抗cd14抗体融合蛋白质的制作方法
【专利摘要】本发明涉及抗CDl4抗体融合蛋白质。本发明公开了一种蛋白质，所述蛋白质包含(I)抗CDl4抗体或其活性片段或所述抗体的衍生物或片段和(II)能够抑制蛋白酶的物质或其活性片段或所述物质的衍生物或片段。
【专利说明】抗CD14抗体融合蛋白质
本申请是国际申请日为2006年6月5日的国际申请PCT / JP2006 / 311255进入中国、申请号为200680019201.X的题为“抗CD14抗体融合蛋白质”的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0001]本发明涉及包含抗CD14抗体和蛋白酶抑制剂的新型蛋白质；编码所述新型蛋白质的多核昔酸；所述新型蛋白质的制造方法；和所述新型蛋白质对于败血症等的医疗应用。
【背景技术】
[0002]败血症被定义为具有感染性病因并显示全身炎症反应综合征(SIRS)的病理学的疾病(参见非专利文献I)。发现的初期症状包括寒颤、出汗、发烧和血压降低，当各种炎性介素和凝血因子在整个身体内增多时，微循环发生紊乱，这会造成包括组织和器官衰竭的各种病理学状况的恶化，从而常常引起导致死亡的多种器官衰竭或败血病性休克的连续发作。
败血症的发作由构成感染菌的成分，例如革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)或革兰氏阳性细菌中的脂磷壁质酸(LTA)与白细胞(单核细胞/巨噬细胞和嗜中性白细胞)或血管内皮细胞的作用引发，而该作用又会导致生成各种不同的炎性介素。最近的研究显示首次被发现作为白细胞的分化抗原 (参见非专利文献2)的CD14和被认为是先天免疫系统中的模式识别分子的Toll样受体(TLR)(参见非专利文献3)在细菌构成成分对所述靶细胞的该激活作用中扮演重要角色。
[0003]⑶14以两种形式存在，即，膜结合形式和可溶性形式。所述膜结合形式的⑶14通过糖基磷脂酰基肌醇固定于细胞膜，所述可溶性形式的CD14包括在肝脏中合成的一种CD14和在通过磷脂酰肌醇特异性磷脂酶分裂白细胞之后存在于血液中的一种CD14(参见非专利文献4)。例如，所述靶细胞被LPS如下激活:利用血液中的LPS结合蛋白(LBP)的催化作用促进LPS与CD14结合，随后与细胞膜上的TLR结合，由此将活化信号转导至所述靶细胞。接收到活化信号的靶细胞制造并表达各种与炎症反应有关的介素，例如，诸如TNF-α、IL-l、IL-6和IL-8等细胞因子和组织因子。作为典型介素的细胞因子激活嗜中性白细胞和巨噬细胞，由此导致与血管内皮粘合，在组织内迁移，释放诸如中心粒细胞弹性蛋白酶等中性蛋白酶并制造活性氧种类。凝结与纤维蛋白溶解系统的激活、补体系统的激活和激肽释放酶的激活也促进该过程。如上所述，大量介素分子和效应分子在分子水平和细胞水平涉及病理的形成，过度促进这些反应会导致系统受损，从而造成如上所述的从微循环紊乱至组织衰竭和器官关衰竭的病理学恶化。
[0004]为解决显示出如此复杂的病理学的败血症，对各种治疗剂进行了许多研究。在研发各种治疗剂时采用的方法可以分为两个主要范畴，即，抑制作为导致败血症发作的物质的细菌构成成分的作用的方法，和抑制被表达为对于导致败血症发作的物质的信号的生物感应的各种因子的方法。
[0005]抑制来自革兰氏阴性细菌的内毒素的治疗方法包括(I)使用抗内毒素抗体的方法(参见非专利文献5和6) ；(2)使用内毒素拮抗物的方法(参见非专利文献7) ；(3)使用多粘菌素的方法(参见非专利文献8);和(4)使用BPI的方法(参见非专利文献9)。内毒素是构成革兰氏阴性细菌的成分，未在导致败血症的革兰氏阳性细菌和真菌中发现。因此，以内毒素为目标的败血症试剂与这样的问题联系在一起:它们不能对付除了革兰氏阴性细菌之外的细菌和真菌。
[0006]此外也已经提出了靶向作为用于LPS的受体的⑶14的败血症试剂，所述LPS是构成革兰氏阴性细菌的物质。由于⑶14已经被发现不仅是用于LPS的受体，而且还是用于细菌构成成分(如作为革兰氏阳性细菌构成成分的脂磷壁质酸和肽聚糖)的受体(参见非专利文献10)，因此靶向⑶14的败血症试剂不仅仅适用于革兰氏阴性败血症。已经提出的各种试剂包括抗CD14抗体(参见专利文献I和2)，和可溶性CD14(参见非专利文献11和专利文献3和4)。然而这些试剂仍未进行实际应用。据估计败血症的病理学是从由病原体的构成成分引发炎症反应的阶段至更为严重的阶段的相继的复杂发展。CD14靶向剂的缺陷在于由于这些试剂的作用集中在病理形成的早期引发阶段，因此对于所述病理的更为严重的后期的效果仍然值得怀疑。
[0007]同时，在靶向过度生成的因子的治疗方法中，抑制细胞因子或其他炎性介素的方法包括(I)使用抗TNF抗体的方法(参见非专利文献12)，(2)使用可溶性TNF受体的方法(参见非专利文献13)，(3)使用IL-1受体拮抗体的方法(参见非专利文献14)，(4)使用PAF抑制剂的方法(参见非专利文献15)，和(5)使用NO抑制剂的方法(参见非专利文献16)。尽管这些方法已经证明了它们在动物实验阶段中或在小型临床试验中的疗效，但是其在大规模临床试验阶段中所展示的疗效和有用性仍不明确。如上所述，细胞因子和其他炎性介素均具有多种活性，这些介素构成复杂网络，各种不同的事件在该网络中发生，其中的每一种介素与其他的介素互补并诱发其他介素的表达。因此，通过抑制一种因子进行的治疗据估计存在一定的局限性(参见非专利文献17)。
[0008]此外还提出了靶向凝血因子`的治疗方法，所述凝血因子的生成在与败血症的病理学的发生有关的介素相互作用的过程中得到增强。凝血因子被认为包括在治疗剂的重要目标之列，这是因为血液凝固的增强会引发血液微循环系统中的紊乱，而该紊乱又会引发供应至周围组织的氧的含量下降、组织衰竭甚至多种器官衰竭。示例性方法包括(I)使用活化蛋白C的治疗方法(参见非专利文献18)，(2)使用抗凝血酶III的治疗方法(参见非专利文献19)，和(3)使用TFPI的治疗方法(参见非专利文献20)。在这些方法中，使用活性蛋白C治疗严重败血症已经被证明在大规模的临床试验中具有显著疗效(参见非专利文献21)，并且该治疗已经用于临床应用。然而，该治疗存在很大的临床局限性，即其限于具有出血倾向的患者。
[0009][专利文献I] JP2744130B [专利文献 2]W002 / 42333
[专利文献 3]JP10-512142A [专利文献 4]W001 / 72993
[非专利文献 l]The ACCP / SCCM Consensus Conference Committee.Chest, 1992,101，1644-1655。
[非专利文献 2] Goyert S.M.and Ferrero E., in McMichael A.J.(ed.):LeukocyteTyping II1.0xford, Oxford University Press,1987,613-619。
[非专利文献 3]Zhang G.and Ghosh S.，].Endotoxin Res.,2000,6,453-457。
[非专利文献4] Stelter F., Structure / Function relationship of CD14 ；in JackR.S.(ed.):CD14in the Inflammatory Response.Chem.Tmmunol.Base l,Karger,2000,74,第25-41页。
[非专利文献 5]Ziegler E.J.，et al., New Engl.J.Med.，1991，324，429-436。
[非专利文献 6]Greenman R.L.et al.，JAMA, 1991, 266,1097-1102。
[非专利文献 7]Kawata T.et al.，Prog Clin Biol Res.，1995，392，499-509。
[非专利文献 8] Tani T.et al., Artif.0rgans，1998，22，1038-1044。
[非专利文献 9]Lin Y.et al., Antimicrob.Agents Chemother., 1996,40,65-69。
[非专利文献 10]Cleveland M.G.，et al.，Infect Tmmun.，1996,64,1906-1912。
[非专利文献 IlJHaziot A.，et al.，J.1mmunol.，1995，154,6529-6532。
[非专利文献 12]Fisher C.J.et al., Crit.Care Med.，1993，21，318-327。
[非专利文献 13]Fisher C.J.et al.，N.Engl.J.Med.，1996，334，1697-1702。
[非专利文献 14]Fisher C.J.et al.，JAMA，1994，271，1836-1843。
[非专利文献 15] Dhainaut J.F.et al., C rit.Care Med.，1994，22，1720-1728。
[非专利文献 16] Gachot B.et al., Intensive Care Med.，1995，21，1027-1031。
[非专利文献 17] Vincent J.L.et al.，Clin.1nfect Dis.，2002，34，1084-1093。
[非专利文献 18] Rivard G.E.et al.，J.Pediatr.，1995，126,646-652。
[非专利文献 19]Fourrier F.et al.，Chest, 1993，104,882-888。
[非专利文献 20] Abraham E.，Crit.Care Med.，2000，28，S31-33。
[非专利文献 21] Bernard，G.R.et al., N.Engl.J.Med.，2001，344，699-709。
【发明内容】
本发明解决的问题
[0010]考虑到该状况，本发明的发明人注意到通过将抗CD14抗体与蛋白酶抑制剂结合而制造的一种新型蛋白质将解决与现有技术有关的各种问题，并通过制造这样新型蛋白质确认其效果。本发明的目的是提供包含抗CD14抗体和蛋白酶抑制剂的新型蛋白质；编码所述新型蛋白质的多核苷酸；所述新型蛋白质的制造方法；和包含所述新型蛋白质的用于败血症的预防和/或治疗剂。
解决问题的手段
[0011]然后，以下将描述本发明的典型方面。本发明的第一方面是一种新型蛋白质，所述蛋白质包含(I)抗CD14抗体或其活性片段，或其衍生物和(II)蛋白酶的抑制剂，或其活性片段，或其衍生物。更具体的是，该方面的新型蛋白质是· (1)一种蛋白质，所述蛋白质包含(I)抗CD14抗体或其活性片段，或其衍生物和(II)蛋白酶的抑制剂，或其活性片段，或其衍生物，
(2)如(I)所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是蛋白质抑制剂，(3)如⑴或⑵所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是多价酶抑制剂，
(4)如⑴~(3)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是凝血因子(凝血蛋白酶)或炎性蛋白酶，
(5)如(I)~⑷中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是FXa和/或FXIa,
(6)如(I)~⑷中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是凝血酶，
(7)如⑴~(6)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于UTI，
(8)如(I)~(6)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于凝血调节蛋白，
(9)如(I)~(6)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于UTI结构
域2，
(10)如⑴~⑶中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于凝血调节蛋白的功能结构域，尤其是EGF样结构域，
(11)如(I)~⑷中任一项所述的蛋白质， 其中，(II)中的所述蛋白酶是弹性蛋白酶，
(12)如⑴~(4)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是分泌性白细胞蛋白酶抑制剂，
(13)如(I)~(11)中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是具有I~4个氨基酸取代的UTI结构域2的突变体，
(14)如(I)~(13)中任一项所述的蛋白质，其中，⑴中的所述抗CD14抗体是具有中和活性的抗体，
(15)如(I)~(14)中任一项所述的蛋白质，其中，⑴中的所述抗CD14抗体是识别人类⑶14的氨基酸序列269~315的至少一部分的抗体，
(16)如(I)~(15)中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是嵌合抗
体，
(17)如(I)~(16)中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是人源化抗体，或
(18)如(I)~(17)中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是下述抗体:该抗体包含表2中所描述的重链的⑶R1XDR2和⑶R3作为所述重链可变区中的⑶R1、⑶R2和⑶R3，或包含表2中所描述的轻链的⑶R1、⑶R2和⑶R3作为所述轻链可变区中的CDR1、CDR2 和 CDR3。
[0012]本发明的第二方面是一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据第一方面的蛋白质的至少一部分。更具体的是，该方面的多核苷酸是
(19)一种多核苷酸,所述多核苷酸编码如(I)~(18)中任一项所述的蛋白质的至少一部分。
本发明的第三方面是一种载体，所述载体包含根据本发明第二方面的多核苷酸，更具体的是，该方面的载体是
(20)—种载体,所述载体包含如(19)所述的多核苷酸。
本发明的第四方面是一种细胞，所述细胞包含根据本发明第二方面的多核苷酸或根据本发明第三方面的载体。更具体的是，该方面的细胞是(21)—种细胞，所述细胞包含如(19)所述的多核苷酸或如(20)所述的载体。
本发明的第五方面是一种方法，所述方法用于制造根据本发明第一方面的蛋白质，该方法使用根据本发明第二方面的多核苷酸、根据本发明第三方面的载体和根据本发明第四方面的细胞中的至少一种。更具体的是，该方面的方法是
(22)—种方法，所述方法用于制造如(I)~(18)中任一项所述的蛋白质，该方法使用如(19)所述的多核苷酸、如(20)所述的载体和如(21)所述的细胞中的至少一种。
本发明的第六方面是一种用于疾病的预防和/或治疗剂，所述用于疾病的预防和/或治疗剂包含根据本发明第一方面的蛋白质、根据本发明第二方面的多核苷酸、根据本发明第三方面的载体和根据本发明第四方面的细胞中的至少一种。更具体的是，该方面的所述预防和/或治疗剂是
(23)—种用于疾病的预防和/或治疗剂，所述用于疾病的预防和/或治疗剂包含如(I)~(18)中任一项所述的蛋白质，如(19)所述的多核苷酸、如(20)所述的载体和如(21)所述的细胞中的至少一种，或
(24)如(23)中所述的预防和/或治疗剂，其中，所述疾病是败血症、严重败血症或败血病性休克、SIRS相关疾病、内毒素休克或ARDS。
发明效果
[0013]本发明的新型蛋白质对于疾病或病状，或与该疾病或病状有关的特定症状或疗效指标有效，而对于所述情况 单独使用抗CD14抗体或蛋白酶抑制剂是无效的或效果不充分。所述蛋白质同时显示出稳定的体内消炎作用、抗凝血作用和/或弹性蛋白酶的抑制作用，因此，所述蛋白质可以用作用于败血症的预防和/或治疗剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1显示了抗体F1024的重链可变区的DNA序列和氨基酸序列。
图2显示了抗体F1024的轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。
图3显示了抗体F1031-13-2的重链可变区的DNA序列和氨基酸序列。
图4显示了抗体F1031-13-2的轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。
图5显示了抗体F1031-13-2的重链可变区的DNA序列和氨基酸序列。
图6显示了抗体F1031-13-2的轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。
图7是显示融合蛋白质F1024D-D1D2的全部氨基酸序列的结构的视图。
图8是显示融合蛋白质F1024D-D2的全部氨基酸序列的结构的视图。
图9是显示融合蛋白质F1024D-D2(3)的全部氨基酸序列的结构的视图。
图10是显示融合蛋白质F1024S-D1D2的全部氨基酸序列的结构的视图。
图11是显示融合蛋白质F1024S-D2的全部氨基酸序列的结构的视图。
图12是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)的全部氨基酸序列的结构的视图。
图13是显示融合蛋白质F1024D-SLP1(D1D2)的全部氨基酸序列的结构的视图。
图14是显示融合蛋白质F1024D-SLP1(D2)的全部氨基酸序列的结构的视图。
图15是显示融合蛋白质F1024S-SLP1(D1D2)的全部氨基酸序列的结构的视图。
图16是显示融合蛋白质F1024S-SLP1(D2)的全部氨基酸序列的结构的视图。
图17是显示融合蛋白质F1031-13S-D2(3)的全部氨基酸序列的结构的视图。图18是显示F1024(抗⑶14抗体)或抗体融合蛋白质对于通过LPS诱导的U373MG细胞的IL-6的合成的抑制性活性的视图。 图19是显示F1024(抗⑶14抗体)或抗体融合蛋白质对于通过LPS诱导的U373MG细胞的IL-6的合成的抑制活性的视图。
图20是显示抗体融合蛋白质对IL-6的合成的抑制活性的视图。
图21是显示UTI及抗CD14抗体融合蛋白质的蛋白质胰蛋白酶抑制活性的视图。
图22是显示抗CD14抗体融合蛋白质的因子Xa的抑制活性的视图。
图23是显示抗CD14抗体融合蛋白质因子Xia的抑制活性的视图。
图24是显示抗CD14抗体融合蛋白质的弹性蛋白酶抑制活性的视图。
图25是显示抗CD14抗体融合蛋白质的血浆激肽释放酶抑制活性的视图。
图26是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)对于改善LPS诱导型家兔败血症样本的存活率的效果的视图。
图27是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)对于LPS诱导型家兔败血症样本的白细胞计数(初次施用LPS后28小时LPS诱导型家兔败血症样本的白细胞计数)的效果的视图。
图28是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)对于LPS诱导型家兔败血症样本的血小板计数(首次施用LPS后26小时LPS诱导型家兔败血症样本的血小板计数)的效果的视图。
图29是显示融合蛋白质F1024S-D2(3)对于LPS诱导型家兔败血症样本的抗凝血酶(AT) III活性减小(首次施用LPS后28小时LPS诱导型家兔败血症样本的抗凝血酶(AT)III活性的减小)的效果的视图。
图30是显示通过融合蛋白质F1024S-D2(3)对LPS诱导型家兔败血症样本的血压降低的改善的视图。
图31是显示与抗体F1024的竞争性结合的实验结果的视图。
图32显示了融合蛋白质F1024-D2的修饰UTI结构域2的氨基酸序列。
图33显示了融合蛋白质F1024-D2的修饰UTI结构域2的氨基酸序列。
图34显示了融合蛋白质F1024-D2的修饰UTI结构域2的氨基酸序列。
图35显示了融合蛋白质F1024-D2的修饰UTI结构域2的氨基酸序列。
图36是显示融合蛋白质F1024S-D2(4)的全部氨基酸序列(R11S / R15T / Q19K /Y46D)的视图。
图37显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。
图38显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。
图39显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。
图40显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。
图41显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。
图42显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。
图43显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。
图44显示了融合蛋白质F1024-TM中TM的修饰功能结构域的氨基酸序列。
图45是显示融合蛋白质F1024S-TM23456L的全部氨基酸序列的结构的视图。
图46是显示融合蛋白质F1024S-TM中TM的修饰功能结构域的凝血调节蛋白活性的视图。图47是显示人源化F1024S-D2(3)的全部氨基酸序列的结构的视图。
图48是显示F1024-1-3大鼠抗体的重链及轻链可变区的氨基酸序列的视图；和具有与人源化F1024S-D2(3)的重链及轻链可变区的高度同源性的人类抗体的氨基酸序列的视图。
图49是显示能够表达人源化抗体的重链并维持结合活性的氨基酸序列的视图。
图50是显示APTT试剂诱导的人血浆中舒缓激肽的合成的抑制的视图。
图51是显示APTT试剂诱导的兔血浆中舒缓激肽的合成的抑制的视图。
图52是显示促凝血酶原激酶诱导的人血浆中凝血酶的合成的抑制的视图。
图53是显示促凝血酶原激酶诱导的兔血浆中凝血酶的合成的抑制的视图。
图54是显示施用F1024S-D2(3)后F1024S-D2 (3)对于LPS诱导型家兔全血中的TNF-α合成的抑制作用的时间进程的视图。
图55是显示对家兔施用F1024S-D2(3)后APTT的时间进程的视图。
图56是显示对家兔盲肠结扎穿孔(CLP)样本施用F1024S-D2(3)后的存活率的时间进程的视图。
图57是显示对家兔盲肠结扎穿孔(CLP)样本施用F1024S-D2(3)后血浆中的D 二聚物水平的视图。
【具体实施方式】
[0015]下面，将对本发明进行更详`细的描述。
根据本发明第一方面的蛋白质并不特别限定其类型。示例性蛋白质包括单纯蛋白质(或多肽)和复合蛋白质(如糖蛋白)。
在根据本发明第一方面的蛋白质中，(I)抗CD14抗体或其活性片段，或其衍生物与(II)蛋白酶的抑制剂或其活性片段，或其衍生物之间的结合不受特别限制。尽管(I)和(II)通常通过共价键连接，不过它们也可以通过例如化学手段(化学合成或化学结合)或遗传工程连接。根据本发明第一方面的蛋白质优选是由遗传工程制造的融合蛋白质。
[0016]蛋白酶抑制剂(II)可以是与抗体的重链及轻链中的一个或两个结合的蛋白酶抑制剂。典型地，所述蛋白酶抑制剂(II)与重链融合，尤其是抗体重链的C端侧。对抗体连接的蛋白酶抑制剂(II)分子的数目不受特别限制，一个或两个或两个以上的分子可以与抗体连接。如果需要，所述连接可以通过使用适宜的连接物或间隔物完成。这样的方法、连接物、间隔物等等对于本领域的技术人员是公知的，其典型例在实施例中进行描述。
[0017]在本发明的蛋白质中，抗CD14抗体(1)或蛋白酶抑制剂(II)的活性片段是下述片段:其包含能够表达或保持抗CD14抗体(1)或蛋白酶抑制剂(II)中固有的各活性或功能中的至少一种的部分，并包含活性区或功能结构域。在本发明的蛋白质中，抗CD14抗体(I)、蛋白酶抑制剂(II)、或其活性片段的衍生物是包括某些修饰、突变或添加的抗CD14抗体(1)、蛋白酶抑制剂(II)、或其活性片段，例如，包含其他化学物质(如聚乙二醇)的种类，或与突变有关的种类，如添加、删除、插入或取代至少一个，优选一个至数个氨基酸。换言之，(I)、(II)及其活性片段的衍生物包括(I)、(II)及其活性片段的突变体、修饰型和修饰产物，并且它们能够表达或保持抗CD14抗体(1)、蛋白酶抑制剂或其活性片段中固有的各活性或功能中的至少一种，优选为全部。
[0018]根据本发明第一方面的蛋白质表达或保持抗CD14抗体(1)和蛋白酶抑制剂(II)中固有的各活性中的至少一种，优选为全部。由于根据本发明第一方面的蛋白质具有抗⑶14抗体(1)和蛋白酶抑制剂(II)中固有的各活性中的至少一种，优选为全部，因此其对于疾病或病状，或与该疾病或病状有关的特定症状或疗效指标有效，而对于所述情况单独使用抗CD14抗体或蛋白酶抑制剂是无效的或效果不充分。
在根据本发明第一方面的蛋白质中，蛋白酶抑制剂(II)不受特别限制，其可以为非蛋白质抑制剂或低分子量化合物。不过所述蛋白酶抑制剂(II)优选为蛋白质抑制剂。
[0019]尽管所述蛋白酶抑制剂(II)也可以为对于特定酶具有特异性的种类，但所述蛋白酶抑制剂(II)优选为抑制两个或两个以上酶的多价酶抑制剂。具有多价酶抑制作用的示例性物质包括Kun i t Z型蛋白酶抑制剂，如尿道胰蛋白钠抑制剂(UTI )、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、组织因子途径抑制剂(TFPI)和抑肽酶，其中，优选UT1、SLPI和TFPI。
UTI是与比库宁或乌司他丁相同的蛋白酶抑制剂，是用于诸如胰蛋白酶、血纤维蛋白溶酶和中心粒细胞弹性蛋白酶等蛋白酶的抑制剂。
SLPI是用于中心粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶等蛋白酶的抑制剂。
TFPI是也被称为脂蛋白相关凝结抑制物(LACI)或外源性途径抑制物(EPI)的蛋白酶抑制剂。TFPI与凝血因 子Xa (FXa)结合从而抑制因子VIIa—组织因子(factor III)复合体，由此抑制外源性凝血的开始。
[0020]其他的多价酶抑制剂包括α2_巨球蛋白(a2-MG)、抗凝血酶ΙΙΙ(ΑΤΠΙ)和a 1-抗胰蛋白酶(al-AT)。a 2_MG是具有约为770，000的巨大分子量的血浆蛋白质，并抑制凝血酶、FXa、血纤维蛋白熔酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶等。ATIII与诸如FXa或凝血酶等丝氨酸蛋白酶以1:1的比率形成复合体，由此控制凝结。ATIII在其N端具有肝素结合域，并在其C端具有与凝血酶反应的反应活性位，ATIII的抗凝血酶活性通过与肝素结合而增大约1000倍。a 1-AT是包含394个氨基酸的糖蛋白，其分子量为51000。a 1-AT抑制包括凝血酶、血纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶等各种丝氨酸蛋白酶。
[0021]本发明的蛋白质中的蛋白酶抑制剂(II)优选为对包括诱发抗凝血剂作用或舒缓激肽和成的因子的凝血因子(凝血蛋白酶)具有抑制作用，尤其是对活化凝血因子具有抑制作用，或对于炎性蛋白酶具有消炎作用或抑制作用的抑制剂。典型的凝血因子包括激肽释放酶、凝血酶、？￥&、？￥11&、？￥111&、？^&、？乂&、？乂1&、？乂11&和 FXIIIa，其中，激肽释放酶、凝血酶、Fva, FVIIIa, FIXa, FXa、FXIa是重要因子，凝血酶或FXa和FXIa是最重要的靶标酶。典型的炎性蛋白酶包括弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和caphepsin，其中，弹性蛋白酶，特别是中心粒细胞弹性蛋白酶和胰弹性蛋白酶，尤其是中心粒细胞弹性蛋白酶是最重要的靶标酶。本发明的蛋白质或本发明的蛋白质中的抑制剂(II)的蛋白酶抑制活性可通过各种已知材料和方法进行测定，其典型例在实施例中描述。
[0022]具有抗凝血作用或对于凝血因子的抑制作用的抑制剂可以是本领域中已知的物质。其实例包括TFP1、ATII1、a 1-AT和a 2-MG ；以及UTI和凝血调节蛋白(TM);它们的活性片段及其衍生物，并优选TM或UT1、它们的活性片段或其衍生物，更优选对于FXa和/或FXIa具有抑制活性的TM的功能结构域或UTI结构域2 (UT1-D2)，或它们的修饰型，尤其是具有3个氨基酸取代(UT1-D2(3))的突变体。UT1、UT1-D2和UT1-D2(3)的氨基酸序列及核苷酸序列以及它们的制造方法描述在JP5-84083A，JP5-308988A, JP6-25289A和JP6-321989A中，它们可以通过参考这些文献而制造。
凝血调节蛋白(TM)是通过血管内皮细胞制造的抗凝血剂中的一种，当TM与细胞膜上的凝血酶形成复合物时，蛋白质C将随后被激活，血液凝固受到抑制。TM在1981年被发现，存在于血管内皮细胞上的该物质将凝血酶由凝结酶转化为抗凝酶。TM也可以直接抑制凝血酶的活性，并促进蛋白质C(PC)的活化，所得的活化蛋白质C(APC)通过钝化被激活的凝血因子V(FVa)和因子VIII (FVIIIa)而促成凝血级联的负反馈，从而抑制凝血酶的生成。换言之，TM以取决于凝血酶的方式同时抑制凝结活性和纤维蛋白溶解活性。与肝素的情况相反，由于该作用不需要抗凝血酶III，因此可以认为该过程对于促进出血倾向的风险较低。 由于TM的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列，以及TM的结构域的结构和功倉泛是已知的(例如，Kurosawa, S，Supplementary volume of Progress in Medicine (inJapanese), “Blood Disease-State of Arts (Vet.2)，，，1998,第 205-207 页)，因此用于本发明的TM、其活性片段及衍生物的制备，和它们的活性评价可以通过参考如JP1-6219A和TO88 / 5053等公报而进行。TM包含5个结构域，即，凝集素样结构域、上皮生长因子(EGF)样结构域、O连接糖基化结构域、横跨膜样结构域和来自细胞外N端的细胞质结构域(Kurosawa, S.et al.，J.Biol.Chem.，263，5993，1988)，其中，EGF 样结构域包含 6 个重复单元(该结构域在本发明中有时也称为EGF1-6或TM123456)。最小活性单元被假定为EGF样结构域的四至六个重复单元，即EGF4-6。
TM的优选活性片段、衍生物和功能结构域的实例包括EGF样结构域；包含EGF样结构域的TM的活性片段或其衍生物；EGF样结构域的活性片段或其衍生物，其优选EGF4-6，更优选为EGF3-6，最优选为EGF2-6 ;包含这样的部分的TM的活性片段或其衍生物，例如，在各实施例中制备的TM的活性片段或其衍生物，尤其是TM23456M、TM234567M、或它们的活性片段或衍生物。衍生物的优选例包括其中TM的氨基酸N0.388的蛋氨酸被亮氨酸取代的突变体(M388L)，它们是TM23456L和TM234567L。这些衍生物的制造和评价可以通过本领域中已知的方法完成，其典型例在实施例中描述。
[0023]各种抑制剂已知对炎性蛋白酶具有消炎作用或抑制作用。尽管可以使用各种已知的抑制剂，不过最优选的是弹性蛋白酶抑制剂。其典型例包括UT1、UT1-D2、SLP1、a 1-AT和a 2-MG及其活性片段或衍生物；优选例是UTI，尤其是具有弹性蛋白酶抑制活性的修饰UTI结构域2，例如具有3个氨基酸取代的UT1-D2的突变体、具有4个氨基酸取代的UT1-D2的突变体(也称为UT1-D2(4))和SLPI，特别是SLPI的下游部分(C端的多肽)。SLPI和下游部分(C端的多肽)的氨基酸序列、核苷酸序列和及其制造方法在JP6-80697A等中进行了描述，所述公报可用作参考。
具有3或4个氨基酸取代的UT1-D2的突变体的典型例显示在实施例7的表9中，最优选 UT1-D2(4)(R1IS / R15T / Q19K / Y46D)。
具有对于FXa和/或FXIa的抑制活性和弹性蛋白酶抑制活性的修饰UTI结构域2是最优选的。[0024]在根据本发明第一方面的蛋白质中，抗CD14抗体不受特别限制，只要其与CD14结合，优选与人类CD14结合即可。在本发明的蛋白质中，所述抗CD14抗体(1)与蛋白酶抑制剂协同作用，并改善所述蛋白质或抑制剂的功能或效果。根据本发明第一方面的蛋白质中的抗CD14抗体(1)不受是否存在CD14抑制作用所限。不过，所述抗CD14抗体(1)优选为具有CD14抑制作用的抗体。此处使用的术语“CD14抑制作用”是抑制CD14的功能的至少一种功能的作用，例如，与LPS的结合能力、与TLR的相互作用和TLR表达细胞的活化，更具体地，NF-kB的活化、IL-8的合成或通过内皮细胞对诸如IL-6等细胞因子的合成；优选地为抑制CD14与TLR之间的结合，尤其是CD14与TLR2或TLR4之间的结合的作用。[0025]示例性优选抗体包括已知的抗⑶14抗体，尤其是在W002 / 42333等中公开的抗体,和通过已知方法,例如,在W002 / 42333等中公开的方法制造的那些抗体。由这样的抗体制造的嵌合抗体和人源化抗体也包括在本发明的蛋白质的抗CD14抗体中。
[0026]在本发明的蛋白质中，对所述抗CD14抗体的识别区或结合区不做特别限制，只要该抗体与CD14结合，优选与人类CD14结合即可。不过，所述抗CD14抗体优选是识别或结合人类⑶14的C端区，尤其是氨基酸序列N0.269~315，更优选氨基酸序列N0.285~307，最优选氨基酸序列N0.294~296的至少一部分的抗体。更具体地,所述抗⑶14抗体是识别或结合CD14的所述部分或CD14上的抗原定子的抗体。在表5中所述的CD14的CD14氨基酸取代型突变体(以下有时称为氨基酸取代产物、氨基酸取代修饰型或氨基酸修饰型)中，优选的是相较于与人类⑶14的结合能力来说，与P294H、Q295A、P296H和P294 / 296A中的至少一个并优选全部的结合能力明显下降的抗体，更优选的是其与其他突变体的结合能力并未因该下降的结合能力而实质上发生改变的抗体。本发明的蛋白质中的抗CD14抗体(1)可以通过使用已知的物质和方法，例如，在W002 / 42333中描述的物质和方法确认。不过优选例在实施例中进行描述。
此外，在表5中所示的突变体中，利用这点:即相较于用于所述指标的与人类CD14的结合能力来说，与P294H、Q295A、P296H和P294 / 296A中的至少一个且优选为全部的结合能力明显下降，更优选地，利用这点:即除了用于所述指标的与特定突变体的结合能力下降之外与其他突变体的结合能力缺乏实质变化，易于检测、识别或制备具有CD14抑制活性的抗⑶14抗体。本发明也提供这样的方法。
[0027]在根据本发明第一方面的蛋白质中，所述抗体(1)优选是单克隆抗体，尽管该抗体也可以为多克隆抗体，其来源并不限于特定种类。考虑到制造所述抗体的容易性时，所述来源优选是小鼠或大鼠。考虑到构成药物组合物时，所述抗体优选为嵌合抗体、CDR嫁接抗体、人源化抗体或人类抗体。所述人类抗体也可以包括通过将表达人类抗体基因的基因转录过的小鼠免疫而制造的人类抗体。本发明的抗体还包括噬菌体抗体等。所述人源化抗体是其中的恒定区和框架区(FR)来自人类，互补决定区(CDR)来自非人类的CDR移植抗体，或在其FR中具有引入的其他突变体的抗体。噬菌体抗体是通过将抗体与丝状噬菌体的病毒外壳蛋白融合而制造的抗体用以表达噬菌体颗粒上的抗体，主要使用单链Fv(ScFv)形或Fab形。嵌合抗体是包含来自人类之外的哺乳动物，例如大鼠或小鼠的单克隆抗体的可变区，和人类抗体的恒定区的抗体。在根据本发明第一方面的蛋白质中，对抗体(1)的分子物种不作特别限定，所述抗体可以为属于任何纲(例如IgG、IgM和IgA，尤其是IgG)、亚纲(例如，IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，尤其是IgG4)或同种型的抗体。关于所述抗体的轻链，可以使用卡巴链和拉姆达链中的任何一种。本发明中还包括活性片段或衍生物，如具有生物活性的Fab (抗原结合段)、Fab’、(Fab’)2、通过连接物等连接的抗体活性片段，如单链抗体(单链 Fv:scFv) (Bird,R.E.et al.,Science, 1988 ；242:423-426)、二硫化物稳定抗体(二硫化物稳定 Fv:dsFv) (Reiter et al.，Protein Engineering, 1994 ；7:697)和双价小抗体(Hoiliger P.et al., Proc Natl Acad Sci USA1993 ；90:6444-8),单结构域抗体(dAb)(Ward E.S.et al., Nature., 1989 ；341: 544-6)等。这些抗体可以通过本领域中已知的技术如遗传工程技术和利用适宜的蛋白酶对抗体的处理而制造。
[0028]嵌合抗体是通常利用遗传工程手段制造的抗体，其中的轻链基因和重链基因由属于不同物种的抗体基因段构成。例如，来自大鼠或小鼠单克隆抗体的基因中的可变(V)段可以与人类恒定(C)段，如Y I和Y4连接。因此，用于治疗目的的典型嵌合抗体是包含来自大鼠或小鼠抗体的V或抗原结合域和来自人类抗体(也可以使用其他的哺乳动物种类)的C或效应结构域的杂化蛋白质。
根据本发明的第一方面中的抗体(1)可变区序列的优选例显示在图1和2中(SEQ IDNO:123~126)，其中的抗体是嵌合抗体的融合蛋白质的优选例是图7~17中和实施例中所示的嵌合抗体。
[0029]尽管抗体在与抗原结合时通常为多价(在IgG的情况中为二价)，但本发明的蛋白质中的抗体(1)在一些阶段中优选为单价。典型的这种抗体是如下制造的单价抗体:将氨基酸突变引入Fab中，或抗体的恒定区中，尤其是重链的恒定区(CH)中，从而防止重链之间的二硫键的常规形成，典型地，用另一种氨基酸残基取代Cys残基，尤其是抗体重链的铰链区中的Cys残基。其优选例在实施例中进行描述。
[0030]已经报道了关于“互补决定区(OTR) ”的多种定义和确定其位置的方法，在本发明中可以米用任何一种。典型例包括Kabat的定义(Sequences of proteins of i mmunological interest,5th ed., U.S.Department of Health and Human Services,1991)和Chothia 的定义(Chothia and Lesk,` J.Mol.Biol.，1987 ; 196:901-917)。在本发明中，优选的⑶R是根据Kabat的定义的⑶R，不过⑶R并不限于这样的类型。在一些情况中，⑶R可以通过同时考虑Kabat的定义和Chothia的定义而确定。例如，⑶R可以是根据两种定义的⑶R的重叠区或涵盖根据两种定义的⑶R的区域。所述方法的典型例是使用OxfordMolecular’ s AbM 的抗体模型软件的 Martin 等的方法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1989 ；86:9268-9272)，这种方法是Kabat的定义和Chothia的定义的折衷方法。
[0031]“框架区”是轻链及重链可变区中的区域，正如在由Kabat等定义的区域的情况中其可以显著地保存在单一物种的各种抗体中(即，不同于CDR的区域)。在本发明中，“人类框架区”是指基本上与天然存在的人类抗体或者某些这样的抗体之间的公共序列的框架区相同(同源性约为85%以上)的框架区。
“人源化抗体”是包含人类框架和来自非人类抗体的至少一个CDR的抗体，人源化抗体的恒定区基本上与人类抗体的恒定区相同，即，同源性水平为至少约85%~90%，优选至少95%。因此，除⑶R之外的人源化抗体每一部分有可能基本上与至少一个天然人类抗体序列的对应部分相同。例如，所述人源化抗体不包括包含小鼠可变区/人类恒定区的嵌合抗体。[0032]该人源化抗体，更具体地，本发明的抗体(1)是包含来自人类受体抗体，优选来自单一人类受体抗体的框架区(FRs)的一个链，更优选为全部(对于每个链为4)的至少一个，优选全部⑷；和来自抗体F1024的互补决定区(⑶Rs)的至少一个，优选全部(对于每个链为3)的人源化抗体。该抗体可以包含2对轻链/重链复合物，并且至少一个链，尤其是重链包含至少一个，优选全部⑶来自施主抗体(如大鼠或小鼠抗体，其适用于下列说明)的互补决定区，这些互补决定区与人类框架区段功能性连接。例如，施主的互补决定区可以被引入具有或不具有天然伴随的氨基酸残基的人类框架区中。更具描述性地，本发明的人源化抗体是包含表2中所示的任一种⑶Rs的氨基酸序列或由其构成的⑶Rs的至少一个，优选全部(对于每个链为3)的抗体，在人源化抗体中，每一个CDR和所述框架优选位于相当于它们在原始施主抗体中的位置的位置。
[0033]用作本发明的抗体(1)的人源化抗体在人源化抗体的重链可变区的框架与施主抗体的重链可变区的框架之间具有的同源性(序列一致性的百分数)为65%~95%，优选为70%~90%。在标准过程中，所述框架序列来源于同一人类抗体的重链和轻链，从而降低在将两种链组合时的不相容的风险。然而，所述框架序列也可以来源于两种或两种以上不同的人类抗体。
[0034]关于所述人类框架区，所述序列可以通过将由其获得CDRs的非人类抗体的框架或可变区的氨基酸序列与人类抗体序列集合中的对应序列进行比较，并选择具有高同源性的序列而获得。优选地，框架氨基酸序列的同源性为至少60%，更优选至少65 %。另外，受体抗体的重链可变区的氨基酸序列选自人类抗体的重链可变区的典型集合中的5个，更优选为3个序列，这些序列与施主抗体的重链可变区的氨基酸序列具有最高同源性。人源化抗体的设计可以如下述完成。
[0035]I)当特定氨基酸序列与下列范畴(a)~(C)相应时，人类抗体(受体抗体)的框架中该特定氨基酸可以由来自非人类抗体(施主抗体)的氨基酸取代。
(a)所述受体抗体的人类框架区中的特定氨基酸很少在人类抗体的位置被发现，而施主抗体中的该对应氨基酸通常在人类抗体的位置被发现；
(b)所述特定氨基酸临近或接近一级序列中的CDRs之一；或
(c)所述特定氨基酸在施主抗体或人源化抗体的三维模型中在约5埃，优选4埃，更优选 3 埃的距离具有一个原子(Co et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1991 ；88:2869)。
[0036] 2)当受体抗体的人类框架区中的特定氨基酸和施主抗体中的对应氨基酸在人类抗体的相应位置罕见时，所述氨基酸可由通常在人类框架的相应位置被发现的氨基酸取代。
对于人源化抗体的制造的详细描述，可以参考Queen et al., Proc, Natl.Acad.Sc1.USA, 1989 ；86: 10029,W090 / 0786LW092 / 11018,Co et al.,Proc,Natl.Acad.Sc1.USA,1991 ；88:2869, Co and Queen, Nature, 1991 ；351:501 和 Co et al., J.1mmunol., 1992 ；148:1149,此处通过引用而引入。
[0037]通常希望所有的或绝大部分的氨基酸取代达到上述标准。然而，由于不确定性与关于单个氨基酸是否实际上与上述标准相一致的判断有关，并且所制造的各种抗体包括具有和不具有特定位置的取代的抗体，因此CDR和FR的最优化可通过计算机模拟进行。
[0038]当具有高同源性的人类抗体的V区被发现时，施主抗体的CDR序列，尤其是抗体F1024被移入该V区的框架部分，并且可以通过计算机分子模型来模拟所述构造。在该步骤中使用的程序包括ABMOD和ENCAD (Biochemistry，1990 ；29:10032)。通过该构造模拟，最优化可如下完成:用其他氨基酸取代CDR附近的FR中的氨基酸，从而使CDR区的氨基酸排列实现与CD14的最优化的结合活性。
[0039]作为选择，⑶R和FR的最优化也可以通过使用施主抗体，尤其是抗体F1024的FR的一部分的氨基酸序列(该序列中没有任何变化)，并将该序列移入人类抗体的V区中而实现。在这种情况中，抗体F1024的⑶R和FR的一部分的序列被移入人类抗体的V区，并利用计算机分子模型模拟构造。可用于该步骤的示例性程序包括Modeler和QUANTA /CHARMm(Molecular Simulations)。
当轻链中的3~4个部位和重链中的7~8个部位以来自施主，例如大鼠的氨基酸取代时，FR将具有与大鼠抗体相似的结构，CDR区中的氨基酸排列有助于优化与CD14的结合活性。
[0040]只要抗⑶14抗体的结合活性保持，单个或2个或2个以上的氨基酸的删除、取代、插入或添加就可以在CDR区的氨基酸中进行。在这种情况中，当取代发生在被分为同组的氨基酸之间，例如在Gly和Ala之间；Val、Leu和Ile之间；Asn和Gln之间；Cys和Met之间；*LyS和Arg之间，则抗⑶14抗体的结合活性更有可能保持。另外，在框架区的某些位置的氨基酸涉及与抗原的直接相互作用，例如，以共价结合的方式与抗原接触，而且这样的位置也会经历上述取代。尤其是，在重链的第26个~第30个氨基酸根据其构造被描述为超变环的一部分(Chothia and Lesk, J.Mol.Biol.，1987 ；196:901-917)，并且这样的区域也可以如⑶R的情况中一样被移植。
[0041]人源化抗体基于所得的氨基酸序列制备。例如，人源化抗体的核苷酸序列可以根据由此确定的氨基酸序列确 定，并由此制造编码该人源化单克隆抗体的基因。更具体地，编码CDR的DNA由编码人类V区的基因中删除，取代地插入编码来自诸如大鼠等施主的CDR的DNA。根据基于分子模型结果的变化的氨基酸，相应的DNA序列可通过例如使用PCR的定位诱变而改变，由此制造重组人类V基因。该基因被克隆为包含人类抗体的重链及轻链的C区的载体，从而制造表达载体。通过改变用于该阶段的来自人类的序列，可以制造所需亚纲的抗体，例如人类IgGl或IgG3，优选IgG4等。所述表达载体可以被引入小鼠骨髓瘤细胞Sp2 / 0-Agl4(ATCC CRL1581)或仓鼠卵巢细胞CHO中并在其中被表达。
[0042]所述人源化抗体用于人类的治疗处理时，与非人类抗体，如小鼠或大鼠抗体，在一些情况中为嵌合抗体相比具有至少三个潜在优点。
1)由于有效部分来源于人类，因此抗体与人类免疫系统的其他部分的相互反应更好(例如，通过补体依赖的细胞毒性(⑶C)或抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)可以更有效地破坏靶细胞)。
2)人类免疫系统不识别作为异物的人源化抗体的框架或C区，因此，与完全是外来的小鼠抗体或部分外来的嵌合抗体相比，使用所述抗体时的该抗体的响应下降。
3)据报道被施用的大鼠和小鼠抗体在人类的血液循环中具有的体内半衰期比正常抗体短得多(Shaw，D.et al.，J.1mmunol.，1987 ；138:4534-4538)。所述人源化抗体在施用后可能具有或多或少与天然存在的人类抗体的半衰期相似的半衰期，有效施用通过使用较少的量或通过以较低的频率施用就可完成。[0043]抗CD14抗体(1)可包括各种抗体，尤其是各种人源化抗体，其具有在实施例中描述的抗体，尤其是F1024的CDRs中的至少一个，所描述的抗体在该抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)中优选具有位于相应位置的3个CDR，更优选具有该抗体的全部6个⑶R。更具体地，抗⑶14抗体(1)是包含表2中所描述的重链的⑶R1XDR2和⑶R3作为所述重链可变区中的⑶R1、⑶R2和⑶R3，或包含表2中所描述的轻链的⑶R1、⑶R2和⑶R3作为所述轻链可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的抗体，尤其是人源化抗体。
[0044]当抗CD14抗体(1)是人源化抗体时，用于制造的示例性方法包括其中的杂交瘤通过利用体外免疫作用导致人类淋巴细胞的活化而制造的方法；通过施用人类抗体噬菌体库执行的方法；和其中的杂交瘤通过使用具有重组人类抗体基因的非人类动物，尤其是诸如KM小鼠等转基因小鼠而制造的方法(W02002 / 070648 (JP2005-504507A)和W02002 /043478 (JP2004-515230A))。
[0045]人类抗体噬菌体库是如下生成的文库:将由人类B细胞制备的抗体基因插入噬菌体基因中，从而促进诸如Fab和单链抗体等抗体的活性片段在噬菌体表面上的表达。本发明的抗体还可以通过筛查该文库而获得。这些和其他方法对于本领域的技术人员是公知的(Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989), Winter and Harris, Tmmunol.Todayl4:243-246(1993), Ward et al., Nature341:544-546(1989), Harlow and Lane(1988)，supra),Hilyard et al.,Protein Engineering:A practical approach(IRL Pressl992),Borrabeck, Antibody Engineering,2nd ed.(Oxford University Pressl995), Barbas,C.F.1., Burton, D.R., Scott, J.K., and Silverman, G.J.2001.Phage display:alaboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold Spring Harbor, NewYork,USA.736pp.)。表达具有所需抗原结合活性的抗体的活性片段的噬菌体可以通过利用与其上固定有抗原的基质的用于所述指标的结合活性而由所述库收集。所述抗体的活性片段也可以通过基因工程转化为包含两个完整H链和两个完整L链的人类抗体分子。
[0046]根据本发明第二方面的多核苷酸可以为包含核苷酸的任何分子种类。所述多核苷酸可包括DNA和RNA以及多聚脱氧核苷酸和多聚核糖核苷酸。所述多核苷酸可以为混合物或其修饰产物，只要其编码根据本发明的第一方面的蛋白质的至少一部分即可。根据本发明第二方面的多核苷酸可以通过本领域`中已知的方法，特别是通过基因工程由合成的上述(I)和/或(II)的细胞而制造。其典型例描述在实施例中。
[0047]本发明的第二方面是编码所述蛋白质，优选所述融合蛋白质，更具体地是包含第一方面的抗体的融合蛋白质的多核苷酸。然而，由于所述抗体是固有地包含多种多肽链的蛋白质，因此本发明的多核苷酸包括其中的单分子多核苷酸编码本发明的蛋白质的情况，和其中的2分子或更多分子，例如2分子或3分子多核苷酸编码本发明的蛋白质的情况。典型例描述在实施例中。关于根据本发明第一方面的蛋白质的至少一部分，典型的多核苷酸是编码抗体的重链，尤其是其重链可变区(VH)部分，或重链部分和抑制部分，或优选它们的融合蛋白质的多核苷酸；或编码抗体的轻链，尤其是其轻链可变区(VL)部分，或轻链部分和抑制部分，或优选它们的融合蛋白质的多核苷酸。所述多核苷酸的优选例包括在序列表中以SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25所示的那些。
[0048]根据本发明第三方面的载体包括其中的根据本发明第二方面的多核苷酸存在于单个载体上的情况，和其中的多核苷酸存在于2个或2个以上载体，例如2个或3个载体上的情况。根据本发明第三方面的载体除了包含根据第二方面的多核苷酸之外，还可以包含复制所述载体所需的成分和控制根据本发明第二方面的多核苷酸的表达的成分。这样的其他成分对于本领域的技术人员是公知的。
用于与根据第二方面的多核苷酸结合的载体不受特别限制。不过所述载体优选为通常用于表达蛋白质基因的载体，尤其是适合于表达抗体或包含抗体的融合蛋白质的载体，或用于过表达的载体。示例性的优选载体包括包含人类延伸因子(EF)Ia启动子和/或CMV增强子的载体，例如，PEF-BOS或用于实施例的载体。尽管惯例是分别制备其中结合有编码VH部分，或VH部分与抑制部分，并优选VH部分和抑制部分的融合蛋白质的多核苷酸的表达载体，和其中结合有编码VL部分，或VL部分与抑制部分，并优选VL部分和抑制部分的融合蛋白质的多核苷酸的表达载体，且将这些载体在宿主细胞中协同转染，不过也可以将两种多核苷酸并入单个表达型造体中。上述过程可以通过使用已知的物质和方法进行，其典型例描述在实施例中。
[0049]根据本发明第四方面的细胞可以通过本领域中的已知方法将根据本发明第三方面的载体引入适宜的宿主细胞中而制备。这样的细胞的实例包括杂种细胞、转化细胞和其中引入有本发明的多核苷酸或载体的基因修饰细胞。所用的宿主细胞不受特别限制，优选通常用于蛋白质基因等的表达的宿主细胞，尤其是适宜用于表达抗体、包含抗体的融合蛋白质等的细胞。示例性宿主细胞包括细菌(如E.coli)、放线菌、酵母、昆虫细胞(如SF9)和哺乳动物细胞(如COS-1、CHO和骨髓瘤细胞)，并优选哺乳动物细胞。上述过程可以通过使用已知的物质和方法进行，其典型例描述在实施例中。
根据本发明第一方面的蛋白质可以通过使用根据本发明第二方面的多核苷酸或根据本发明第三方面的载体进行体外翻译而制造，或通过在适当的条件(本发明的第五方面)下培养根据本发明第四方面的细胞而制造。制得的蛋白质可以通过组合适宜的已知纯化方法而分离。其优选例描述在 实施例中。
[0050]根据本发明第六方面的用于疾病的预防和/或治疗剂是包含根据本发明第一方面的蛋白质、本发明第二方面的多核苷酸、根据本发明第三方面的载体和根据本发明第四方面的细胞中的至少一种作为其有效成分的药物组合物，本发明的多核苷酸和载体可用于例如基因疗法，所述转化细胞选可用于细胞疗法，其中可以选择性地加入药学上可接受的添加剂。
[0051]根据本发明第六方面的用于疾病的预防和/或治疗剂可应用于各种疾病或病状，或与该疾病或病状有关的特定症状或疗效指标。尽管这些疾病、病状和特定的疗效指标不限于任何特定类型，但其优选为与CD14的分布或功能、蛋白酶的分布或功能或细菌感染有关的疾病。因此，本发明的预防和/或治疗剂可用于败血症及其相关疾病、全身疾病或心血管疾病、传染病、炎性疾病、呼吸道疾病或呼吸衰竭、自身免疫性疾病、多器官功能障碍综合征(MODS)或单个器官的衰竭或功能障碍。更具体地，本发明的预防和/或治疗剂可用于败血症及其相关疾病，如严重败血病、败血性ARDS和败血病性休克；SIRS相关疾病；休克如内毒素休克、外毒素休克、出血性休克和外科手术进行时或手术后休克；全身或心血管疾病如缺血再灌注器官衰竭、局部缺血性脑病，急性缺血性发作、急性期脑血栓、急性冠状微脉管栓塞、由休克导致的血管栓塞、弥漫性血管内凝血(DIC)、心肌梗塞及其后效应和低血压；感染性疾病如牙周病急性细菌性脑膜炎、侵袭性葡萄球菌感染症、传染性心内膜炎、极性病毒性脑炎和AID S ;炎性疾病如牛皮癣、胃炎、消化性溃疡、胰腺炎、肾炎、心肌炎、肺炎、肝炎、肝硬化、脑炎、骨关节炎、特应性皮炎、变应性接触性皮炎、过敏性鼻炎、反流性食管炎和强直性脊柱炎；呼吸疾患或呼吸衰竭如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、婴儿呼吸窘迫综合症(IRDS)、慢性阻塞性肺病(⑶PD)、肺气肿和哮喘；自身免疫性疾病如慢性风湿性关节炎、难治疗性结肠炎、克罗恩氏病、肾小球肾炎、SLE、硬皮病、多发性硬化和Sjoegren氏综合症；多器官功能衰竭；器官移植后的器官衰竭或排异；和单器官的功能障碍如心力衰竭、不稳定心绞痛、瓣炎、肾衰竭、心肌病、肾弛缓、肝衰竭和暴发性肝衰竭。
[0052]可应用本发明的预防和/或治疗剂的优选疾病是诸如败血症、严重败血病、败血性ARDS或败血病性休克、SIRS、内毒素休克和ARDS等疾病。 本发明的预防和/或治疗剂还可用于改善或预防与炎性细胞因子增加，尤其是血液TNF浓度增加有关的状况。此外，本发明的所述试剂预期将具有对其中涉及LPS的革兰氏阴性细菌感染、其中涉及LTA或肽聚糖的革兰氏阳性细菌感染和与支原体感染有关的败血症的治疗及预防效果，即，在与这些疾病有关的状况出现或发展后的治疗效果，以及对于显示出高血液LPS值、LTA值或支原体值的患者，对于显示出特定⑶14分子种类的高血液浓度的患者(参见WOOl / 22085和W02004 / 44005)，和被预料将显示这些状况的患者的预防效果。
[0053]可根据需要结合的示例性药学上可接受的添加剂包括载体、赋形剂、稳定剂、润滑剂、着色剂、崩解剂、杀菌剂、等渗剂、稳定剂、分散剂、抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂、通常用于本领域的适宜溶剂(例如，无菌水和植物油)以及生理学上可接受的助溶剂。
本发明的药物组合物还可以包含抗生素、类固醇、各种细胞因子抗体或抗凝血剂。这些试剂将关于本发明的蛋白质显示相加效应或协同效应，且所述药物组合物将具有改善的效果O
[0054]本发明的药物组合物作为试剂施用时的剂量不受特别限制，所述剂量可以通过考虑患者的状况、体重、年龄、性别等而适当的确定。在施用作为有效成分的本发明的蛋白质的典型情况中，所述剂量优选至少微0.1mg / kg,更优选Img / kg~IOmg / kg。
[0055]用于施用作为试剂的本发明的药物组合物的剂型不受特别限制，优选剂型包括片齐?、注射剂、粉末、栓剂、吸入剂，更优选注射剂和吸入剂。尽管可以使用各种给药途径，不过优选肠胃外给药。肠胃外给药利用注射剂通常以下列给药方式进行:静脉给药(大丸剂给药、连续灌输、间歇灌输)、动脉内给药、皮下施用和肌内给药，同样优选使用吸入。其他给药途径包括直肠内给药、经皮吸收、关节内给药、经鼻给药和穿粘膜给药。给药方法可包括预防性给药、单独给药和连续给药，同时给药实时和给药频率取决于患者的状况。
[0056]此外还提供了使用包含本发明的药物组合物作为其主要成分的试剂用于可对其应用根据本发明第六方面的预防和/或治疗剂的疾病或病征的治疗方法。
实施例
[0057]下面，将参考决非限制本发明的范围的实施例对本发明进行更详细的描述。
(实施例1)嵌合抗体和抗体融合蛋白质的构建1-1)嵌合抗体和抗体融合蛋白质(F1024)的构建 (I)材料
使用的主要材料和装置如下所述。
引物:表1中所示的引物(由Sigma Genosys Japan, K.K.合成),
用于 PCR 的酶:Ex Taq (TAKARA BIO INC.)，
限制酶:EcoR1、BamH1、Not1、Nhe1、EcoRV、Stu1、BglII 及其他(TAKARA BIO INC.), 基因组 DNA:HeLa 基因组(lot.N34707-1, BD Biosciences Clontech)，
PCR 装置:DNA Engine (MJ RESEARCH, INC.)，
琼脂糖电泳凝胶:SeaKem GTG Agarose (TAKARA BIO INC.),
50x TAE(2mol / L Tris-乙酸酯，0.05mol / L EDTA) (NIPPON GENE C0.，LTD.)，
分子量标记(以StyI消化的λ DNA片段)，
用于由凝胶提取DNA片段的试剂盒(QIAEX II，QIAGEN K.K.)，
用于哺乳动物细胞的表达载体:pEF2cew(由改进的pEF-BOS制造的载体)，
包含人类IgG4重链恒定区(Cy 4)基因的质粒:pTK-2232，
TA克隆载体:pT7BIueT (N0VAGEN)和连接剂:TaKaRa ligation Kit ver.2 (TAKARA BIOINC.),
E.coli 感受态细胞:JM109 (TAKARA BIO INC.)，
质粒DNA和基因组DNA纯化试剂盒(QIAGEN K.K.)，
测序试剂盒:DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Premix Kitlot.1767 (Amersham Biosciences)和分 析仪:ABI3100genetic analyzer (AppliedBiosystems),
总 RNA 分离试剂:TRIzol (GIBCO BRL)，
5’RACE kit:用于快速扩增 cDNA端的 5’RACE 系统,v.2.0 (Invitrogen Corporation), Dulbecco，s MEM(SIGMA),
转染试剂:FuGENE6 (Roche Diagnostics K.K.)
[0058][表 I]
表1:引物序列
引物名j碱基序列Iseq id
M45’ -GTTTTCCCAGTCACGACG-3’135
T75’ -CTGTTGTTTCAGCTGAGGACAC-3’136
rlgH-b5’ -CTGTTGTTTCAGCTGAGGACAC-3’137
rlgH-c5， -AGGGTCACCATGGAGTTACTT-3，138
rlgK-a5， -AGATACAGTTGGTGCAGCATCAGC-3，139·rlgK-b5， -GACACTGATGTCTCTGGGATAGA-3，140
【权利要求】
1.一种蛋白质，所述蛋白质包含(I)抗CD14抗体或其活性片段，或其衍生物和(II)蛋白酶的抑制剂，或其活性片段，或其衍生物。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是蛋白质抑制剂。
3.如权利要求1或2所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是多价酶抑制剂。
4.如权利要求1~3中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是凝血因子(凝血蛋白酶)或炎性蛋白酶。
5.如权利要求1~4中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是FXa和/或 FXIa。
6.如权利要求1~4中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是凝血酶。
7.如权利要求1~6中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于UTI。
8.如权利要求1~6中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于凝血调节蛋白。
9.如权利要求1~6中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于UTI结构域2。
10.如权利要求1~8中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂来源于凝血调节蛋白的功能结构域，尤其是EGF样结构域。
11.如权利要求1~4中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述蛋白酶是弹性蛋白酶。
12.如权利要求1~4中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是分泌性白细胞蛋白酶抑制剂。
13.如权利要求1~11中任一项所述的蛋白质，其中，(II)中的所述抑制剂是具有I~4个氨基酸取代的UTI结构域2的突变体。
14.如权利要求1~13中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是具有中和活性的抗体。
15.如权利要求1~14中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是识别人类⑶14的氨基酸号269~315的至少一部分的抗体。
16.如权利要求1~15中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是嵌合抗体。
17.如权利要求1~16中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是人源化抗体。
18.如权利要求1~17中任一项所述的蛋白质，其中，(I)中的所述抗CD14抗体是下述抗体:该抗体包含表2中所描述的重链的CDRl、CDR2和CDR3作为所述重链可变区中的⑶R1XDR2和⑶R3，或表2中所描述的轻链的⑶R1XDR2和⑶R3作为所述轻链可变区中的CDR1、CDR2 和 CDR3。
19.一种多核苷酸,所述多核苷酸编码如权利要求1~18中任一项所述的蛋白质的至少一部分。
20.—种载体,所述载体包含如权利要求19所述的多核苷酸。
21.一种细胞，所述细胞包含如权利要求19所述的多核苷酸或如权利要求20所述的载体。
22.一种方法，所述方法用于制造如权利要求1~18中任一项所述的蛋白质，该方法使用如权利要求19所述的多核苷酸、如权利要求20所述的载体和如权利要求21所述的细胞中的至少一种。
23.一种疾病的预防和/或治疗剂，所述疾病的预防和/或治疗剂包含如权利要求1~18中任一项所述的蛋白质、如权利要求19所述的多核苷酸、如权利要求20所述的载体和如权利要求21所述的细胞中的至少一种。
24.如权利要求23所述的预防和/或治疗剂，其中，所述疾病是败血症、严重败血症或败血病性休克、SIRS相关 疾病、内毒素休克或ARDS。
【文档编号】C12N1/19GK103665168SQ201310445996
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2006年6月5日 优先权日:2005年6月3日
【发明者】古迫正司, 中山和行, 保坂义隆, 川原哲史, 中村正树, 武内隆志 申请人:持田制药株式会社