施方式中，术语“增加的硫代葡萄糖苷水平”意思是十字花科蔬菜(如花椰菜)包含约10至约100微摩尔/ g干重。适当地，术语“增加的硫代葡萄糖苷水平”意思是十字花科蔬菜(如花椰菜)包含至少约10微摩尔/ g干重，适当地至少约14微摩尔/ g干重，适当地至少约16微摩尔/ g干重，适当地至少约20微摩尔/ g干重，适当地至少约25微摩尔/ g干重，适当地至少约30微摩尔/ g干重，适当地至少约50微摩尔/ g干重，适当地至少约75微摩尔/ g干重。具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如花椰菜)描述于 Mithen 等，Theor.Appl.Genet.(2003) 106, 727-734 ;Sarikamis等，Molecular Breeding (2006) 18，219-228 或 W099 / 52345 (通过引用并入)中。 [0164]在一个实施方式中，具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如花椰菜)可以包含浓度为约10至约100微摩尔/g干重，适当地约14至约100微摩尔/ g干重，适当地约16至约100微摩尔/ g干重,适当地约20至约100微摩尔/ g干重,适当地约30至约100微摩尔/ g干重，适当地约50至约100微摩尔/ g干重的4-甲基亚磺酰基丁基硫代葡萄糖苷和/或3-甲基亚磺酰基丙基硫代葡萄糖苷。
[0165]例如，具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如花椰菜)中4-甲基亚磺酰基丁基硫代葡萄糖苷的水平例如可以是约8至约55微摩尔/g干重，适当地约10至约55微摩尔/ g干重，适当地约10至约40微摩尔/g干重。适当地，具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如花椰菜)中4-甲基亚磺酰基丁基硫代葡萄糖苷的水平例如可以是至少约8微摩尔/ g干重，适当地至少约10微摩尔/g干重，适当地至少约15微摩尔/g干重。这与可由零售渠道获得的通常具有4-5微摩尔/ g干重范围内的这种硫代葡萄糖苷的水平的十字花科蔬菜(特别是花椰菜)形成明显的对比。
[0166]例如，具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如花椰菜)中3-甲基亚磺酰基丙基硫代葡萄糖苷的水平例如可以是约1.5至约10微摩尔/ g干重，适当地约2至约10微摩尔/g干重，适当地约2至约8微摩尔/g干重。适当地，具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如花椰菜)中3-甲基亚磺酰基丙基硫代葡萄糖苷的水平例如可以是至少约1.5微摩尔/g干重，适当地至少约2微摩尔/g干重，适当地至少约3微摩尔/ g干重，适当地至少约4微摩尔/ g干重，适当地至少约5微摩尔/ g干重。这与可由零售渠道获得的通常具有0.5-1微摩尔/g干重范围内的这种硫代葡萄糖苷的水平的十字花科蔬菜(如花椰菜)形成明显的对比。
[0167]在一个实施方式中，十字花科蔬菜(如花椰菜)中硫代葡萄糖苷的水平通过检验植物的可食用部分测定，如花椰菜的花序和可食用茎两者。在另一实施方式中，十字花科蔬菜(如花椰菜)中硫代葡萄糖苷的水平通过仅检验叶或仅花序或仅根来测定。 [0168]例如，对于其中十字花科蔬菜是主要食用叶子的一种蔬菜(如紫花南芥、芸芥、二行芥、野生紫花南芥、无头甘蓝、卷心菜)的情况中，则优选地十字花科蔬菜中硫代葡萄糖苷的水平通过仅检验叶来测定。
[0169]在其中十字花科蔬菜是主要食用花序的一种蔬菜(如花椰菜、抱子甘蓝或花椰菜)的情况中，则优选地十字花科蔬菜中硫代葡萄糖苷的水平通过仅检验花序来测定。
[0170]在其中十字花科蔬菜是主要食用根的一种蔬菜(如萝卜或芜菁)的情况中，则优选地十字花科蔬菜中硫代葡萄糖苷的水平通过仅检验根的可食用部分来测定。
[0171]优选地，至少花椰菜花序(或仅花椰菜花序)用于本发明中。
[0172]在一个实施方式中，术语“增加的硫代葡萄糖苷水平”意思是十字花科蔬菜花序或可食用根或可食用叶含有增加的硫代葡萄糖苷水平，例如约10至100微摩尔/g干重。在这一实施方式中，适当地术语“增加的硫代葡萄糖苷水平”意思是十字花科蔬菜花序或根或叶包含至少约10微摩尔/ g干重，适当地至少约14微摩尔/ g干重，至少约16微摩尔/ g干重，适当地至少约20微摩尔/ g干重，适当地至少约25微摩尔/ g干重，适当地至少约30微摩尔/g干重，适当地至少约50微摩尔/g干重，适当地至少约75微摩尔/ g干重。
[0173]在一个实施方式中，术语“增加的硫代葡萄糖苷水平”意思是花椰菜花序含有高的硫代葡萄糖苷水平，例如约10至100微摩尔/ g干重。在这一实施方式中，适当地术语“增加的硫代葡萄糖苷水平”意思是花椰菜花序包含至少约10微摩尔/ g干重，适当地至少约14微摩尔/ g干重，至少约16微摩尔/ g干重，适当地至少约20微摩尔/ g干重，适当地至少约25微摩尔/ g干重，适当地至少约30微摩尔/ g干重，适当地至少约50微摩尔/g干重，适当地至少约75微摩尔/g干重。
[0174]应当理解，术语具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(如具有增加的硫代葡萄糖苷水平的花椰菜)不仅是指处于其新鲜自然状态的植物材料，即作为整个头部，如花椰菜花序和莖，而且是指已经历一个或多个进一步的加工步骤(如切花(floreting)、个体快速冷冻(IQF)、浸溃、均质化、干燥、冷冻、压实等)时的十字花科蔬菜(如花椰菜)。
[0175]十字花科蔬菜
[0176]本领域技术人员知道，高硫代葡萄糖苷花椰菜以外的包含硫代葡萄糖苷的植物是已知的。硫代葡萄糖苷存在于白花菜目(Capparales)的植物中。该目包括大约18个科，其中十字花科和白花菜科是最大的两个科。
[0177]包含硫代葡萄糖苷的来自十字花科的十字花科蔬菜(例如十字花科蔬菜作物)包括以下十字花科蔬菜作物:
[0178]?花椰菜
[0179]?紫花南芥(rocket)(包括 Sisymbrium officinales、芝麻菜(Eruca sativa)(芸芥(Salad Rocket))、Diplotaxis erucoides ( 二行芥(Wall Rocket))、细叶二行芥(Diplotaxis tenuifolia)(野生紫花南芥(Wild Rocket))和抚果匙莽(Buniasorientalis)(Turkish Rocket);和
[0180]?水田芥(包括 Rorripa nasturtium aquaticum 和豆瓣菜(Nasturtiumofficinale)),`[0181]?菜花，
[0182]?无头甘蓝(kale)，
[0183]?芜菁，
[0184]?羽衣甘蓝，
[0185]?苯蓝(kohlrabi),
[0186]?抱子甘蓝，
[0187]?白菜，
[0188]?加拿大油菜(canola)，
[0189]?卷心菜，和
[0190]?萝卜。
[0191]本领域技术人员应理解本发明提供的方法和组合物的许多优势。包括以下实施例以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的良好地实现实施本发明的技术，并因此可以认为构成本发明实施的优选模式。但是，本领域技术人员根据本公开应理解，可以对所公开的特定实施方式进行许多变化并仍获得相同或相似的结果而不脱离本发明的精神和范围。本文中引用的所有参考文献通过引用并入本文以达到该文献补充、解释本文中使用的方法、技术或组合物或为其提供背景或者提供其教导的程度。
实施例
[0192]十字花科蔬菜中硫代葡萄糖苷的产生是复杂的。图4显示了芸苔属中硫通量的示意图。具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜(例如具有增加的硫代葡萄糖苷水平的花椰菜)已经产生，例如，如W099 / 52345和PCT / GB2009 / 001648 (通过引用并入)中所述。
[0193]甘蓝麦具有非常高的3-甲基硫丙基硫代葡萄糖苷水平。当与甘蓝(Brassicaoleracea)杂交时,这转化成4_甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(萝卜硫苷)。本发明人确定，甘蓝麦提供了提高芸苔属植物中产生的硫代葡萄糖苷的含量的基因。
[0194]据发现，高萝卜硫苷性状是显性的，因而其仅需要渗入一个近交/双单倍体亲本中以产生杂种。可获得源自于栽培种Green Duke (称为GD DH, Bouhuon, E.J.R.，Keith,D.J., Parkin, 1.A.P., Sharpe, A.G., &Lydiate, D.J.(1996) Theor.Appl.Genet.93,833-839)的双单倍体花椰菜育种系。
[0195]在本发明之前，甲基硫代烷基苹果酸合酶(MAM)代谢或分子标志物用于育种计划中。已知MAMl的MAM3与高硫代葡萄糖苷性状密切相关。
[0196]但是，本发明人意外地观察到，一些具有高硫代葡萄糖苷(例如萝卜硫苷)表型的芸苔属栽培种不具有被认为与该性状相关的MAM标志物等位基因，因此得出结论，MAM标志物不必然与高硫代葡萄糖苷特性密切相关或者不是高硫代葡萄糖苷特性的关键，且因此其在育种中用作追踪这一性状的标志物是不可靠的。
[0197]因此，本发明人寻找能够可靠地和一致地用于确定具有增加的硫代葡萄糖苷(特别是增加的萝卜硫苷)水平的植物的基因型的高硫代葡萄糖苷标志物。
[0198]本发明人意外地确认转录因子Myb28基因座为十字花科蔬菜(例如花椰菜)中调节蛋氨酸源硫代葡萄糖 苷生物合成的关键基因座。
[0199]实施例1
[0200]MYB28 的实时 RT-PCR
[0201 ] Myb28序列通过使用芜菁(B.rapa)序列在BRAD芸苔属数据库(Cheng等，2011BRAD, the genetics and genomics database for Brassica plants.BMC PlantBiology2011 ；11:136.do1:10.1 I 86 / 1471-2229-11-1 36)处对 Myb28 (Bra029311)的BLAST检索来鉴定。该分析使用 ABI PRISM Primer Express 软件 v2 (Applied Biosystems)设计。引物和具有5’ -FAM和3’ -TAMRA修饰的TaqMan探针购自MWG UK且序列(SEQ IDNO:26-28)为:
[0202]Myb28For5> -CTCTTCCTCTTTCCTCGGGTTT-3，，
[0203]Myb28Rev5，-TGCAACTCAAGGAACCTCTCTGA-3，，
[0204]Myb28 探针 5，-AACCCGGTTTCCGAGATCACCACAC-3，.[0205]Myb28mRNA 水平通过实时 RT-PCR 使用 ABI Prism Step one Plus SequenceDetection System (Applied Biosystems)测定。实时 RT-PCR 反应在 microamp 光学 96-孔板中在包含Taqman? RNA-TO-CTl-Step主混合物试剂盒(Applied Biosystems)、20ng总RNA、0.ZSUufMultiscribe?和优化浓度的引物和探针的每孔20 μ I总体积中进行。
[0206]实时RT-PCR条件如下:一个循环的48°C 30分钟，一个循环的95°C 10分钟，接着40个循环95°C 15秒和一个循环的60°C I分钟。
[0207]Myb28数据使用通过来自一个Ironman植物的连续稀释的总RNA生成的标准曲线进行分析。[0208]图3显示花椰菜栽培种(1199、1639和HGl栽培种全部是具有增加的硫代葡萄糖苷水平的栽培种-例如，增加的萝卜硫苷栽培种)的叶中Myb28表达。
[0209]MYB2 8 测序
[0210]Myb2 8序列通过使用芜菁序列在BRAD芸苔属数据库(Cheng F.；Liu, S.；Wu, J.;Fang, L.;Sun, S.;Liu, B.;Li, P.;Hua, ff.；ffang, X., BRAD, The genetics andgenomics database for Brassica plants.BMC Plant Biology2011,11,136)处对Myb28(Bra029311)的 BLAST 检索来鉴定。
[0211]引物使用Primer3 版本0.4.0 (Rozen S, S.H.J., Primer3on the Wffff for generalusers and for biologist programmers.1n Bioinformatics Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology, Krawetz S, M.S., Ed.Humana Press:Totowa, NJ,2000 ；pp365-386)设计和购自 MWG UK。
[0212]DNA 使用 QIAGEN DNeasy Plant Maxi 试剂盒(QIAGEN)从叶材料提取。MYB28For5’-TCACGAACATGGAGAAGGTG-3’ (SEQ ID NO:3)，MYB28REV5’-TGAGCTTGACCGGGAGTATC-3’ (SEQ ID NO:4)。
[0213]PCR 反应在包含 IX Green GoTaq? 反应缓冲液(Promega)、2.5mM MgCl2、0.2mMdNTP、0.2 μ M弓丨物、0.5单位GoTaq? DNA聚合酶和15_50ng DNA的20 μ I总体积中进行。
[0214]PCR条件如下:95°C 2分钟，接着35个循环的95°C 30秒、53°C I分钟和72°C I分钟，然后是72°C 5分钟的最终延伸。PCR产物通过在琼脂糖凝胶上的凝胶电泳跑样并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)纯化，然后发送到TGAC (Norwich，UK)进行测序。
[0215]实施例2
[0216]甘蓝麦和甘蓝育种系之间MYB28编码区域中多态性的鉴别
[0217]使用来自青花菜(Brassicaoleracea var italic) R2R3 的 MYB28mRNA 完全编码序列(NCBI登录号GQ478992.1)，人工设计引物(表1)以扩增300和500bp之间的片段。
[0218]表1:基于甘 蓝编码序列设计引物序列(SEQ ID NO:3_23)以扩增用于测序的不同育种系中的Myb2 8片段。这些引物人工设计。
[0219]
【权利要求】
1.一种用于确定具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜植物的基因型的方法，包括从所述植物或其部分获得核酸样品并在所述核酸样品中检测与增加的硫代葡萄糖苷水平遗传关联的Myb28基因座处的多态性。
2.根据权利要求1的方法，其中所述检测步骤包括PCR。
3.根据权利要求1或2的方法，其中确定基因型包括共显性分析。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述检测步骤包括DNA杂交。
5.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述多态性包括以下至少一种: a)在对应于SEQ ID NO:1 的核苷酸 83、136、226、563、610、830、995、1116、1513、1577、1606、1620、1825、1863、1877或2026的位置处的单核苷酸多态性(SNP)，或 b)在SEQID NO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的核苷酸的多态性，或 c)在SEQID NO:1的核苷酸836和837之间、核苷酸867和868之间或核苷酸943和944之间存在的核苷酸的多态性。
6.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述多态性包括(a)在对应于SEQID NO:1的核苷酸 83、136、226、563、610、830、995、1116、1513、1577、1606、1620、1825、1863、1877 或2026或其组合的位置处的单核苷酸多态性(SNP)的至少一种；(b)在SEQ ID NO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的一个或多个核苷酸的缺失；(c)在·SEQ ID NO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的所有核苷酸的缺失；(d)对应于SEQ ID NO:1的核苷酸 324、325、326、327、328、329、330、331、522、523、784、785、910、911、912、913、1366、1367、1368、1812、1813、1814、1815、1816、1817、1818、1819、1820、2047、2048、2049、2050、2051、2052、2053、2054或2055的位置处至少一个核苷酸的缺失；(e)以下位置处核苷酸的缺失:SEQ ID NO:1 的 324-331、522-523、784-785、910-913、1366-1368、1812-1820 或 2047-2055或其组合；或者(f)SEQ ID NO:1的核苷酸836和837之间、核苷酸867和868之间或核苷酸943和944之间的一个或多个核苷酸的插入。
7.根据权利要求6的方法,其中(a)核苷酸836和837之间的插入是两个核苷酸的插入；(b)核苷酸836和837之间的插入是TT的插入；(c)核苷酸867和868之间的插入是一个核苷酸的插入；(d)核苷酸867和868之间的插入是A ;(e)核苷酸943和944之间的插入是13个核苷酸或最多13个核苷酸；或者(f)核苷酸943和944之间的插入是TATTAAAAAAGTAo
8.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述多态性通过包括使用选自以下的至少第一序列的筛选方法来检测:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:2U SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:23。
9.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述方法进一步包括针对增加的硫代葡萄糖苷水平分析十字花科蔬菜植物的表型。
10.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述硫代葡萄糖苷是4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)、3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP)或其组合。
11.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述十字花科蔬菜植物包含至少10微摩尔/g干重的量的至少一种硫代葡萄糖苷。
12.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述十字花科蔬菜植物包含至少10微摩尔/g干重的量的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)、3_甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP)或其组合。
13.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述十字花科蔬菜植物是花椰菜。
14.一种用于产生具有Myb2 8-介导的增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜植物的方法，该方法包括选择包含与增加的硫代葡萄糖苷水平遗传关联的Myb28基因座处的多态性的第一后代植物。
15.根据权利要求14的方法，该方法包括以下步骤:(a)使具有增加的硫代葡萄糖苷水平的十字花科蔬菜植物与第二十字花科蔬菜植物杂交；和(b)选择包含与增加的硫代葡萄糖苷水平遗传关联的Myb28基因 座处的多态性的至少第一后代十字花科蔬菜植物。
16.根据权利要求14或15的方法，其中所述选择步骤包括PCR。
17.根据权利要求14-16中任一项的方法，其中所述选择步骤包括DNA杂交。
18.根据权利要求14-17中任一项的方法，其中所述myb28等位基因通过包括使用包含选自以下的序列的寡核苷酸的筛选方法来检测:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22 和 SEQ IDNO:23o
19.根据权利要求14-18中任一项的方法，其中所述选择包括检测共显性遗传标志物。
20.根据权利要求15-19中任一项的方法，其中选择所述第一后代进一步包括基于一种或多种来自与至少第一附加性状遗传关联的第二十字花科蔬菜植物的遗传标志物的存在选择所述后代。
21.根据权利要求20的方法，其中所述附加性状选自产量、疾病抗性、突出体活力、生长性活力、应激耐受性、植物高度、花序质量、花序直径、花序重量、花序大小、花序形状、花序颜色和开花天数。
22.根据权利要求14-21中任一项的方法，其中所述多态性包括以下至少一种: a)在对应于SEQ ID NO:1 的核苷酸 83、136、226、563、610、830、995、1116、1513、1577、1606、1620、1825、1863、1877或2026的位置处的单核苷酸多态性(SNP)，或 b)在SEQID NO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的核苷酸的多态性，或 c)在SEQID NO:1的核苷酸836和837之间、核苷酸867和868之间或核苷酸943和944之间存在的核苷酸的多态性。
23.根据权利要求14-22中任一项的方法，其中所述多态性(a)包括在对应于SEQIDNO:1 的核苷酸 83、136、226、563、610、830、995、1116、`1513、1577、1606、1620、1825、1863、1877或2026或其组合的位置处的单核苷酸多态性(SNP)的至少一种；(b)包括在SEQ IDNO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的一个或多个核苷酸的缺失；(c)包括在SEQ ID NO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的所有核苷酸的缺失；(d)包括对应于 SEQ ID NO:1 的核苷酸 324、325、326、327、328、`329、330、331、522、523、784、785、`910、911、912、913、1366、1367、1368、1812、1813、1814、`1815、1816、1817、1818、1819、1820、`2047、2048、2049、2050、2051、2052、2053、2054 或 2055 的位置处至少一个核苷酸的缺失；(e)包括以下位置处核苷酸的缺失:SEQ ID NO:1 的 324-331、522-`523、784-785、910-913、1366-1368、1812-1820 或 2047-2055 或其组合；或者(f)包括 SEQ ID NO:1 的核苷酸 836和837之间、核苷酸867和868之间或核苷酸943和944之间一个或多个核苷酸的插入。
24.根据权利要求23的方法，其中(a)核苷酸836和837之间的插入是两个核苷酸的插入；(b)核苷酸836和837之间的插入是TT的插入；(c)核苷酸867和868之间的插入是一个核苷酸的插入；(d)核苷酸867和868之间的插入是A ； (e)核苷酸943和944之间的插入是13个核苷酸或最多13个核苷酸；或者(f)核苷酸943和944之间的插入是TATTAAAAAAGTA。
25.根据权利要求14-24中任一项的方法，该方法进一步包括步骤(c)使所述后代植物与其自身或第三植物杂交以产生后续世代的后代植物。
26.根据权利要求25的方法，其中所述方法进一步包括步骤(d)使所述后续世代的后代植物与其自身或第二植物杂交；和(e)重复步骤(c)和(d)另外3-10个世代以产生包含增加的硫代葡萄糖苷水平的近交的十字花科蔬菜植物，其中筛选至少一个后续世代的后代植物作为与硫代葡萄糖苷产生遗传关联的Myb28基因座处多态性的存在。
27.根据权利要求26的方法，其中基于硫代葡萄糖苷和所需性状的存在选择所述后续世代的后代植物用于杂交。
28.根据权利要求26或27的方法，其中基于增加的硫代葡萄糖苷水平和所需性状的存在在各个世代选择所述后续世代的后代植物用于杂交。
29.根据权利要求26-28中任一项的方法，其中步骤(e)以足够的近交进行重复以获得包括增加的硫代葡萄糖苷性状并另外包括第二十字花科蔬菜植物的农学性状的近交十字花科蔬菜植物。
30.根据权利要求14-29中任一项的方法，其中所述硫代葡萄糖苷是4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)、3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP)或其组合。
31.根据权利要求14-30中任一项的方法，其中所述十字花科蔬菜植物包含至少10微摩尔/g干重的量的至少一种硫代葡萄糖苷。
32.根据权利要求14-31中任一项的方法，其中所述十字花科蔬菜植物包含至少10微摩尔/ g干重的量的4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷(MSB)、3-甲基亚硫酰基丙基硫代葡萄糖苷(MSP)或其组合。
33.根据权利要求14-32中任一项的方法，其中所述十字花科蔬菜植物是花椰菜。
34.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述多态性是处于权利要求5-7或22-24中任一项的多态性的5cM之内的多态性。
35.根据权利要求14的方法，其中所述植物用除选自以下的至少一种多态性以外的包含SEQ ID NO:1的myb28基因转化: a)在对应于SEQ ID NO:1 的核苷酸 83、136、226、563、610、830、995、1116、1513、1577、1606、1620、1825、1863、1877或2026的位置处的单核苷酸多态性(SNP)，或 b)在SEQID NO:1的核苷酸323和332之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的核苷酸的多态性，或 c)在SEQID NO:1的核苷酸836和837之间、核苷酸867和868之间或核苷酸943和944之间存在的核苷酸的多态性。
36.根据权利要求24的方法，其中所述植物用包含SEQID NO:24或与SEQ ID NO:24具有至少97% (如至少98%或至少99% )同一性的序列的myb28基因转化。
37.通过权利要求14-36中任一项的方法产生的植物或其部分。
38.权利要求37的或通过权利要求14-37中任一项的方法产生的植物的种子。
39.权利要求1-13中任一项的方法，该方法进一步包括在计算机可读介质上储存检测多态性的步骤的结果的步骤。
40.通过权利要求39的方法产生的计算机可读介质。
41.一种产生十字花科蔬菜植物(例如花椰菜植物)的可食用部分的方法，包括:(a)获得权利要求37的植物；和(b)收集由所述植物产生的十字花科蔬菜植物的可食用部分(例如花椰菜植物的花序)。
42.一种分离的核酸，其包含选自 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12, SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:17, SEQID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:2U SEQ ID NO:22 和 SEQ ID NO:23的序列。
43.一种引物或探针，其扩增和/或杂交在对应于SEQ ID NO:1的核苷酸83、136、226、563、610、830、995、1116、1513、1577、1606、1620、1825、1863、1877 或 2026 的位置处的至少一个多态性；或扩增和/或杂交在对应于SEQ ID NO:1的核苷酸323和332的位置之间、核苷酸521和524之间、核苷酸783和786之间、核苷酸909和914之间、核苷酸1365和1369之间、1811和1821之间或核苷酸2046和2056之间存在的多态性；或扩增和/或杂交在SEQ ID NO:1的核苷酸836和837之间、核苷酸867和868之间或核苷酸943和944之间存在的多态性。
44.根据权利要求43的引物或探针，其扩增和/或杂交包含SEQID NO:1的核苷酸836和837、867和868或943和944之间的一个或多个核苷酸的插入的多态性。
45.根据权利要求44的引物或探针，其中(a)核苷酸836和837之间的插入是两个核苷酸的插入；(b)核苷酸836和837之间的插入是TT ; (c)核苷酸867和868之间的插入是一个核苷酸的插入；(d )核苷酸867和868之间的插入是A ;(e)核苷酸943和944之间的插入是13个核苷酸或最多13个核苷酸；或者(f)核苷酸943和944之间的插入是TATTAAAAAAGTA。
46.一种分离的核酸，其包含比对时在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:24之间保守的至少18个连续核苷酸的序列。
47.参照实施例和附图，一种总体上如本文所述的方法或植物或种子或引物或探针或分离的核酸。`
【文档编号】C12Q1/68GK103820538SQ201310429743
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2012年9月13日
【发明者】R·F·米森, M·特拉卡, B·W·布鲁格曼斯 申请人:塞米尼斯蔬菜种子公司, 植物生物科学有限公司