利鲁牛微卫星分子标记引物对及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微卫星分子标记【技术领域】，特别涉及利鲁牛微卫星分子标记引物对，碱基序列见序列表中序列1-12。利鲁牛微卫星分子标记引物对在鉴定鲁西黄牛和利木赞牛杂交后代利鲁牛中的应用。利鲁牛微卫星分子标记引物对在利鲁牛筛选或辅助育种中的应用。建立了利鲁牛的微卫星DNA分子标记技术体系，并利用这些标记的引物对进行利鲁牛遗传多样性分析、指纹图谱构建及分子标记辅助育种，在利木赞牛和鲁西黄牛的育种实践中，利用这种分子标记引物对可以快速鉴定杂交后代的真实性，高效获得杂种后代，加快育种进程。
【专利说明】利鲁牛微卫星分子标记引物对及其应用
[0001]【技术领域】
本发明涉及微卫星分子标记【技术领域】，特别涉及利鲁牛微卫星分子标记引物对，还涉及所述引物对在利鲁牛品质鉴定中的应用。
[0002]【背景技术】 利鲁牛的育种工作最早从1976年开始，通过以利木赞牛为父本，鲁西黄牛为母本，采用开放式核心群育种方案，经过“杂交创新、横交、选育提高”3个阶段，培育出含利木赞牛血液62.5%,鲁西黄牛血液37.5%,体型外貌一致,遗传性能稳定的利鲁牛。
[0003]山东省地处我国肉牛优势产区一中原肉牛产业带的核心区域，历史上曾培育出了我国著名的地方良种鲁西黄牛和渤海黑牛，牛的存栏和牛肉产量一直稳居全国前三位。鲁西黄牛和渤海黑牛虽然具有许多优良的特性，但均不是专门的肉牛品种。为了快速提高牛肉产肉，建国以后山东省先后引进了利木赞、皮埃蒙特、夏洛莱、安格斯、德国黄牛、西门塔尔等众多国外品种与鲁西黄牛等地方品种杂交，取得了显著效果，对于快速提高全省的肉牛生产水平和牛肉产量做出了突出贡献。但由于在杂交过程中忽略了对鲁西黄牛等地方良种的选育和保护，加上养殖效益低于杂交牛，导致作为杂交母本的纯种数量急剧下降。而随着级进杂交代数的提高，不仅杂交优势不再明显，还出现了很多负面效果。同时，国外良种肉牛的引进仅是单纯的种公牛引进，即使引进母牛数量也很小，根本没法自主进行种公牛的培育，不得不从国外重复引种。利鲁牛的培育成功，一是填补了山东省没有专门化肉用品种的空白；二是稳定了杂交所产生的杂交优势，且不需要再维持庞大的地方良种牛群体；三是可实现优秀种公牛的自主培育，减少对进口种公牛的依赖。利鲁牛适应性强，生长速度快，产肉性能好，牛肉品质较好，易饲养，兼具父本利木赞牛和母本鲁西黄牛的多数优良特性，因此，推广应用前景良好。
[0004]在育种实践过程中，随着对个体及其产品要求的提高，通常用到畜群系谱图，根据亲属信息来决定个体的选留，因此准确的系谱记录是非常必要的，然而，在某些情况下(如寄养、母畜返情重配等)却不能准确判断该个体的亲代。
[0005]在现代种畜禽生产经营管理中，部分种质企业从国内外引进了不同的品种品系以满足现代市场的多元化需求，在制种或售种过程中，不仅有纯系，还生产了各种各样的系间杂交群体，个别企业为了追求利益，可能会将系间杂交群体作为纯系进行销售，而客户单纯从体型外貌观察难以分辨纯系和系间杂交群体的差异，如果用作种质进行繁育后代则容易出现性状分离，影响种群整齐度。
[0006]Van Zeveren等(1995)利用7个微卫星座位对4个比利时猪种进行血缘关系鉴定，排除概率在95%以上。Heyen等(1997)使用分属17条染色体的22个微卫星座位，采用排除概率法，对5个品种牛进行血缘关系分析，使鉴定准确率达到99.99%。因此，可以通过微卫星标记技术科学鉴定纯系与系间杂交群体。在地方品种的有效保护和开发利用方面，微卫星标记也起着重要作用。因此，利用微卫星引物多态性，通过计算分析排除概率即可进行亲子鉴定及血缘控制。现有技术中还没有使用微卫星分子标记对利鲁牛进行品种鉴定的记载。[0007]
【发明内容】
为了解决以上利鲁牛在品种鉴定方面的难题，本发明提供了一种使用微卫星分子标记鉴定利鲁牛品种的利鲁牛微卫星分子标记引物对。
[0008]本发明还提供了上述利鲁牛微卫星分子标记引物对在利鲁牛品种鉴定、筛选或辅助育种中的应用。
[0009]本发明的通过以下步骤得到的:
一种利鲁牛微卫星分子标记引物对，碱基序列如下:
1)INRA032 F: 5’ - AAACTGTATTCTCTAATAGCTAC-3’(序列表中序列 I)
INRA032 R: 5’ -GCAAGACATATCTCCATTCCTTT-3’(序列表中序列 2)
2)TGLA126 F: 5’- CTAATTTAGAATGAGAGAGGCTTCT-3’(序列表中序列 3)
TGLA126 R: 5’- TTGGTCTCTATTCTCTGAATATTCC-3’(序列表中序列 4)
3)ETHlO F: 5’- GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA-3，(序列表中序列 5)
ETHlO R: 5’- CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC-3’ (序列表中序列 6)
4)INRA035 F: 5，- TTGTGCTTTATGACACTATCCG-3’(序列表中序列 7)
INRA035 R: 5’ - ATCCTTTGCAGCCTCCACATTG-3’(序列表中序列 8)
5)DVGA46 F: 5’- AAATCCTTTCAAGTATGTTTTCA-3’(序列表中序列 9)
DVGA46 R: 5’ - ACTCACTCCAGTATTCTTGTCTG-3’(序列表中序列 10)
6)BM1818 F: 5’ - AGCTGGGAATATAACCAAAGG-3’(序列表中序列 11)
BM1818 R: 5’ - AGTGCTTTCAAGGTCCATGC-3’。(序列表中序列 12)
所述的利鲁牛微卫星分子标记引物对在鉴定鲁西黄牛和利木赞牛杂交后代利鲁牛中的应用。
[0010]所述的应用，包括以下步骤:
(1)对目标血液或精液进行DNA提取；
(2)使用权利要求1所述的利鲁牛微卫星分子标记引物对对步骤(1)中提取的DNA进行PCR扩增；
(3)当步骤(2)中的扩增产物同时显示出鲁西黄牛和利木赞牛的谱带类型时，为真实杂种利鲁牛。
[0011]所述的利鲁牛微卫星分子标记引物对在利鲁牛筛选或辅助育种中的应用。
[0012]本发明的有益效果:建立了利鲁牛的微卫星DNA分子标记技术体系，并利用这些标记的引物对进行利鲁牛遗传多样性分析、指纹图谱构建及分子标记辅助育种，在利木赞牛和鲁西黄牛的育种实践中，利用这种分子标记引物对可以快速鉴定杂交后代的真实性，高效获得杂种后代，加快育种进程。
[0013]【专利附图】
【附图说明】
图1为利木赞牛与鲁西黄牛及其杂交后代在INRA032位点上的SSR分型图；其中，粗线峰为内标峰，每个峰下面均标有其相对应的片段长度；上一为利木赞牛的SSR分形图；上二为鲁西黄牛的SSR分形图；后三幅图为利木赞牛与鲁西黄牛三个不同杂交后代的SSR分形图；
图2为利木赞牛与鲁西黄牛及其杂交后代在TGLA126位点上的SSR分型图；其中粗线峰为内标峰，每个峰下面均标有其相对应的片段长度；上一为利木赞牛的SSR分形图；上二为鲁西黄牛的SSR分形图；后三幅图为利木赞牛与鲁西黄牛三个不同杂交后代的SSR分形图；
图3为利木赞牛与鲁西黄牛及其杂交后代在ETHlO位点上的SSR分型图；其中，粗线峰为内标峰，每个峰下面均标有其相对应的片段长度；上一为利木赞牛的SSR分形图；上二为鲁西黄牛的SSR分形图；后三幅图为利木赞牛与鲁西黄牛三个不同杂交后代的SSR分形图；
图4为利木赞牛与鲁西黄牛及其杂交后代在INRA035位点上的SSR分型图；其中，粗线峰为内标峰，每个峰下面均标有其相对应的片段长度；上一为利木赞牛的SSR分形图；上二为鲁西黄牛的SSR分形图；后三幅图为利木赞牛与鲁西黄牛三个不同杂交后代的SSR分形图；
图5为利木赞牛与鲁西黄牛及其杂交后代在DVGA46位点上的SSR分型图；其中，粗线峰为内标峰，每个峰下面均标有其相对应的片段长度；上一为利木赞牛的SSR分形图；上二为鲁西黄牛的SSR分形图；后三幅图为利木赞牛与鲁西黄牛三个不同杂交后代的SSR分形图；
图6为利木赞牛与鲁西黄牛及其杂交后代在BM1818位点上的SSR分型图；其中，粗线峰为内标峰，每个峰下面均标有其相对应的片段长度；上一为利木赞牛的SSR分形图；上二为鲁西黄牛的SSR分形图；后三幅图为利木赞牛与鲁西黄牛三个不同杂交后代的SSR分形图。
【具体实施方式】
[0014]以下通过实施例并结合附图对本发明技术内容进行详细叙述。
[0015](I)选择纯种的利木 赞牛、鲁西黄牛及其3个杂交后代利鲁牛，从其全血或冻精中提取基因组DNA (全血采用Lab-Aid基因组DNA分离试剂盒提取，冻精采用高盐法提取)。
[0016](2)准备鲁西黄牛、利木赞牛、3个杂交后代利鲁牛6个品种牛的基因组DNA各一份，对30对适合牛用的微卫星一一进行PCR扩增，然后凝胶电泳检测是否有扩增条带。选择能使鲁西黄牛、利木赞牛、利鲁牛三个品种牛完全扩增出的微卫星引物。结果筛选出20对符合条件的微卫星位点，分别为 INRA032、TGLA126, TGLA227、TGLA122、ETH10、INRA035、HEL5、HEL13、DVGA44、ETH225、BM1824、SPSl 15、BM2113、INRA063、DVGA46、DVGA55、BM1818、HAUT24、TGLA53、INRA023。碱基序列如下:
1)INRA032 F: 5’ - AAACTGTATTCTCTAATAGCTAC-3’
INRA032 R: 5’ -GCAAGACATATCTCCATTCCTTT-3’
2)TGLAI26 F: 5’ - CTAATTTAGAATGAGAGAGGCTTCT-3’
TGLAI26 R: 5’ - TTGGTCTCTATTCTCTGAATATTCC-3’
3)TGLA227 F: 5’ - CGAATTCCAAATCTGTTAATTTGCT-3’
TGLA227 R: 5， - ACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA-3’
4)TGLA122 F: 5’ - CCCTCCTCCAGGTAAATCAGC-3，
TGLA122 R: 5’ - AATCACATGGCAAATAAGTACATAC-3’
5)ETHlO F: 5’ - GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA-3’
ETHlO R: 5’ - CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC-3’6)INRA035 F: 5’ - TTGTGCTTTATGACACTATCCG-3’
INRA035 R: 5’ - ATCCTTTGCAGCCTCCACATTG-3’
7)HEL5 F: 5’ - GCAGGATCACTTGTTAGGGA-3’
HEL5 R: 5’ - AGACGTTAGTGTACATTAAC-3’
8)HEL13 F: 5’ - TAAGGACTTGAGATAAGGAG-3’
HEL13 R: 5’ - CCATCTACCTCCATCTTAAC-3’
9)DVGA44 F: 5’ _ GGGAGAATGGATGGAACCAAAT-3’
DVGA44 R: 5’ - TTCGAAGACGGGCAGACAGG-3’
10)ETH225 F: 5’ - GATCACCTTGCCACTATTTCCT-3’
ETH225 R: 5’ - ACATGACAGCCAGCTGCTACT-3’
11)BM1824 F: 5’ - GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC-3’
BM1824 R: 5’ - CATTCTCCAACTGCTTCCTTG-3’
12)SPSl15 F: 5’ - AAAGTGACACAACAGCTTCTCCAG-3’
SPSl15 R: 5’ - AACGAGTGTCCTAGTTTGGCTGTG-3’
13)BM2113 F: 5’ - GCTGCCTTCTACCAAATACCC-3’
BM2113 R: 5’ - CTTCCTGAGAGAAGCAACACC-3’
14)INRA063 F: 5’ - ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC-3’
INRA063 R: 5’ - AAACCACAGAAATGCTTGGAAG-3’
15)DVGA46 F: 5’ - AAATCCTTTCAAGTATGTTTTCA-3’
DVGA46 R: 5’ - ACTCACTCCAGTATTCTTGTCTG-3’
16)DVGA55 F: 5’ - GTGACTGTATTTGTGAACACCTA-3’
DVGA55 R: 5’ - TCTAAAACGGAGGCAGAGATG-3’
17)BM1818 F: 5’ - AGCTGGGAATATAACCAAAGG-3J
BM1818 R: 5’ - AGTGCTTTCAAGGTCCATGC-3’
18)HAUT24 F: 5’ - CTCTCTGCCTTTGTCCCTGT-3’
HAUT24 R: 5’ - AATACACTTTAGGAGAAAAATA-3’
19)TGLA53 F: 5’ - GCTTTCAGAAATAGTTTGCATTCA-3’
TGLA53 R: 5’ - ATCTTCACATGATATTACAGCAGA-3’
20)INRA023 F: 5’ - GAGTAGAGCTACAAGATAAACTTC
INRA023 R: 5’ - TAACTACAGGGTGTTAGATGAACTC-3’。
[0017]首先检测所选取的20对微卫星引物的最佳退火温度，采用温度梯度PCR仪进行普通产物扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，选取条带最亮的为最佳退火温度，分别为54°C、54 °C >54 °C >54 °C >56 °C >60 °C >54 °C >52 °C >58 °C >58 °C >52 °C >54 °C >54 °C >52 °C >52 °C >54 °C >52 V、54°C、52 V、50°C。然后分别对20对微卫星引物的正向引物5’段进行荧光标记，其中微卫星引物 INRA032、TGLA227、ETHlO、INRA035、HEL5、DVGA44、ETH225、SPS115、BM2113、DVGA46、BM1818、HAUT24、TGLA53进行FAM (蓝色)荧光标记，剩余微卫星引物TGLA126、TGLA122、HEL13、BM1824、INRA063、DVGA55、INRA023 进行 HEX (绿色)荧光标记。
[0018](3)PCR扩增:PCR扩增反应总体系为20 μ L，其中SuperMix 10 μ L，每个引物对中的上、下游引物各0.8 ULClO pmol/μ?)，模板I yL(100 ng/μ I )。模板为鲁西黄牛、利木赞牛、利鲁牛(利木赞和鲁西黄牛杂交后代)DNA。PCR扩增程序:94 °C预变性3 min ；94 °C变性 30 s, 50-60 °C复性 30 s，72 °C延伸 40 s，30 个循环；60 °C 45 min。
[0019](4)基因型检测:利用毛细管电泳多色荧光检测，主要操作步骤如下:1)PCR产物稀释:FAM，HEX荧光标记的引物PCR产物需要稀释30倍；取96孔板按PCR产物板号对应的做好标记，加灭菌双蒸水(DNA 2 μ L，若稀释30倍，ddH20加58 μ L)。2) DNA变性:将20μ L SIZ-500内标加入980 μ L去离子甲酰胺内，涡旋混匀，离心，以每孔10 μ L分装到新的96孔板内，取I yL PCR产物稀释物对应的加入各孔中；95 °C变性5 min，于4 °C保温10 min ；3000 rpm离心I min,于3730x1 DNA分析仪上进行毛细管电泳。3)输入跑样表,用DataCollection软件收集原始数据。4)分析数据，用GeneMapper软件对DataCollection软件收集的原始数据分析。
[0020](5)为了对得到的杂交子代进行DNA分子鉴定，首先筛选出在父母本中扩增出不同谱带类型的微卫星引物作为杂种鉴定的标记，然后对子代连同亲本进行PCR扩增，当子代显示出上双亲的谱带类型时，可鉴定为真实杂种，最终在子代中显示出双亲的谱带类型的为 INRA032、TGLA126、ETH10、INRA035、DVGA46 和 BM1818 引物对。图谱分别见图 1-6。
[0021]引物对的准确性评价
为了对上述得到的6对引物的准确性进行评价，特设置以下实验:
采集员采集若干个牛品种的血液，并编号，其中有3个是利鲁牛(来自利鲁牛的培育基地-山东省海阳市畜牧兽医局)，3个是利木赞牛(其中1头来自洛阳市瑞牧有限公司，2头来自山东省种公牛站有限责任公司)、3个鲁西黄牛(来自山东省种公牛站有限责任公司)，采集员知晓哪些编号是真实的利鲁牛，哪些编号不是利鲁牛，但他没有告知实验人员，实验人员使用上述筛选出的6对引物按照上述方法对6个样品进行检测鉴定，鉴定结果经采集员确认，准确率达到100%。说明上述筛选出的6对引物的鉴定准确度高。
【权利要求】
1.一种利鲁牛微卫星分子标记引物对，其特征在于碱基序列如下:
1)INRA032 F: 5’ - AAACTGTATTCTCTAATAGCTAC-3’
INRA032 R: 5’ -GCAAGACATATCTCCATTCCTTT-3’
2)TGLA126 F: 5’- CTAATTTAGAATGAGAGAGGCTTCT-3’
TGLAI26 R: 5’ - TTGGTCTCTATTCTCTGAATATTCC-3’
3)ETHlO F: 5’ - GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA-3’
ETHlO R: 5’ - CCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC-3’
4)INRA035 F: 5’ - TTGTGCTTTATGACACTATCCG-3’
INRA035 R: 5’ - ATCCTTTGCAGCCTCCACATTG-3’
5)DVGA46 F: 5’ - AAATCCTTTCAAGTATGTTTTCA-3’
DVGA46 R: 5’ - ACTCACTCCAGTATTCTTGTCTG-3’
6)BM1818 F: 5’ - AGCTGGGAATATAACCAAAGG-3’
BM1818 R: 5’ - AGTGCTTTCAAGGTCCATGC-3’。
2.—种权利要求1所述的利鲁牛微卫星分子标记引物对在鉴定鲁西黄牛和利木赞牛杂交后代利鲁牛中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征是包括以下步骤: (1)对目标血液或精液进行DNA提取； (2)使用权利要求1所述的利鲁牛微卫星分子标记引物对对步骤(1)中提取的DNA进行PCR扩增； (3)当步骤(2)中的扩增产物同时显示出鲁西黄牛和利木赞牛的谱带类型时，为真实杂种利鲁牛。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤(2)中的PCR扩增反应总体系为20μ L，其中SuperMix 10 μ L，上、下游引物各0.8 yL，模板I μ L ;PCR扩增程序:94°C预变性 3 min;94°C变性 30 s，50_60°C复性 30 s，72°C延伸 40 s，30 个循环；60°C 45 min。
5.一种权利要求1所述的利鲁牛微卫星分子标记引物对在利鲁牛筛选或辅助育种中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103484457SQ201310437459
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】刘桂芬, 万发春, 刘晓牧, 游伟, 成海建, 宋恩亮, 王改英 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所