一种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法
【专利摘要】本发明涉及组织与细胞工程领域，尤其提供了一种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法，该方法通过显微操作法进行单细胞克隆制备，省去了传统方法中繁琐的细胞计数和反复稀释，能在短时间内完成单细胞克隆操作，提高了单细胞克隆形成率。通过本发明方法获得的乳腺上皮细胞，可以应用于研究不同世系乳腺上皮细胞的功能以及它们在泌乳过程中的相互作用。
【专利说明】一种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织与细胞工程领域，尤其提供了一种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法。
【背景技术】
[0002]乳腺上皮细胞是研究乳腺生长发育、泌乳机制以及验证乳腺组织特异性表达载体有效性的体外模型。成熟的乳腺实质中包括三种细胞，导管上皮、分泌上皮和肌上皮。近年来，研究者建立了众多的以乳腺上皮细胞为模型的细胞系，然而多数已有研究并不能合适地区别对待各世系细胞的功能以及它们在泌乳过程中的相互作用。
[0003]原代乳腺上皮细胞的获取方法主要有酶消化法、乳汁分离法以及组织块培养法等。无论是哪种方法获得的原代乳腺上皮细胞都是多世系细胞的混合体，为了纯化培养体系，研究者应用了一种或多种方法结合剔除混杂的细胞。密度梯度离心方法能够分离到较为纯净的同质细胞群体，此外差速消化法和差速贴壁法得到了更广泛的应用。然而这些纯化方法都不能根本上获得特定世系的乳腺组织细胞。
[0004]单细胞克隆技术已经广泛应用于单克隆抗体及其他治疗性蛋白的生产，通过该方法可以获得基因和表型一致的克隆群体。但是通过有限稀释法或者其他方法获得单细胞克隆群体，细胞都要面临在极低密度条件下生长的不利局面。多数研究表明，在极低密度条件下，细胞的克隆形成率很低。对于长期从事乳腺上皮细胞相关研究的实验室而言，如果能找到一种操作简便并且单细胞克隆形成率高的试验方法，将对实验室的科研工作十分有利。
【发明内容】
[0005]本发明基于上述原因，提供了一种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法，该方法通过显微操作法进行单细胞克隆制备，省去了传统方法中繁琐的细胞计数和反复稀释，能在短时间内完成单细胞克隆操作，提高了单细胞克隆形成率。通过本发明方法可获得遗传均一并保持其原有特性的山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆细胞群体，可以应用于研究不同世系乳腺上皮细胞的功能以及它们在泌乳过程中的相互作用。
[0006]本发明的具体技术方案是：
[0007]—种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法，包括以下步骤：
[0008]I)山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化；
[0009]2)单细胞克隆培养基的制备；
[0010]3)单细胞克隆的制备；
[0011]其中步骤I山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法，主要包括以下步骤：
[0012]I)组织取样：无菌采集山羊乳腺腺泡组织；发明人发现当选用纯种崂山奶山羊泌乳期30天的乳腺腺泡组织时，可以为后续工作取得更好的效果。
[0013] 2)分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞，具体步骤为：
[0014]a.用含有200U/mL青霉素和200 μ g/mL链霉素的PBS清洗上述获得的乳腺组织，并将其分割成O. 5-lmm3的小组织块；
[0015]b.用高浓度血清培养基浸润a中所述小组织块，以间隔O. 5cm接种于培养皿底，在37°C、5vt%浓度CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养4小时，上述高浓度血清培养基为含有50vt%FBS的DF12培养基；
[0016]其中所述的高浓度血清培养基为FBS和DF12以体积比I: I配制出的培养基；这也是本发明与现有技术的不同之一，现有技术中一般FBS和DF12是以体积比1:9的配比制备培养基，如下述步骤c中的培养液，但是在该步骤中发明人却采用了这种高浓度的血清培养基，实际上相当于传统方法中在培养皿底包被胶原的步骤，但是该步骤没有包被胶原那么繁琐，降低了操作的难度，能够起到较好的效果，主要体现在I.有利于组织块的贴壁，2.有利于组织细胞的游出与生长两个方面；同时，发明人在实验了现有技术中FBS和DF12以体积比1:9的配比制备培养基之后，发现这一培养基难以满足组织贴壁的需要，故而进行了多次实验和调整后，最终确定了采用FBS和DF12以体积比1:1配制出的培养基；采用这种培养基浸润组织块后可以实现快速贴壁，且这种培养基仅作为浸润时使用，并不用于后续的培养，而由于采用了组织贴壁法，相比与现有的酶消化法获得的细胞而言，这种方法避免了长时间酶消化可能对细胞造成的损伤。
[0017]c.向上述培养皿中加入培养液，使其刚好覆盖培养皿底，置于37°C、5vt%浓度CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养，12小时后补加培养液至完全浸没组织块为止，2天后更换半量培养液，以后每2天更换半量培养液，总共培养至少8天后即得混合其他细胞生长的乳腺上皮细胞，
[0018]上述培养液为体积比FBS ：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10 μ g/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗；上述所米用的各种材料均为市场上直接购得，在此不再赘述；
[0019]b步骤中，为了达到较好的效果且缩短整个操作的时间，一般将浸润时间控制在2_4min ；
[0020]3)纯化细胞：差速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞，得到纯化的乳腺上皮细胞，具体步骤如下：
[0021]a.差速消化法：向上述混合其他细胞生长的乳腺上皮细胞的培养物中加入消化液消化细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，待成纤维细胞脱离培养皿底壁时，吸弃消化液去除成纤维细胞，利用残留的消化液继续消化1-2分钟，加入培养液终止消化，将剩余的细胞吹打成单细胞悬液；
[0022]采用这种差速消化的方式，可以消化去除成纤维细胞，同时保留乳腺上皮细胞。在消化的过程中，成纤维细胞首先脱离底壁，漂浮在消化液中，而此时乳腺上皮细胞还没有被消化脱离底壁，此时将瓶内的消化液吸弃，从而将成纤维细胞和乳腺上皮细胞分离，由于底壁还会残留少量消化液，而且它足以使乳腺上皮细胞脱离底壁，所以不用再添加新鲜的消化液，此后终止消化、吹打均匀后再传代培养即可。
[0023]其中所述消化液为等体积混合的不含钙镁离子的PBS和O. 25wt%胰蛋白酶的EDTA溶液，消化条件为室温25°C，成纤维细胞消化时间为I. 5-2分钟，其中所采用的O. 25被％胰蛋白酶的EDTA溶液购自gibco公司，其英文名称为O. 25%Trypsin-EDTA, 一般使用时根据具体使用情况，控制消化液的用量过量即可保证全部消化完成；[0024]所述的培养液为体积比FBS ：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10 μ g/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗；
[0025]b.差速贴壁法：将上述的单细胞悬液移入新的培养皿中培养20分钟，待成纤维细胞贴壁后，转移培养液至另一个新的培养皿中继续培养，原培养皿添加新的培养液继续培养，如此转移3次，每次转移的时间间隔均为20分钟，12小时后更换培养液，以后每2天换液一次；
[0026]上述各培养皿培养3-4天后，选择其中纯化程度和生长密度最好的培养皿，重复步骤a和步骤b进行传代纯化，如此传至第4代即得到纯化的乳腺上皮细胞。
[0027]之所以采用b步骤这种方法，主要原因在于：由于贴壁速度的差异，通过转移含有细胞的培养液，将贴壁速度快的成纤维细胞留在原先的培养皿中，而未及时贴壁的乳腺上皮细胞转移到新的培养皿中，从而达到纯化乳腺上皮细胞的目的；
[0028]而再转移3次的意思是：将a步骤中获得的单细胞悬液依次转移经过4个培养皿，每个培养皿中停留20分钟，每次转移的均是培养皿中停留20分钟的培养液，这样就使得培养液中的细胞按顺序在4个培养皿中贴壁，由于成纤维细胞贴壁快于乳腺上皮细胞，所以转移经过的前两个培养皿，成纤维细胞快速贴壁，而后两个培养皿贴壁得到的是较为纯净的乳腺上皮细胞，每次转移后再在原培养皿中补加新鲜培养液继续培养，2-3天后比较各培养皿细胞形态，选择最佳继续纯化即可，而之所以限定总共转移的次数为3次，主要原因在于如果转移两次可能分离不彻底，转移次数过多贴壁存活的细胞也会大大减少，浪费试剂及实验材料。实验表明转移3次可以充分分离成纤维细胞，得到纯化的乳腺上皮细胞。
[0029]而之所以选择培养皿培养3-4天后进行传代纯化，主要原因就是采用本发明的方法后，一般需要上述的时间，才能保证贴壁细胞增殖并占据培养皿底壁面积的90%左右，才能达到传代的要求；而如果细胞贴壁很多，2天左右即可传代，如果贴壁较少，则需要生长更长时间才能传代，因此3-4天为一般性选择；
[0030]选择其中纯化程度和 生长密度最好的培养皿时，一般采用现有技术的常用方法进行判定，如观察细胞形态，本发明的具体做法是：鉴于成纤维细胞和上皮细胞的形态不同，这里选择的标准是显微镜下观察到的成纤维细胞数量最少，细胞形态一致生长密度最佳，选取这种培养皿继续进行纯化培养，其后期获得的乳腺上皮细胞纯化效果最好；
[0031]本发明的发明人发现，采用本发明的方法后，一般经过4代的纯化后就能得到形态一致的乳腺上皮细胞，再经过多次传代也没有出现成纤维细胞明显生长的现象，说明纯化4代即可得到充分纯化的乳腺上皮细胞，而低于4代则达不到最佳的纯化效果，故而选择纯化至第4代即可，纯化次数过多则会浪费大量细胞，而且会增加整个方法的成本。
[0032]除了上述的分离纯化方法外，可以采用现有技术中的分离纯化方法，只要能够提供乳腺上皮细胞即可；
[0033]而本发明的最重要特点则是：
[0034]步骤2单细胞克隆培养基的制备，具体包括如下步骤：
[0035]a.细胞培养基的配制：配制体积比FBS ：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10 μ g/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗；
[0036]b.细胞培养基处理：
[0037]在进行第四代传代培养的时候，在细胞传代24小时后，将培养基更换成上述全新的培养基，继续培养6-8小时后收获培养基，离心除去杂质、微孔滤膜过滤除菌，分装后置于_20°C冰箱保存备用；
[0038]其中所述的滤膜孔径大小为O. 20 μ m ;
[0039]c.单细胞克隆培养基的配制：将上述处理获得的培养基与步骤a配制的细胞培养基等体积混合，再加入0.05倍体积的FBS，分装后置于_20°C冰箱保存备用；这样就可以获得细胞生长产生的有益因子，以帮助单细胞的生长；
[0040]步骤3单细胞克隆的制备，[0041]a.消化细胞：消化第四代山羊乳腺上皮细胞并吹打成单细胞悬液；
[0042]b.稀释细胞悬液：移取201^细胞悬液稀释于含有51^、371：预热后的单细胞克隆培养基的60mm培养皿中，吹打均匀，一般控制使其在40倍视野下观察到细胞之间有较大间距；
[0043]c.单细胞显微操作：在40倍视野下用IOyL微量移液器吸取单个细胞，接种于含有37°C预热后的单细胞克隆培养基的24孔板中；[0044]上述a步骤中，所采用的消化方式为胰蛋白酶常规消化方式，采用常用的实验用
O.25%胰蛋白酶、37°C、2-5分钟即可完成；
[0045]上述操作过程在25分钟之内完成，其主要原因在于：操作时间过长会明显降低细胞的成活率，控制缩短操作时间有利于减少细胞在不良外界环境中的暴露时间，提高单细胞克隆形成率。
[0046]d.传代培养：培养观察并选取合适的单细胞克隆群落。
[0047]将培养板置于培养箱中静置培养，24小时后在倒置显微镜下观察,标记含有1-3个细胞的培养孔并补加500 μ L单细胞克隆培养基；总共培养48-72小时后，在显微镜下用无菌枪头剔除多余的细胞，使得选定的每孔含有一个细胞，更换单细胞克隆培养基后继续培养；以后每48小时更换一半培养液并观察，4-5天后即可得到单细胞克隆群落。
[0048]上述筛选出的单细胞克隆群落即可采用常规方法对单细胞克隆群落进行传代和培养。
[0049]与现有技术相比，本发明在单细胞克隆阶段采用了特殊的单细胞克隆培养基，该培养基由新配制的培养基、经过细胞培养处理后的培养基以及额外添加的胎牛血清（FBS)组成，采用这种构成的单细胞克隆培养基，较之现有技术有了很大的进步，其原因在于经过处理后，单细胞克隆培养基内增加了促进细胞生长分裂的有益因子，同时加上额外添加的血清，能够明显提高单细胞克隆的形成率。
[0050]另外，本发明的发明人一改传统的96孔板单克隆培养方法，采用了 24孔板单克隆培养方法，这样就缩短制备单克隆操作所需要的时间和扩大单细胞克隆群的选择空间。实验发现，单克隆制备所需要的时间越长，细胞的存活率就越低，这是因为在制备过程中，细胞长时间处于不利的外界环境中造成的。使用24孔板制备单细胞克隆的时间明显低于96孔板，有利于保持细胞的活力，提高细胞的成活率，因此本方法也对操作所需时间做了限定；使用96孔板制备单细胞克隆，通常只选留含有一个细胞的板孔继续培养，然而实际操作中，不含有细胞或者含有多于一个细胞的板孔不在少数，因而选择空间有限，而使用孔口较大的24孔板时，可以对多于I个细胞的板孔进行剔除多余细胞或者在多个细胞中选择生长最佳的细胞，这样做能明显提高单克隆的形成率。[0051]除此之外，在乳腺上皮细胞分离与纯化过程中，采用了 FBS和DF12以体积比1:1配制出的高浓度血清培养基，浸润小组织块后直接贴壁培养，分离得到乳腺上皮细胞。使用该方法不但避免了长时间酶消化可能对细胞造成的损伤，同时省去了传统方法中制备胶原的步骤，获得了组织贴壁良好，细胞生长旺盛的混合培养体系。纯化法中采用的消化液的浓度、消化成纤维细胞的时间、温度以及差速贴壁时细胞转移的次数和转移时间间隔均为本发明所特有，与现有技术有着较大的差距。本方法的特点是采用组织贴壁法分离细胞，低浓度胰蛋白酶快速消化分离成纤维细胞，最大限度降低了酶消化对细胞造成的不良影响，同时结合连续转移的纯化方法保证了上皮细胞的纯度、活力以及其本身固有的特性。
[0052]综上所述，本发明提供的方法省去了传统方法中繁琐的细胞计数和反复稀释，能在短时间内完成单细胞克隆操作，提高了单细胞克隆形成率，传统方法制备单细胞克隆的克隆形成率很低，而本研究中使用的制备方法，可使克隆形成率提高至80%以上；通过本发明方法可获得遗传均一并保持其原有特性的山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆细胞群体，可以应用于研究不同世系乳腺上皮细胞的功能以及它们在泌乳过程中的相互作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0053]图I是组织块培养法获得的第一代混合生长的乳腺细胞；
[0054]图2是纯化的第4代乳腺上皮细胞；
[0055]图3是生长至第5天的单细胞克隆群落；
[0056]图4是传代培养的单克隆乳腺上皮细胞；
[0057]图5是单克隆乳腺上皮细胞角蛋白免疫荧光鉴定结果图；
【具体实施方式】
[0058]下面通过具体的制备实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和试验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
[0059]实施例I山羊乳腺上皮细胞的取样与处理
[0060]采用现有技术直接无菌采集青岛奥特种羊场纯种崂山奶山羊泌乳期30天的乳腺组织；
[0061]用PBS冲洗采集的乳腺组织块，除去其表面的血液和羊奶；冲洗干净后浸入含有200U/mL青霉素和200 μ g/mL链霉素的DFl2培养基中，置于冰盒内迅速带回实验室处理，用含有200U/mL青霉素和200 μ g/mL链霉素的PBS反复冲洗乳腺组织，直到冲洗液变清亮为止，在超净台上分割修剪，去除脂肪组织和结缔组织并冲洗至冲洗液清亮，即可得到白色颗粒状的腺泡组织。
[0062]实施例2组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞
[0063]a.用眼科剪和眼科镊将上述白色颗粒状的腺泡组织分割成O. 5-lmm3左右的小组织块，再用含有200U/mL青霉素和200 μ g/mL链霉素的PBS漂清获得的小组织块；
[0064]b.用FBS和DF12以体积比I: I配制出的培养基浸润所述小组织块2_4分钟，间隔
O.5cm接种于培养皿底，置于37°C、5vt%浓度CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养4小时；
[0065]c.向上述培养皿中加入培养液，使其刚好覆盖培养皿底，置于37°C、5vt%浓度CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养，12小时后补加培养液至完全浸没组织块为止，2天后更换半量培养液，以后每2天更换半量培养液，5天左右可以看到组织块周围有细胞迁出，8天左右可以看到混合生长的乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
[0066]将原代细胞消化传代，即可得到更为明显的混合生长的乳腺上皮细胞和成纤维细胞。如图I所示，岛屿状聚集生长的椭圆形或铺路石状细胞为乳腺上皮细胞，乳腺上皮细胞周围游离生长的长形或梭形细胞为成纤维细胞。
[0067]上述培养液为体积比FBS ：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10 μ g/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗。
[0068]实施例3
[0069]速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞，得到纯化的乳腺上皮细胞，具体步骤如下：
[0070]a.差速消化法：向上述混合其他细胞生长的乳腺上皮细胞的培养物中加入消化液消化细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态变化，待成纤维细胞脱离培养皿底壁时，吸弃消化液去除成纤维细胞，利用残留的消化液继续消化1-2分钟，加入培养液终止消化，将剩余的细胞吹打成单细胞悬液；
[0071]其中所述消化液为等体积混合的不含钙镁离子的PBS和O. 25%Trypsin-EDTA溶液，消化条件为室温25°C，成纤维细胞消化时间为I. 5-2分钟；
[0072]所述的培养液为体积比FBS ：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10 μ g/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗；
[0073]b.差速贴壁法：将上述的单细胞悬液移入新的培养皿中培养20分钟，待成纤维细胞贴壁后，转移培养液至另一个新的培养皿中继续培养，20分钟后再次转移到新的培养皿中，如此转移3次，原培养皿添 加新的培养液继续培养，12小时后更换培养液，以后每2天换液一次，直至贴壁生长的细胞占据培养皿底面积的90%左右，时间一般为3-4天；
[0074]选择步骤b中纯化程度和生长密度最好的培养皿，重复步骤a和步骤b进行传代纯化，如此传至第4代即得到纯化的乳腺上皮细胞。如图2所示，细胞形态整齐，呈椭圆形或铺路石状，为典型的上皮细胞形态。
[0075]实施例4单细胞克隆培养基的制备，具体包括如下步骤：
[0076]a.细胞培养基的配制：配制体积比FBS ：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10 μ g/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗；
[0077]b.细胞培养基处理：
[0078]在进行第四代传代培养的时候，在细胞传代24小时后，将培养基更换成上述全新的培养基，继续培养6-8小时后收获培养基，离心除去杂质、微孔滤膜过滤除菌，分装后置于_20°C冰箱保存备用；
[0079]其中所述的滤膜孔径大小为O. 20 μ m ;
[0080]c.单细胞克隆培养基的配制：将上述处理获得的培养基与步骤a配制的细胞培养基等体积混合，再加入0.05倍体积的FBS，分装后置于_20°C冰箱保存备用；这样就可以获得细胞生长产生的有益因子，以帮助单细胞的生长。
[0081]实施例5单细胞克隆的制备，
[0082]a.消化细胞：消化第四代山羊乳腺上皮细胞并吹打成单细胞悬液；
[0083]b.稀释细胞悬液：移取201^细胞悬液稀释于含有51^、371：预热后的单细胞克隆培养基的60mm培养皿中，吹打均匀，使其在40倍视野下观察到细胞之间有较大间距；
[0084]c.单细胞显微操作：在40倍视野下用IOyL微量移液器吸取单个细胞，接种于含有37°C预热后的单细胞克隆培养基的24孔板中；
[0085]上述a步骤中，所采用的消化方式为胰蛋白酶常规消化方式，采用常用的实验用O. 25%胰蛋白酶、37°C、2-5分钟即可完成；
[0086]上述操作过程在25分钟之内完成，其主要原因在于：操作时间过长会明显降低细胞的成活率，控制缩短操作时间有利于减少细胞在不良外界环境中的暴露时间，提高单细胞克隆形成率。
[0087]d.传代培养：培养观察并选取合适的单细胞克隆群落。
[0088]将培养板置于培养箱中静置培养，24小时后在倒置显微镜下观察,标记含有1-3个细胞的培养孔并补加500 μ L单细胞克隆培养基；总共培养48-72小时后，在显微镜下用无菌枪头剔除多余的细胞，使得选定的每孔含有一个细胞，更换单细胞克隆培养基后继续培养。以后每48小时更换一半培养液并观察，4-5天后即可得到单细胞克隆群落，如附图3所示，单细胞分裂增殖形成近似圆形的单克隆群落。传代后得到形态一致的乳腺上皮细胞，如附图4所示，细胞呈椭圆形，为典型的上皮细胞形态。
[0089]实施例6上皮细胞角蛋白免疫荧光鉴定
[0090]对传代培养的单细胞克隆山羊乳腺上皮细胞进行角蛋白18免疫荧光鉴定，所用方法参照武汉博士德生物工程有限公司免疫荧光试剂盒说明书，操作完成后用Hoechst33342复染细胞核，倒置荧光显微镜观察并拍照，其结果如图5所示。图中红色荧光部分为表达于细胞质中的角蛋白18，蓝色部分为Hoechst33342染色的细胞核，本实验结果说明了本发明通过单细胞克隆法获得的细胞类型为奶山羊乳腺上皮细胞。
【权利要求】
1.一种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法，包括以下步骤： 1)山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化； 2)单细胞克隆培养基的制备； 3)单细胞克隆的制备； 其特征在于： 所述步骤2单细胞克隆培养基的制备，具体包括如下步骤： a.细胞培养基的配制：配制体积比FBS：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10μ g/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗； b.细胞培养基处理： 在进行第四代传代培养的时候，在细胞传代24小时后，将培养基更换成上述全新的培养基，继续培养6-8小时后收获培养基，离心除去杂质、微孔滤膜过滤除菌，分装后置于_20°C冰箱保存备用； c.单细胞克隆培养基的配制：将上述处理获得的培养基与步骤a配制的细胞培养基等体积混合，再加入0.05倍体积的FBS，分装后置于_20°C冰箱保存备用； 所述步骤3单细胞克隆的制备，具体步骤如下： a.消化细胞：消化第四代山羊乳腺上皮细胞并吹打成单细胞悬液； b.稀释细胞悬液：移取2(^1^细胞悬液稀释于含有51^、371：预热后的单细胞克隆培养基的60mm培养皿中，吹打均匀； c.单细胞显微操作：在40倍视野下用IOyL微量移液器吸取单个细胞，接种于含有37°C预热后的单细胞克隆培养基的24孔板中； 上述a步骤中，所采用的消化方式为胰蛋白酶常规消化方式，采用常用的实验用O. 25%胰蛋白酶、37°C、2-5分钟即可完成； d.传代培养：培养观察并选取合适的单细胞克隆群落： 将培养板置于培养箱中静置培养，24小时后在倒置显微镜下观察，标记含有1-3个细胞的培养孔并补加500 μ L单细胞克隆培养基；总共培养48-72小时后，在显微镜下用无菌枪头剔除多余的细胞，使得选定的每孔含有一个细胞，更换单细胞克隆培养基后继续培养；以后每48小时更换一半培养基并观察，4-5天后即可得到单细胞克隆群落。
2.根据权利要求1所述的获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法，其特征在于：所述步骤（I)山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化主要包括以下步骤： O组织取样：无菌采集山羊乳腺腺泡组织； 2)分离细胞：组织块培养法分离乳腺上皮细胞和成纤维细胞； 3)纯化细胞：差速消化法结合差速贴壁法除去成纤维细胞即可得到纯化的乳腺上皮细胞。
【文档编号】C12N5/071GK103484424SQ201310430440
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】王建民, 陈存仙, 董飞, 王桂芝, 张赛赛, 秦孜娟 申请人:山东农业大学