重组Ⅱ型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体展示颗粒及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物领域，特别涉及重组猪圆环病毒PCV2-Cap/Phage展示颗粒的制备和运用，重组Ⅱ型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体展示颗粒的制备方法，具体包括：1）优化编码Ⅱ型猪圆环病毒的衣壳蛋白的核苷酸，2）重组质粒的构建，3）重组噬菌体基因组的构建，4）重组Ⅱ型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体展示颗粒的制备四个步骤；经动物实验证明重组展示颗粒具有良好的抗原性，可以刺激猪机体产生良好的体液免疫和细胞免疫反应，能够防控II猪圆环病毒感染；本工艺复制所需要的时间短；重组展示颗粒生产成本低；产品使用便捷，保存简单方便，克隆产量高。
【专利说明】重组II型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体展示颗粒及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物领域，特别涉及重组猪圆环病毒PCV2_Cap/Phage展示颗粒的制备和运用。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒(Porcinecircovirus, PCV)为 Tischer (1974)在 PK-15 细胞系中发现的一种无囊膜、无CPE的细胞污染物；于1982年鉴定为单股环状DNA病毒。它是目前发现的最小的一种脊椎动物病毒，分类上属于圆环病毒科圆环病毒属。猪圆环病毒分为不致病猪圆环病毒I型(PCVl)及致病性猪圆环病毒2型(PCV2，下同)两种病毒。
[0003]猪圆环病毒病(PCVD)是由PCV2病毒引起的断奶猪多系统衰竭综合征(Postweaning systemic wasting syndrome,PMWS)是公认的危害全球养猪业的重大经济影响性疾病，同时也是我国养猪业继猪瘟和蓝耳病之后的第三大传染病。PCV2急性感染损害猪免疫系统，造成免疫系统紊乱，产生免疫抑制，使机体免疫力下降，最终导致死亡率急剧上升。同时PCV2可与其他多种病原混合感染、大大降低猪场生产成绩。目前，我国绝大多数猪场的猪群均已感染猪圆环病毒。猪圆环病毒病可能给猪场带来严重的经济损失，其导致的直接经济影响主要表现为:猪群保育期和生长育肥期的高死亡率，以及受疾病影响，猪出栏重无法达到要求等；间接经济影响则包括:猪场为控制细菌混合感染而不得不增加抗生素用量，改变猪场管理 办法，以尽可能减少疾病发生，增加养猪的成本等。
[0004]PCV2基因组为单股环状负链DNA，全长1768bp或1767bp。已有的资料显示，PCV2的基因组共编码11个开放阅读框(Open reading frames, 0RF),其中主要的阅读框为ORFl和0RF2。ORFl功能是与病毒的复制转录有关(Mankertz et al.1998)，为最大的阅读框;0RF2的功能是编码病毒的衣壳(Cap)蛋白，共有702bp核苷酸，位于基因组的互补链上，编码233个氨基酸。Cap蛋白的N-端65~87aa、113~147aa、157~183aa区域及C端的4个氨基酸为病毒的主要抗原位点。其中的N端69~83aa和117~131aa两个抗原位点具有针对PCV2型特异性；能被PCV2多抗所识别，N端157~183aa抗原位点为PCVl和PCV2共同具有。尽管PCVl和PCV2的Cap蛋白存在一个共同的抗原位点，但血清学实验显示两种血清型的Cap蛋白之间不存在抗原交叉性。Cap蛋白是PCV2病毒粒子的结构蛋白，具有良好的免疫原性，能诱导产生较强的抗体反应，是构建重组疫苗和临床检测的首选抗原。因此，大量地生产Cap蛋白是将其应用于疫苗研制中急需克服的问题。
[0005]有效疫苗免疫是预防和控制猪圆环病毒感染的关键。疫苗免疫通过特异性地刺激机体的免疫系统，产生抗病毒抗体、细胞免疫力以及免疫记忆，以清除病毒。利用传统的猪肾细胞培养技术生产圆环病毒灭活疫苗，病毒效价低，抗原含量不足，产量低。目前，国内猪圆环病毒II型(PCV2)灭活疫苗产量低，价格高，限制了该类产品的推广和应用。尽管国外已有上市的亚单位疫苗，能够显著地降低病毒学症，但价格昂贵。此外，关于使用酵母和杆状病毒表达0RF2蛋白的报道，但酵母表达系统繁琐，存在蛋白切割的问题，杆状病毒则存在表达成本高，蛋白纯化困难等缺点。
[0006]本发明是基于上述现有技术，并针对现有技术的不足进行改进发明的。
【发明内容】
[0007]有鉴于此，本发明的目的在于提供重组II型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体(以下简称PCV2_Cap/Phage)的展示颗粒及其制备方法，以及制备重组PCV2_Cap/Phage展示颗粒所需的关键基因、重组质粒等。
[0008]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
[0009]PCV2-Cap蛋白(II型猪圆环病毒的衣壳蛋白的简称)在制备重组PCV2_Cap/Phage展示颗粒中的应用，所述CV2-Cap蛋白的氨基酸序列以如SEQID NO:4所示的氨基酸序列。
[0010]如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列如下:
[0011 ] “MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTIKRTTVKTPSWAVDMMRFNINDFLPPGGGSNPRSVPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTAGNVDHVGLGTAFENSIYDQEYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLNP”，其中，上述以大写首字母对应的氨基酸及氨基酸简写详见【具体实施方式】部分。
[0012]编码II型猪圆环 病毒的衣壳蛋白的表位氨基酸的核苷酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，该核苷酸序列在保证编码氨基酸相同的前提下，把序列中稀有的密码子替换成为大肠杆菌偏爱的密码子，在序列的两段上面加上E.coRI, HindIII双酶切位点(即起始端:5，-端-EcoR I酶切位点5’ -GAATTC ;终止端:3’ -端-Hind III酶切位点aagctt-3’，总计合成DNA序列长度为714bp，要求序列内部不出现EcoRI和HindIII的作用位点。
[0013]^gaattcatgacttatccgcgtcgtcgctatcgtcgtcgccgtcaccgcccacgttcccatctgggtcagatcctgcgtcgtcgtccgtggctggtacatccgcgccaccgctaccgttggcgccgtaaaaacggtattttcaacacccgtctgtctcgtaccttcggttacactatcaaacgtaccaccgtgaagaccccttcttgggcagttgacatgatgcgcttcaacatcaacgacttcctgccgccaggcggtggttccaacccgcgttccgttccgtttgaatactaccgcattcgtaaagtgaaagttgagttctggccgtgctctccgattacgcagggcgaccgtggtgttggctcttctgcggttatcctggatgataatttcgtaacgaaagctactgctctgacctacgacccgtacgtcaattactctagccgccacaccattacccaaccgttctcttaccacagccgttacttcacgccgaaaccggtactggattccaccatcgactattttcagccgaacaataagcgtaaccagctgtggctgcgtctgcaaactgccggtaacgtggatcacgttggcctgggcactgcgtttgagaacagcatctatgaccaggaatataacatccgtgtgaccatgtacgtccagttccgcgaatttaacctgaaagatcctccactgaacccgtaaaagctt，，。
[0014]以如SEQ ID NO:1所示的DNA为模板，在扩增体系下进行PCR扩增，循环30次，得PCR产物:PCR扩增所设计并合成的上游引物为5’ -RRctRcaRRaattcatRactt-3? (SEQ IDNO: 2),下游引物为 5’ -tcgataagcttgtacgggttc-3’ (SEQ ID NO: 3);将所得 PCR 产物纯化后，经过E.coRI, HindIII双酶切，回收酶切产物；将酶切产物与同样经过E.coRI, HindIII双酶切的线性表达载体pET28a ( + )连接，得重组质粒。
[0015]重组噬菌体基因组，将所述的重组质粒用E.coRI, HindIII进行双酶切，酶切产物与具有相同粘端的T7噬菌体载体(型号:T7SelectlO-3b，载体图详见图7)试剂盒中的双臂连接，得重组噬菌体基因组。[0016]运用所述的重组噬菌体基因组制备重组PCV2_Cap/Phage展示颗粒，将所述重组噬菌体基因组经过体外包装后，转染宿主菌E.coli BLT5403，通过培养裂解宿主菌，得到重组PCV2_Cap/Phage展示颗粒。
[0017]所述的重组PCV2_Cap/Phage展示颗粒在制备防控PCV2感染的疫苗中的应用。
[0018]所述的重组PCV2_Cap/Phage展示颗粒在制备II型猪圆环病毒抗原中的应用。
[0019]所述的重组PCV2_Cap/Phage展示颗粒的制备方法,具体包括以下步骤:
[0020]A优化PCV2_Cap蛋白的核苷酸
[0021]以GenBank中编号为HM565924.1的衣壳蛋白，即Cap蛋白的核苷酸序列作为模板,优化后,其序列如SEQ ID NO:1所示，进行人工合成；
[0022]B重组质粒的构建
[0023]以人工合成的核苷酸为模板，进行PCR扩±曾，上游弓丨物为5’-RRctRcaRRaattcatRactt-3’,下游弓丨物为5’-tcgataagcttgtacgggttc-3’，循环30次，得PCR产物;将所得PCR产物纯化后，经过E.coRI, HindIII双酶切，回收酶切产物;将酶切产物与同样经过E.coRI, HindIII双酶切的线性表达载体pET28a⑴连接,得重组质粒；
[0024]C重组噬菌体基因组的构建
[0025]将所述的重组质粒用E.coRI, HindIII进行双酶切，酶切产物与具有相同粘端的T7噬菌体载体(型号:T7selectlO-3b)试剂盒中的双臂连接，得重组噬菌体基因组；
[0026]D重组PCV2_Cap/Phage展示颗粒的制备
[0027]将所述重组噬菌体基因组经过体外包装后，转染宿主菌E.coli BLT5403,通过培养裂解宿主菌，得到重组PCV2_Cap/Phage展示颗粒。
[0028]进一步,所述的制备方法,将步骤D所得重组PCV2_Cap/Phage展示颗粒通过离心处理，得浓缩重组PCV2_Cap/Phage展示颗粒。
[0029]本发明的有益效果在于:利用噬菌体展示系统对PCV2_Cap蛋白进行高效表达展示，可以获得更高含量的抗原蛋白，且下游处理工艺更加成熟，对圆环病毒的检测防控都有巨大的应用价值。噬菌体展示系统成熟，具有以下的优点:噬菌体展示颗粒的基因组大，可以容纳的IOkb左右外源DNA且不影响复制，还可以同时进行多个外源片段的表达。噬菌体展示颗粒有明显的宿主界限，对脊椎动物无致病性，也不能够在脊椎动物细胞内复制表达，更不能整合。因此，对众多生物具有很高的安全性。噬菌体感染宿主后产生大量的噬菌体颗粒，高效展示PCV2-Cap蛋白。加之，噬菌体感染的宿主菌为大肠杆菌工程菌，其遗传背景清楚，培养操作简单、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产等优点。因此，以感染效率高、增殖周期短、纯化成本低廉、稳定性高的噬菌体作为PCV2保护性抗原(基因)的投递系统，展示蛋白位于颗粒的外表，是一种克服用传统方法获得PCV2抗原成本高的问题，以及PCV2亚单位疫苗免疫原性弱的不足。本工艺复制所需要的时间短；重组展示颗粒生产成本低；产品使用便捷，保存简单方便，克隆产量高。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为不同GenBank号的PCV2_Cap氨基酸序列比较分析。
[0031]图2为人工合成序列与原序列的比较分析，其中，>0ri DN:为>GenBank:HM565924.1即原序列，>Modify DN:为优化合成的编码PCV2_Cap蛋白的DNA序列，>Consensus:两DNA序列比较的一致性结果。
[0032]图3为重组质粒pET28a(+)_Cap的E.coRI, HindIII双酶切鉴定图。
[0033]图4为重组PCV2-0RF2表达鉴定，经IPTG诱导，在0h，2h，4h，6h，8h，IOh等不同时相内产生的融合蛋白SDS-PAGE电泳图。
[0034]图5为重组PCV2_Cap/Phage的噬菌体斑进行PCR鉴定的电泳图，结果表明重组PCV2-Cap/Phage展示颗粒构建成功，其中，图5-A为PCV2_Cap-Phage噬菌体斑，图5-B为随机噬菌体斑的PCR鉴定。[0035]图6为用猪圆环病毒II型抗体酶联免疫检测试剂盒测定血清中的PCV2抗体效价进行猪抗体消长规律分析图。
[0036]图7 为 T7selectl0_3b 的载体图。
【具体实施方式】
[0037]以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0038]部分氨基酸相应的缩写如下:
[0039]谷酰胺gin Q ;甘氨酸gly G ;丝氨酸ser S ;丙氨酸ala A ;苏氨酸thrT ;缴氨酸val V;异亮氨酸ile I ;亮氨酸leu L;酪氨酸tyr Y;苯丙氨酸phe F ;组氨酸his H ;脯氨酸pro P;天冬氨酸asp D ;甲硫氨酸met Μ;谷氨酸glu E;色氨酸trp W ;赖氨酸Iys K ;半胱氨酸cys C ;精氨酸arg R0
[0040]实施例1 II型猪圆环病毒衣壳蛋白的研究
[0041]从GenBank中下载不同时期登录的、不同GenBank号的PCV2_Cap的氨基酸序列，进行比对分析。结果发现编码PCV2-Cap氨基酸序列相似性高，氨基酸序列比较保守，这与PCV2-Cap蛋白是PCV2病毒粒子的结构蛋白的特征相符，如图1所示。最后确定PCV2(GenBank:HM565924.1)编码的衣壳蛋白(Cap蛋白)序列作为研究模板，其氨基酸序列如SEQID NO:4 所示。
[0042]在前述PCV2_Cap蛋白分析的基础上，结合卩遼菌体T7Select Phage DisplaySystem的宿主菌为大肠杆菌(E.coli BL5403)的特点，设计并优化编码PCV2_Cap的核酸序列。方法是在保证编码氨基酸相同的前提下，把序列中稀有的密码子替换成为大肠杆菌偏爱的密码子，在序列的两段上面加上E.coRI, HindIII双酶切位点(即起始端:5’-端-EcoRI酶切位点5’ -gaattc ;终止端:3’ -端-Hind III酶切位点AAGCTT-3’，总计合成DNA序列长度为714bp，要求序列内部不出现EcoRI和HindIII的作用位点。优化序列与原序列比较分析，出现较大程度上的碱基同义替代，详见图2。
[0043]优化编码PCV2_Cap的核酸序列交由上海生工生物工程技术服务有限公司人工合成，得合成的DNA序列，如SEQ ID N0:2所示。同时，根据合成的DNA序列，设计一对引物(上游引物Pl:5，-ggctgcaggaattcatgactt_3，，红色为EcoRI酶切位点，下划线为EcoRI酶切位点的保护性碱基；下游引物P2为:5，-tcRataaRcttRtacRRRttc_3，，红色为HindIII酶切位点，下划线为HindIII酶切位点的保护性碱基，引物交由上海生工合成)。之后，进行PCR。扩增体系为:合成序列Ι.Ομ 1，上下游引物(20pmol/L)各1.0 μ 1，dNTPs (2.5mmol/L) 4.Ομ I, Taq0.5μ I, IOXEx Taq? buffer5 μ I, Ex Taq? DNA 聚合酶 0.5 μ 1，去离子水37 μ L ；PCR反应条件:预变性3min，进入PCR循环，94°C变性45s，55。。退火55s，72。。延伸40s，进行30个循环后，72°C延伸IOmin。反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增，并对PCR产物用OMGA胶回收试剂盒回收纯化。
[0044]实施例2重组质粒的制备
[0045]将实施例1所得的PCR产物，即回收纯化的DNA片段经过E.coRI, HindIII双酶切，电泳检测回收大约为720bp的目的片段，与同样经过E.coRI, HindIII双酶切的线性表达载体pET28a ( + )连接。连接体系为:目的片段5.0μ 1，线性pET28a ( + )载体L O μ 1，T4DNAligasel.00 μ 1,10XT4DNA ligase buffer 1.0 μ I, ddH202.0 μ L.4°C 连接过夜，获得重组质粒 pET28a (+) -Cap。
[0046]实施例3转化及蛋白的表达
[0047]取实施例2制备的重组质粒pET28a(+)-CaplO μ I与100 μ I BL21感受态细胞混合，冰浴30min，42°C热击90s后，迅速置冰浴中，静止2min，加入800 μ I无抗生素的LB培养基，37 0C 150rpm摇床培养45min后，5000rpm离心5min，弃去上清，留200 μ I将菌体吹匀后涂布含kana，100 μ g/ml的LB平板，37°C温箱倒置培养12_16h ;次日挑选白色单菌落，用含kana的LB培养基小量扩增培养；0MGA试剂盒小量提取质粒；分别经E.coRI, HindIII双酶切鉴定，酶切体系同前，结果如图3。将鉴定的阳性的重组菌命名为pET28a-Cap/BL21并进行序列测定分析。
[0048]取空载菌(pET28a/BL21)和鉴定阳性克隆菌(pET28a_Cap/BL21)，按照1:100的比例转接到含Kana的LB培养基中，37°C振荡培养至对数生长期时，OD600值为0.6，加入IPTG诱导表达，取不同时相的 菌液3mL,大约培养间隔2h,共取样6次。12000rpm离心Imin,去掉LB培养液。干燥后加入50 μ I去离子水，并加入溶菌酶2 μ 1，振荡混匀4°C过夜。12000rpm离心lmin，分别取含溶菌酶的上清和菌体沉淀，加2XSDS-PAGE上样缓冲液20 μ I。100°C煮沸5min。取5μ I上清液进行12%SDS_PAGE电泳(方法是将配制好的12%的分离胶加入玻璃板间，留出灌制积层胶所需的空间(梳子的齿长再加1cm)，并在胶的上方加入去离子水H2O ;待分离胶凝固后30min。吸出上层的水，加入配制好的5%的浓缩胶，并将样品梳插入浓缩胶中，浓缩胶凝固后30min，拔出梳子，用蒸馏水把加样孔彻底冲洗干净。然后，加满电泳液。)结果显示，pET28a-Cap/BL21在30kD处有一条很浓的蛋白质条带，与预期的目的条带大小相符，空白组菌pET28a/BL21则无此条带，说明PCV2_Cap蛋白已经得到了表达，如图4所示。
[0049]实施例4重组T7噬菌体基因组的构建及其体外包装
[0050]采用OMGA质粒提取试剂盒，小量提取用上述实施例方法制备的重组质粒pET28a(+)-Cap，用E.coRI, HindIII进行双酶切，酶切体系为:E.coRIl.0μ I, HindIIIl.0μ I,重组质粒 pET28a_Cap34 μ 1，10XBuffer4.0 μ I，37 °C酶切过夜。电泳检测，收集酶切的、具有粘端的线性化DNA序列，与相同粘端的T7噬菌体载体(型号:T7SelectlO-3b)试剂盒中的双臂连接。连接体系为:粘端 PCV2-0RF2DNA2.5 μ 1，T7Select Vector Armsl.0 μ I, IOXLigaseBuffer0.5 μ I, T4Ligasel.0 μ I, 16°C连接过夜，获得重组 PCV2_0RF2_Phage 基因组，即重组T7噬菌体基因组。[0051]体外包装的方法为:从-80°C的冰箱中取I支T7Select Packaging Extract,冰上融化；向保存的连接体系中添加入25 μ I包装物，轻微地混匀；16°C -22°c孵育2h ;转移包装好的物质至一个消毒的1.5ml Eppendorf管中，加入270 μ I灭菌的LB培养基,终止反应；长时间保存，加入20 μ I氯仿，轻轻混匀后，4°C保存。
[0052]取宿主菌BLT5403划线接种LB (amp抗性)培养基，37°C培养箱过夜培养。挑一个单克隆菌落于50ml的amp抗性的液体培养基中，37°C，150rpm摇动约5h，分光光度计测定OD600值，当OD6tltl在0.6-1.0之间时。贮存宿主菌在4°C，直到被使用，但不能够保存过48h。用灭菌的LB为稀释液，取10 μ I包装好噬菌体，作1:100倍稀释，稀释成为4管。
[0053]取包装的噬菌体和不同倍比稀释的噬菌体约100 μ 1，加入的菌液250 μ 1，混匀后加3ml预热的并保温50°C的顶层琼脂摇匀。
[0054]同时，将LB固体平板37°C预热，将液体倾入其中的表面。摇匀平铺LB平板上，冷却后，倒置在37°C培养箱之中，约l_3h，观察噬菌体斑(图5-A)，计算库容量。
[0055]观察记录每个平板上的噬菌体斑，挑选形状规则、边界清晰的噬菌体斑多个，每个曬菌体斑放入一个Eppendorf管之中，每个管加入100 μ IlOmM EDTA (ρΗ7.5)溶液。65°C水浴热处理lOmin，待所有的琼脂溶解之后，13000g离心3min，取上清液体(含有重组噬菌体的DNA)作为PCR反应的模板。
[0056]用PCR进行噬菌体鉴定，反应体系为7.1的模板2 μ 1，IOXTaq buffer(含MgCl2)
2.5 μ 1，上游引物 Ι.Ομ 1，下游引物 1.Ομ I, Taq 酶 0.5 μ 1，ddH2017 μ I,合计 25 μ I。扩增条件:预变性900C 4min ;变性94°C 45Sec，退火55°C 45sec，延伸72°C lmin, 30个循环；72°C延伸10分钟。PCR产物4°C保存。
[0057]用1%的琼脂糖凝胶电泳，观察插入片段的大小，如图5-B所示，将PCR产物送上海生工测序，最终完成重组噬菌体展示颗粒的鉴定。
[0058]实施例5噬菌体展示颗粒的制备
[0059]一噬菌体展示颗粒的扩增
[0060]准备50ml氨苄青霉素LB液体培养基，从平板上挑选单克隆宿主菌BLT5460，37°C振摇培养过夜，加5ml过夜的培养的菌种到500ml Lb amp抗性的培养基中，摇动培养到OD6tltl 为 0.5-1.0 之间时。
[0061]取重组噬菌体展示颗粒(浓度为108CFU/ml)进行感染。经过37°C培养l_3h，直到裂解物能够被观察到，因为噬菌体裂解物可能导致培养基的可视度降低。SOOOg离心lOmin，取清新的液体倾倒到一个灭菌的瓶子之中，测定裂解物的滴度。
[0062]二重组噬菌体展示颗粒的浓缩
[0063]将重组噬菌体展示颗粒，通过适当截留量的滤膜进行离心；收集膜上的产物，获得高浓度的重组噬菌体展示颗粒，保存备用。同时，确定液体噬菌体的滴度(滴度为大于I X IO9CFU 为宜)。
[0064]实施例6功能验证
[0065]一重组噬菌体展示颗粒应用
[0066]颗粒的处理，方法是将收集的重组II型猪圆环病毒衣壳蛋白噬菌体展示颗粒与佐剂混合均匀，进行乳化分装，使重组噬菌体终含量大于109CFU/ml，处理好的颗粒用来防控PCV2感染。[0067]二安全性试验
[0068]购买25日龄、无PCV2病毒感染、健康断奶的仔猪，共计6头，直接注射，临床观察30d,未见异常反应,证明重组曬菌体展示颗粒对本动物是安全的。
[0069]三抗原性试验
[0070]选择猪只:到猪场购买健康的、未断奶的仔猪6头，经前腔静脉采血，收集血清，用猪圆环病毒抗体酶联免疫检测试剂盒(购自深圳市康百得生物科技有限公司)检测阴性的仔猪。
[0071]分组实验:首先进行前腔静脉采血，将多次检测原圈(未断奶的0d，之后16d、32d检测)均合格的杂交仔猪。购回后随机分为二组，每组3头；第I组为实验组(全为公猪)，注射重组噬菌体展示颗粒；第2组(I公2母)为空白对照组，注射灭菌水；公母猪表示(公古，母早，下同)。其次，将弗氏佐剂油相与噬菌体展示颗粒按照体积比1:1的比例乳化分装，噬菌体最终含量约为109CFU/ml。最后，分别于第32d、第47d和第65d，用2ml/头的剂量颈部肌肉注射，免疫。
[0072]体液免疫监测主要是对实验猪的PCV2抗体监测，通过在试验期间，每隔大约10-20d进行所有猪只前腔静脉采血，用猪圆环病毒II型抗体酶联免疫检测试剂盒测定血清中的PCV2抗体效价，进行猪抗体消长规律分析，结果见图6。分析表明二免疫之后，免疫组的猪圆环病毒抗体滴度一直呈现上升趋势，一直持续到80多日龄；之后，抗体滴度略有下降。相反，未免疫(空白对照组)抗体变化不明显，而且都是阴性值(即OD45tl值小于试剂盒要求的Cut-OfT=0.168值)。结果说明重组噬菌体展示颗粒能产生较好的体液免疫。
[0073]细胞免疫监测主要是淋巴细胞转化试验进行。参照文献(Spector DL et al.998)的方法执行。具体执行的方法如下:
[0074](I)淋巴细胞收集与处理:三次免疫结束之后，选择免疫的公猪，仰卧保定，在公猪的前腔的凹陷处用碘酒消毒，用IOml无菌注射器采取2ml，之后迅速地加入到含有枸橼酸钠的抗凝血管中，经轻轻摇动混匀，防治血液凝固，获得猪的抗凝血液，即获得猪前腔静脉血液；向2ml的猪抗凝液血中加入等体积(2ml)的稀释液，轻轻混合均匀；向15ml细胞离心管中加入4ml猪外周血淋巴细胞分离液，静止放置，提前预热，孵育到室温即可；吸取稀释抗凝血液4ml，沿着细胞离心管管壁轻轻加在4ml的猪淋巴细胞分离液面上；以2000r/min离心，15min ;收集中间层淋巴细胞；向收集的淋巴细胞中加入RPMI1640 (购自GIBCO BRL公司，下同)的洗液IOmL,轻轻混匀，2000r/min离心20min,弃上清,重复2次；最后,加入总体积为2.0ml RPMI1640营养液，轻轻混匀，分装到2个1.5ml的离心管中。用RPMI1640营养液稀释至细胞终浓度为IO7个/ml。
[0075](2)淋巴细胞增值试验:取IOOmL制备好的白细胞悬液于96孔板中；向100ml单细胞悬液的培养板孔内，加入磷酸脂多糖(LPS，下同)和植物血凝素(PHA，下同)，终浓度为20 μ g / ml，并设阴性对照。每个样本设3个重复孔，置5% CO2, 37°C培养44h后加入噻唑蓝(MTT，下同)，终浓度5mg / ml，10 μ I /孔，继续培养4h。取出后置微量振荡器上室温振荡lOmin，使紫色结晶完全溶解，排尽气泡后用酶联检测仪器测定OD57tl的值，所得数据用SPSS10.0进行统计学处理。(3)培养刺激指数(Stimulation Index，SI)按照SI= (0D免疫实验-OD培养基对照)/(0D空白对照-OD培养基对照)计算执彳丁 ,结果见表1。分析表中的数据显不LPS和
PHA两种刺激物的SI都大于1，说明重组噬菌体展示颗粒促进了猪只淋巴细胞的增殖，证明重组噬菌体展示颗粒具有良好的细胞免疫效果。
[0076]表1
[0077]
【权利要求】
1.重组II型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体展示颗粒的制备方法，具体包括以下步骤: A优化编码II型猪圆环病毒的衣壳蛋白的核苷酸 以GenBank中编号为HM565924.1的衣壳蛋白的核苷酸序列作为模板，优化后，其序列如SEQ ID NO:1所示，进行人工合成； B重组质粒的构建 以人工合成的核苷酸为模板，进行PCR扩增，上游引物为如SEQ ID N0:2所示，下游引物如SEQ ID N0:3所示，循环30次，得PCR产物；将所得PCR产物纯化后，经过E.coRI，HindIII双酶切，回收酶切产物；将酶切产物与同样经过E.coRI，HindIII双酶切的线性表达载体pET28a ( + )连接,得重组质粒； C重组噬菌体基因组的构建 将所述的重组质粒用E.coRI, HindIII进行双酶切，酶切产物与具有相同粘性末端的T7噬菌体载体的双臂连接，得重组噬菌体基因组； D重组II型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体展示颗粒的制备 将所述重组噬菌体基因组经过体外包装后，转染宿主菌E.coli BLT5403，通过培养裂解宿主菌，得到重组II型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体展示颗粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:将步骤D所得重组II型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体展示颗粒通过离心处理，得浓缩重组PCV2_Cap/Phage展示颗粒。
3.编码II型猪圆环病毒的衣壳蛋白的表位氨基酸的核苷酸，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种重组质粒的制备方法,其特征在于:以如SEQ ID NO:1所示的DNA为模板，在扩增体系下进行PCR扩增，循环30次，得PCR产物；PCR扩增所设计并合成的上游引物为如SEQID N0:2所示，下游引物如SEQ ID NO:3所示；将所得PCR产物纯化后，经过E.coRI, HindIII双酶切，回收酶切产物；将酶切产物与同样经过E.coRI, HindIII双酶切的线性表达载体pET28a ( + )连接，得重组质粒。
5.重组噬菌体基因组，其特征在于:扩增和收集权利要求4所述的重组质粒，用E.coRI, HindIII进行双酶切，酶切产物与具有相同粘性末端的T7噬菌体载体的双臂连接，得重组噬菌体基因组。
6.运用权利要求5所述的重组噬菌体基因组制备重组II型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体展示颗粒的方法，其特征在于:将所述重组噬菌体基因组经过体外包装后，转染宿主菌E.coli BLT5403,通过培养裂解宿主菌，得到重组II型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体展示颗粒。
7.权利要求6所制备的重组II型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体展示颗粒在制备防控II型猪圆环病毒感染的应用。
8.权利要求6所制备的重组II型猪圆环病毒的衣壳蛋白噬菌体展示颗粒在制备II型猪圆环病毒抗原中的应用。
9.1I型猪圆环病毒的衣壳蛋白的表位蛋白在制备重组II型猪圆环病毒的衣壳蛋白/噬菌体展示颗粒中的应用，其特征在于:II型猪圆环病毒的衣壳蛋白的表位蛋白的氨基酸序列以如SEQ ID NO:4所示。
【文档编号】C12R1/92GK103540605SQ201310432346
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】杨柳, 沈克飞, 郑华, 张邑帆, 付利芝, 谷山林, 熊仲良 申请人:重庆市畜牧科学院