一种在禽细胞中检测流感病毒rna聚合酶活性的报告基因质粒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种在禽细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用。本发明的一种质粒，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。在双报告基因检测方法中采用本发明构建的报告基因质粒pGLucCk可以准确反应流感病毒在禽细胞中的RNA聚合酶活性，并且可以减少裂解细胞造成的误差，能够在不同时间点吸取细胞上清进行RNA聚合酶活性的测定，使得双报告基因检测RNA聚合酶活性的方法更简便、应用范围更广。
【专利说明】一种在禽细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种在禽细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用。
【背景技术】
[0002]禽流感，全名鸟禽类流行性感冒，是由病毒引起的动物传染病，通常只感染鸟类，少见情况下会感染猪。禽流感病毒高度针对特定物种，但在罕有情况下会跨越物种障碍感染人。按病原体类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体；低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少，产蛋量下降，出现零星死亡；高致病性禽流感最为严重，发病率和死亡率均很高，人感染高致病性禽流感死亡率约是60%，家禽感染的死亡率几乎是100%。
[0003]流感病毒对不同受体的亲和力不同是限制流感病毒的宿主范围和适应新物种的第一个主要障碍。限制宿主范围的另一个因素是核转运过程，病毒的聚合酶复合体需要与细胞内的因子相互作用以复制和转录病毒基因组。在完整的流感病毒粒子中，流感病毒基因组RNA片段、RNA外面包裹着的NP蛋白，以及聚合酶复合体(PB2、PB1、PA)组成病毒核糖核蛋白复合体(RNP)。流感病毒RNP复合体是病毒复制和转录所需的最小的分子复合物。
[0004]流感病毒的聚合酶基因在其致病性、宿主适应性及跨种间传播等多个生物学特性方面有重要作用。有研究发现，较高的聚合酶活性是产生高致病性毒株的一个重要决定因子，病毒聚合酶活性增强，致病性伴随着增强。更有报道，某些聚合酶基因影响着病毒在人群中的传播能力。另外，聚合酶活性在一定程度上也能反映RNP各基因片段之间的兼容程度。有研究证明限制病毒重排的一个关键因素是RNP复合体的兼容性，而其RNP的兼容性正与其相应的聚合酶活性相关。所以，流感病毒的聚合酶基因对这些生物学特性的影响与聚合酶活性有很大的关系，聚合酶活性对病毒的产生和复制能力有重要影响。
[0005]传统的流感病毒聚合酶活性测定是采用双报告基因系统，报告基因分别是海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶，由于海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶不能分泌到细胞外，需要裂解细胞以测定荧光素酶的表达量，操作不方便；另外，以往用的报告基因质粒上多是人源启动子，无法准确的反应病毒聚合酶在禽细胞上的聚合酶活性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种在禽细胞中检测流感病毒RNA聚合酶活性的报告基因质粒及其应用。
[0007]本发明提供的一种质粒，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008] 上述质粒在制备检测病毒RNA聚合酶活性的产品中的应用也属于本发明的保护范围。[0009]上述应用中,所述的病毒为流感病毒。
[0010]上述任一所述的应用中，所述流感病毒为猪流感病毒、禽流感病毒和/或人流感病毒。
[0011 ] 上述任一所述的应用中，所述猪流感病毒为猪H1N2流感病毒，所述禽流感病毒为禽H9N2流感病毒，所述人流感病毒为人HlNl流感病毒。
[0012]上述任一所述的应用中，所述检测病毒RNA聚合酶活性为检测所述病毒的RNA聚合酶在禽细胞中的RNA聚合酶活性。
[0013]上述任一所述的应用中,所述禽细胞为禽DFl细胞。
[0014]一种用于检测病毒RNA聚合酶活性的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包括上述质粒、内参质粒pCMV/SEAP、禽细胞、分别连接待测病毒RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒。
[0015]上述试剂盒中，所述分别连接待测病毒RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒，是将所述待测病毒RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白或待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白的基因分别插入pcDNA3.1 (+)的多克隆位点得到的。
[0016]所述禽细胞为禽DFl细胞。
[0017]上述任一所述的试剂`盒中，所述试剂盒还包括检测Gaussia荧光素酶活性的产品和检测分泌型碱性磷酸酶活性的产品。
[0018]一种检测待测病毒RNA聚合酶在禽细胞中RNA聚合酶活性的方法也属于本发明的保护范围，该方法是利用上述任一所述的试剂盒进行检测的，包括如下步骤:
[0019]将上述质粒、内参质粒pCMV/SEAP、分别连接待测病毒A的RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒A的RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒A的RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒A的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒共同转入所述禽细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作a ；
[0020]将上述质粒、内参质粒pCMV/SEAP、分别连接待测病毒B的RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒B的RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒B的RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒B的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒共同转入所述禽细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作b ；
[0021]将上述质粒、内参质粒pCMV/SEAP共同转入所述禽细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值,记作对照比值；
[0022]若a显著大于对照比值，则判定所述待测病毒A的RNA聚合酶在禽细胞中具有RNA聚合酶活性；
[0023]若a和b显著大于对照比值，并且a显著大于b，则判定病毒A在禽细胞中的RNA聚合酶活性大于病毒B在禽细胞中的RNA聚合酶活性。[0024]所述禽细胞为禽DFl细胞。
[0025]所述待测病毒为流感病毒。
[0026]利用本发明构建的pGLucCk质粒作为报告基因质粒的双报告基因检测方法可以用于测定流感病毒在禽细胞上的RNA聚合酶活性。
[0027]本发明构建的双报告基因检测方法具有以下优点:
[0028]1、pGLucCk质粒选择禽源RNA聚合酶I型启动子作为报告基因的启动子，该禽源RNA聚合酶I型启动子可以应用在不同的禽源细胞上，具有该启动子的报告基因能准确反应流感病毒在禽细胞上的RNA聚合酶活性。
[0029]2、该检测方法利用能够分泌到细胞外的分泌型Gaussia荧光素酶(GLuc)作为报告基因，选择同样能够分泌到细胞外的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)作为内參基因，质粒转染细胞后，收集培养液上清，測定Gaussia荧光素酶(GLuc)和分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性即可測定流感病毒的RNA聚合酶活性。此方法減少了裂解细胞的步骤以及減少了由此造成的误差，并且可以在不同时间点吸取细胞上清进行測定，使得检测方法更简便、应用范围更广。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为pGLucCk结构示意图。`【具体实施方式】
[0031 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]猪H1N2 流感病毒 A/swine/Guangdong/1222/2006 (H1N2)在文献 “Zhao X，SunY，Pu J, Fan L，Shi W, Hu Y，Yang J，Xu Q, Wang J，Hou D，Ma G，Liu J.Characterization ofan artincial swine-origin influenza virus with the same gene combination asH1N1/2009 virus:a genesis clue of pandemic strain.PLoS One.2011，6(7):e22091.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0034]禽H9N2 流感病毒 A/chicken/Hebei/LC/2008 (H9N2)在文献 “High geneticcompatiDI丄Ity and increased pathogen I city of reassortants derivedfrom avian H9N2 and pandemic H1N1/2009 influenza viruses.PNAS March8，2011，108(10):4164-4169.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0035]人HlNl 流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)在文献 “Chou, Y.Y.，R.A.Albrecht, N.Pica, A.C.Lowen, J.A.Richt, A.Garcia-Sastre, P.Palese, and R.Ha1.The Msegment of the 2009 new pandemic HlNl influenza virus is critical for its hightransmission efficiency in the guinea pig model.J Virol 85:11235-41.，，中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0036]禽DFl细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，产品目录号为 3111C0001CCC000417 ；
[0037]pGLuc Min1-TK2购自NEB公司，产品目录号为N8086S ；
[0038]pcDNA3.1 (+)购自 Invitrogen 公司，产品目录号为 V790-20 ；[0039]pCMV/SEAP质粒购自Tropix公司，产品目录号为AVlOC ；
[0040]Secrete-Pair?Dual Luminescence Assay Kit 购自 GeneCopoeia 公司，产品目录号为 SPDA-DOIO ；
[0041]OPT1-MEM I培养基购自Invitrogen公司，产品目录号为1267485 ；
[0042]TranslT-LTl 购自 Mirus 公司，产品目录号为 MIR2300。
[0043]实施例1、pGLucCk质粒的构建
[0044]一、pFluGLuc 质粒的构建
[0045](一)基因片段A的合成
[0046]1、参考NCBI 提供的 pRSET-TAUT_2P序列(ID:gb |KC795008.11 )，确定 T7 启动子序列为 5’ -TAATACGACTCACTATAGG-3’ ；
[0047]2、参考28S核糖体终止区序列(ID:gb|M12074.1| )，确定RNA聚合酶I终止子序列的反向互补序列为 5’ -ccggagtactggtcgacctccgaagttggggggg-3’ ；
[0048]3、参考NCBI提供的流感病毒数据库，确定非结构蛋白基因NSl的5’UTR保守序列为 5’ -AGCAAAAGCAGGG TGACAAAAACATA-3’。
[0049]4、依次按照T7启动子、RNA聚合酶I终止子的反向互补序列和NSl基因5’UTR保守序列，合成基因片段A，其序列如下:
[0050]5，-TTGGaattctaatacgactcactatagggagacccaagctgttaacgctagcagttaaccggagtactggtcgacctccgaagttgggggggAGCMAAGCAGGGTGACAAAMCATAgGATCCAGCCA-3 ’。(下划线所不序列为酶切识别位点)
[0051]A中T7启动子、RNA聚合酶I终止子序列的反向互补序列之间用
[0052]5’ -gagacccaagctgttaacgctagcagttaa-3’ 连接，T7 启动子前加 EcoRI 酶切位点
[0053]5’ -GAATTC-3’和保护碱基5’ -TTG-3’，NSl基因的5’ UTR后加BamHI酶切位点
[0054]5’ -GGATCC-3’ 和保护碱基 5’ -AGCCA-3’。
[0055](二)用EcoRI和BamHI双酶切基因片段A，得到基因片段；用EcoRI和BamHI双酶切pGLuc Min1-TK2质粒得到载体大片段；将基因片段和载体大片段连接得到重组质粒，将重组质粒命名为pFluGLuc，将质粒送测序，测序正确。
[0056]二、pGLucCk质粒的构建
[0057](—)基因片段B的合成
[0058]1、参考NCBI提供的流感病毒数据库，确定NEP基因的3’UTR保守序列为5’_TGATAAAAAACACCCTTGTTTCTACT-3’ ；
[0059]2、参考NCBI上原鸡RNA聚合酶I型启动子序列(ID:gb |DQ112354.11 )，确定本发明中使用的禽源RNA聚合酶I型启动子序列的反向互补序列为
[0060]5，-acagacgaacatataaggcatccgaaaaaaacgttctagccccataggcgccgactaccggcagcggctccgacggcagccgaggtttacctcgacgtaactggaggtacaaaattacagcgacgcctctggcagctccggagctgtagcgcccccccccacagccagagcggccaagacaatccgaaaccgggtagacctggacgcggatcgcaagccgccccggcagcgacctctagccgccgccgcggagagcgcgagtcggtagcacccgggtagaccgttccgccgtttccgagacgccccggcagcgacccctagccgccgccgcggagcgaccgagccggacggggcccgtcggagccgggtagaccgttccgccgtttccgagccgacacggcagcgacctctagcc-3’ ；
[0061]3、依次按照NEP基因3’UTR序列和禽源RNA聚合酶I型启动子序列的反向互补序列合成基因片段B，其基因序列如下:
[0062]5，-TGGTGACTAAGCggccGCTGATAAAAAACACCCTTGTTTCTACTacagacgaacatataaggcatccgaaaaaaacgttctagccccataggcgccgactaccggcagcggctccgacggcagccgaggtttacctcgacgtaactggaggtacaaaattacagcgacgcctctggcagctccggagctgtagcgcccccccccacagccagagcggccaagacaatccgaaaccgggtagacctggacgcggatcgcaagccgccccggcagcgacctctagccgccgccgcggagagcgcgagtcggtagcacccgggtagaccgttccgccgtttccgagacgccccggcagcgacccctagccgccgccgcggagcgaccgagccggacggggcccgtcggagccgggtagaccgttccgccgtttccgagccgacacggcagcgacctctagccggtcacctaaatgctTCTAGAAATAATT-3'。(下划线所示序列为酶切识别位点)
[0063]B中NEP基因3 ’ UTR序列前加Not I酶切位点5，-GCggccGC-3，和保护碱基5’ -TGGTGACTAA-3’;禽源RNA聚合酶I型启动子序列的反向互补序列后面加Xba I酶切位点5’ -TCTAGA-3’和保护碱基5’ -AATAATT-3’ ；禽源RNA聚合酶I型启动子序列的反向互补序列和Xba I酶切位点之间用5’ -ggtcacctaaatgct-3’序列连接。[0064](二)用Not I和Xba I双酶切基因片段B，得到基因片段；用Not I和Xba I双酶切pFluGLuc，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒pGLucCk，将质粒送测序,测序正确。
[0065]pGLucCk的结构示意图如图1所示。
[0066]图1中，T7promoter表不T7启动子序列；pol I terminator表不RNA聚合酶I终止子序列的反向互补序列；NS5’UTR表不非结构蛋白基因NSl的5’UTR保守序列；NS3’UTR表不NEP基因的3’UTR保守序列；Gallus gallus Pol I Promoter表不禽源RNA聚合酶I型启动子序列的反向互补序列。
[0067]pGLucCk 的序列如 SEQ ID N0.1 所示。
[0068]测序结果表明，pGLucCk上第26-44位为T7启动子序列，第75-108位为RNA聚合酶I终止子序列的反向互补序列，第109-134位为非结构蛋白基因NSl的5’UTR保守序列，第148-705位为GLuc基因，第714-739位为NEP基因的3’UTR保守序列，第740-1154位为禽源RNA聚合酶I型启动子序列的反向互补序列。
[0069]实施例2、禽细胞中流感病毒RNA聚合酶活性的测定
[0070]一、提取猪 H1N2 流感病毒 A/swine/Guangdong/1222/2006 (H1N2)、禽 H9N2 流感病毒 A/chicken/Hebei/LC/2008(H9N2)和人 HlNl 流感病毒 A/Puerto Rico/8/34 (HlNl)的RNA,并反转录成cDNA，得到猪H1N2流感病毒的cDNA、禽H9N2流感病毒的cDNA和人HlNl流感病毒的cDNA。
[0071]二、合成表1的引物。
[0072]表1 PCR 引物
[0073]
【权利要求】
1.一种质粒，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述的质粒在制备检测病毒RNA聚合酶活性的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述的病毒为流感病毒。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于:所述流感病毒为猪流感病毒、禽流感病毒和/或人流感病毒。
5.根据权利要求2-4任一所述的应用，其特征在于:所述猪流感病毒为猪H1N2流感病毒，所述禽流感病毒为禽H9N2流感病毒，所述人流感病毒为人HlNl流感病毒。
6.根据权利要求2-5任一所述的应用，其特征在于:所述检测病毒RNA聚合酶活性为检测所述病毒的RNA聚合酶在禽细胞中的RNA聚合酶活性。
7.一种用于检测病毒RNA聚合酶活性的试剂盒，包括权利要求1所述的质粒、内参质粒pCMV/SEAP、禽细胞、分别连接待测病毒RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述分别连接待测病毒RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒，是将所述待测病毒RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒RNA聚合酶中NP蛋白或待测病毒RNA聚合酶中PB2蛋白的基因分别插入pcDNA3.1(+)的多克隆位点得`到的； 所述禽细胞为禽DFl细胞。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括检测Gaussia荧光素酶活性的产品和检测分泌型碱性磷酸酶活性的产品。
10.一种检测待测病毒RNA聚合酶在禽细胞中RNA聚合酶活性的方法，是利用权利要求7-9中任一所述的试剂盒进行检测的，包括如下步骤: 将权利要求1所述的质粒、内参质粒pCMV/SEAP、分别连接待测病毒A的RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒A的RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒A的RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒A的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒共同转入所述禽细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作a ； 将权利要求1所述的质粒、内参质粒pCMV/SEAP、分别连接待测病毒B的RNA聚合酶中PBl蛋白、待测病毒B的RNA聚合酶中PA蛋白、待测病毒B的RNA聚合酶中NP蛋白和待测病毒B的RNA聚合酶中PB2蛋白基因的重组表达质粒共同转入所述禽细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作b ； 将权利要求1所述的质粒、内参质粒pCMV/SEAP共同转入所述禽细胞中，培养36小时，收集细胞培养液上清，检测细胞培养液上清中Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性，计算Gaussia荧光素酶活性和碱性磷酸酶活性的比值，记作对照比值； 若a显著大于对照比值，则判定所述待测病毒A的RNA聚合酶在禽细胞中具有RNA聚合酶活性； 若a和b显著大于对照比值，并且a显著大于b，则判定病毒A在禽细胞中的RNA聚合酶活性大于病毒B在禽细胞中的RNA聚合酶活性； 所述待测病毒为流感病毒。
【文档编号】C12N15/63GK103497959SQ201310437181
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】孙怡朋, 刘林青, 刘金华 申请人:中国农业大学