植物旱胁迫诱导表达型启动子GaPROP5CS及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物旱胁迫诱导表达型启动子GaPROP5CS及其应用。所述启动子GaPROP5CS，来源于亚洲棉(Gossypium?arboreum?L.)石系亚1号，具体可为序列表中序列1所示的核苷酸序列组成的DNA分子。本发明通过对洋葱内表皮的基因枪转化实验证明，启动子GaPROP5CS在15%PEG6000的旱胁迫条件下的诱导活性与pBI121中的启动子CaMV35S的活性相当；对烟草的农杆菌转化实验证明，启动子GaPROP5CS在断水的旱胁迫条件下的诱导活性与pBI121中的启动子CaMV35S的活性相当，且诱导活性高于旱胁迫诱导启动子rd29A。利用本发明的启动子可提高外源基因在旱胁迫等逆境下的表达和累积水平，为培育抗旱新品种提供理论依据和基因资源，具有极大的应用前景。
【专利说明】植物旱胁迫诱导表达型启动子GaPR0P5CS及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物旱胁迫诱导表达型启动子GaPR0P5CS及其应用。
【背景技术】
[0002]生物体的各种生命表现都是基因有序表达的结果。基因在时间、空间上有序的表达离不开基因准确的表达调控。根据基因调控在同一事件中发生的先后次序，可将其分为转录水平调控、转录后水平调控、翻译水平调控及蛋白质加工水平的调控等。其中，基因在转录水平的调控是非常重要的，也是当前分子生物学研究的热点问题。它主要涉及RNA聚合酶、顺式调控元件和反式作用因子三种因素的相互作用。启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5/端上游区的DNA序列，能指导全酶与DNA模板链的正确结合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特异性转录的形式，并决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶类型，是转录调控的中心。
[0003]目前，在转基因作物(包括棉花)中常用的启动子有花椰菜花叶病毒(CaMV)35启动子和根癌农杆菌Ti质粒的胭脂碱合酶(NOS)启动子和章鱼碱合酶(OCS)启动子，另外水稻肌动蛋白-1(Racl)以及玉米泛素-1 (Ub1-1)等也已得到广泛运用。这些启动子尽管表达效率很高，但由于在不同时期和不同部位均能表达，这样就使得外源基因过量表达的同时，还会消耗作物大量的能量，甚至导致转基因作物在正常环境下都会出现生长被严重延滞的现象。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供植物旱胁迫诱导表达型启动子GaPR0P5CS及其应用。
[0005]本发明所提供的启动子GaPR0P5CS,来源于亚洲棉石系亚I号(Gossypiumarboreum L.),如下I)或2)或3)的分子:
[0006]I)由序列表中序列I所示的核苷酸序列组成的DNA分子；
[0007]2)与I)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子；
[0008]3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交的分子。
[0009]所述严格条件可为如下:50°C，在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和ImMEDTA的混合溶液中杂交，在50°C，2XSSC，0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5MNa3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在50°C，I X SSC, 0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.5XSSC,0.1%SDS 中漂洗；还可为:50°C，在 7% SDS,0.5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中杂交，在 50°C，0.1 X SSC,0.1%SDS中漂洗；还可为:50°C，在7% SDS,0.5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65°C，0.1 X SSC, 0.1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 XSSC,0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。[0010]其中，序列表中序列i由795个核苷酸组成。序列表中序列i的5，端第790位的A为转录起始位点，763-770位脱氧核苷酸为棉花GaP5CS基因启动子TATA盒核心区，将启动子除TATA盒核心区外的其他序列通过碱基突变或缺失等变化，一般不会影响启动子的活性，因此可利用启动子缺失等相关实验依据，根据需要改善启动子的调控元件。
[0011]本发明保护含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
[0012]所述表达盒可由所述DNA分子、由DNA分子启动转录的目的基因和终止子组成。
[0013]所述目的基因可为报告基因如Gus基因、GFP基因，也可为旱胁迫诱导下表达的使植物耐受该胁迫能力增强的基因，如脯氨酸合成途径中相关的酶基因。
[0014]可用现有的植物表达载体构建含有所述DNA分子的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKI1、pBin438、PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa 或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA 公司)等。
[0015]所述重组载体具体可为pCBI_GaPR0P5CS，是在中间载体pCBI的PstI和BamHI位点间插入了序列表序列I所示的DNA片段；所述中间载体pCBI是在载体PCAMBIA2300的BamHI和EcoRI位点间连入了载体pBI121的BamHI和EcoRI位点间的含有⑶S基因的DNA片段。
[0016]本发明保护所述DNA分子在启动植物中目的基因表达中的应用。
[0017]所述表达为干旱胁迫诱导表达。
[0018]所述干旱胁迫为PEG胁迫或缺水胁迫。
[0019]本发明还提供一种培育转基因植物的方法，是将所述表达盒导入植物中，得到所述目的基因受干旱胁迫诱导表达的转基因植物。
[0020]所述导入具体可通过所述重组载体pCBI_GaPR0P5CS实现的。
[0021]所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为烟草(Nicotiana tabacum)。
[0022]本发明通过对洋葱内表皮的基因枪转化实验证明，启动子GaPR0P5CS在15%PEG6000的旱胁迫条件下的诱导活性与pBI121中的启动子CaMV35S的活性相当；对烟草的农杆菌转化实验证明，启动子GaPR0P5CS在断水的旱胁迫条件下的诱导活性明显与PBI121中的启动子CaMV35S的活性相当，且诱导活性高于旱胁迫诱导启动子rd29A，表达部位在根部明显高于叶片和花。
[0023]利用本发明的启动子可提高外源基因在旱胁迫等逆境下的表达和累积水平，特别是在植物的叶、花和根中，可改良种子品质，将该启动子与一些抗逆性基因融合，构建有经济价值的载体转化植株，得到抗逆性更强的转基因植物。本发明的启动子及分子机理，可为培育抗旱新品种提供理论依据和基因资源，具有极大的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为从棉花基因组DNA中PCR扩增GaP5CS启动子的电泳图谱。其中，M泳道为天根公司的 DNA MarkerIII，从上到下片段依次为 4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp ；01和02泳道均为三级PCR产物。[0025]图2为中间载体pCBI双酶切鉴定图谱。其中，M泳道为天根公司的DNA MarkerIII,从上到下片段依次为 4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp ;泳道 2 为用BamHI和EcoRI双酶切获得Ilkb和2.1kb的产物的结果。
[0026]图3为中间载体pCBI的结构示意图。
[0027]图4为重组载体pCBI_GaPR0P5CS的双酶切鉴定图谱。其中，M泳道为天根公司的 DNA MarkerIII,从上到下片段依次为 4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp.泳道2为用PstI和BamHI双酶切获得约13kb和0.8kb的产物的结果。
[0028]图5为重组载体pCBI_GaPR0P5CS的结构示意图。
[0029]图6为重组载体pCB1-35S的双酶切示意图。其中，M泳道为天根公司的DNAMarkerIII，从上到下片段依次为 4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp、200bp ;泳道2为用HindIII和BamHI双酶切获得约13kb和0.8kb的产物的结果。
[0030]图7为重组载体pCBI_GaPR0P5CS基因在经旱胁迫诱导培养(右图)和未经旱胁迫诱导培养(左图)后的洋葱内表皮的GUS染色结果。
[0031]图8为转pCBI_GaPR0P5CS的烟草植株经干旱处理(右图)和正常处理(左图)后叶片GUS染色结果。
[0032]图9为pCBI_GaPR0P5CS基因在旱胁迫诱导后的⑶S表达量测定图谱。
【具体实施方式】
[0033]下述实施例中所使用的实 验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0034]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035]下述实施例的结果均为三次重复的结果。
[0036]亚洲棉(Gossypium arboreum L.)石系亚I号(来自中国农业科学院棉花研究所。王玉荣，张雪妍等，亚洲棉(Gossypium arboreum L.)全生育期均一化全长cDNA文库的构建和鉴定，中国农业科学:2009，42 (4))。
[0037]烟草(Nicotiana tabacum)NC89 (来自中国农业科学院棉花研究所。周汝鸿,方荣祥，烟草抗花叶病新品系“转基因NC89”的田间选育和应用，作物杂志，1993，01)
[0038]实施例1、植物旱胁迫诱导表达型启动子GaPR0P5C的获得
[0039]1、引物设计
[0040]亚洲棉GaP5CS基因的cDNA全长2827bp，可编码716个氨基酸组成的蛋白质(王玉荣，张雪妍等，亚洲棉(Gossypium arboreum L.)全生育期均一化全长cDNA文库的构建和鉴定，中国农业科学:2009，42 (4))，通过氨基酸序列比对，发现GaP5CS基因编码蛋白存在保守性很强的区域，其与酶行使功能有关。根据亚洲棉GaP5CS基因的cDNA序列，设计引物扩增其启动子，具体引物序列如下:
[0041]特异性引物:
[0042]SPl:5’ -CCCACTGCTAATCTTCCATCA-3，；
[0043]SP2:5， -GAAGGGACAAAGCCACATCTC-3，；
[0044]SP3:5， -GGCGACTCGAAGACGATGATG-3，；
[0045]随机引物:
[0046]AD1: 5，-NTCGA (G/C) T (A/T) T (G/C) G (A/T) GTT-3，；[0047]AD2:5 ’ -NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3 ’ ；
[0048]AD3:5，- (A/T)GTGNAG(A/T)ANCANAGA-3 ’ ；
[0049]AD4:5，-CCCACTGCTAATCTTCCATCA-3，。
[0050]2、Tail-PCR 扩增
[0051]以SP1+AD1、SP1+AD2、SP1+AD3、SP1+AD4为引物(在4个相同的体系中分别进行反应)，以棉花品种亚洲棉(Gossypium arboreum L.)石系亚I号的基因组DNA为模板,进行一级PCR，反应体系为随机引物和特异性引物(IOuM)各luL，10XLA Buffer5uL, dNTP8uL,基因组 DNAluL(10ng)，LA Taq0.5U，补加超纯水至 50uL，反应程序为 94°C lmin,98°C 5min,接着 94°C 30sec,65°C lmin,72°C 2min5 个循环，94°C 30sec,25°C 3min,72°C 2min，然后94°C 30sec, 62°C lmin, 72°C 2min, 94°C 30sec, 62°C lmin, 72°C 2min, 94°C 30sec, 44°C lmin, 72°C 2min20个循环，最后72°C IOmin ;获得一级PCR产物；
[0052]以SP2+AD1、SP2+AD2、SP2+AD3、SP2+AD4 为引物，以一级 PCR 产物(稀释 100 倍)为模板进行二级PCR，反应体系为随机引物和特异性引物(IOuM)各luL，10XLA Buffer5uL,dNTP8uL，稀释100倍后的一级PCR产物luL(10ng)，LA Taq0.5U，补加超纯水至50uL，反应程序为 94°C 30sec, 62°C lmin, 72°C 2min, 94°C 30sec, 62°C lmin, 72°C 2min, 94°C 30sec, 44°C Imin, 72°C 2min20个循环，最后72°C IOmin ;获得二级PCR产物
[0053]以SP3+AD1、SP3+AD2、SP3+AD3、SP3+AD4 为引物，以二级 PCR 产物(稀释 100 倍)为模板进行三级PCR，反应体系为随即引物和特异性引物(IOuM)各luL，10XLA Buffer5uL,dNTP8uL，稀释 100 倍后的二级 PCR 产物 IuL (IOng), LA Taq0.5unit，补加超纯水至 50uL,反应程序为 94°C 30sec, 62°C lmin, 72°C 2min, 94°C 30sec, 62°C lmin, 72°C 2min, 94°C 30sec, 44°C lmin, 72°C 2min20个循环，最后72°C IOmin ;获得三级PCR产物；
[0054]将三级PCR产物进行琼脂糖`凝胶电泳(图1)，回收纯化0.8kb的目的条带，将其连接到pMDlS-T载体(购自TAKARA公司)上进行测序，测序结果表明，该片段为序列表中序列I的795bp大小的核苷酸序列，该片段即为基因GaP5CS的启动子GaPR0P5CS，将连接有该片段的载体PMD18-T命名为重组载体PropMD18-T。
[0055]实施例2、植物旱胁迫诱导型表达启动子表达载体(pCBI_GaPR0P5CS)的构建
[0056]1、中间载体pCBI的构建
[0057]用BamHI和EcoRI双酶切载体pBI 121，回收2.0kb的⑶S基因片段，与经过BamHI和EcoRI双酶切的载体pCAMBIA2300的骨架片段相连，获得中间载体pCBI，经酶切(图2)和测序证实，中间载体PCBI (图3)为在载体pCAMBIA2300的BamHI和EcoRI位点间连入了⑶S基因片段。该重组载体pCBI的T-DNA区中含有表达盒+GUS+N0S。
[0058]2、含有启动子GaPR0P5CS和⑶S基因的重组表达载体的构建
[0059]用PstI和BamHI双酶切实施例1获得的重组载体PropMD18_T，将酶切产物中
0.8kb的DNA片段与经过PstI和BamHI双酶切的中间载体pCBI的骨架片段相连，获得重组载体pCB1-GaPR0P5CS，经酶切(图4)和测序证实，重组载体pCBI_GaPR0P5CS (图5)为在中间载体PCBI的PstI和BamHI位点间插入了序列表序列I所示的DNA片段(即启动子GaPR0P5CS)。该重组载体 pCBI_GaPR0P5CS 的 T-DNA 区中含有表达盒 GaPR0P5CS+GUS+N0S。
[0060]3、含有启动子CaMV35S和⑶S基因的重组表达载体的构建(对照A)
[0061]用PstI和BamHI双酶切载体pBI121，将酶切产物中790bp的DNA片段与经过PstI和BamHI双酶切的中间载体pCBI的骨架片段相连，获得重组载体pCBI_35S，经酶切和测序证实，重组载体PCB1-35S为在中间载体pCBI的PstI和BamHI位点间插入了启动子CaMV35S。该重组载体pCBI_35S的T-DNA区中含有表达盒CaMV35S+GUS+N0S。
[0062]4、含有启动子rd29A和⑶S基因的重组表达载体的构建(对照B)
[0063]在中间载体pCBI的PstI和BamHI位点间插入序列表序列2所示的启动子rd29A (Zoysia japonica rd29A gene, promoter regionGenBank:EU346948.1),经测序证实，获得了重组载体pCB1-rd29A。该重组载体pCBI_rd29A的T-DNA区中含有表达盒rd29A+GUS+N0So
[0064]启动子rd29A为拟南芥逆境诱导型启动子，含有干旱、高盐、低温ABA诱导表达等相关的顺式作用兀件(Yamaguch1-Shinozaki K，Shinozaki K.A novelcis—acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness todrought, low-temperature, or high-salt stress.Plant Cell, 1994，6:251 ~264),可用于抗逆基因工程。
[0065]实施例3、植物旱胁迫诱导型表达启动子(GaPR0P5CS)的瞬时表达分析
[0066]按照BioRad公司PDS-1000/HE Biolistic型的基因枪轰击操作方法，将重组载体pCB1-GaPR0P5CS (以载体pBI121和载体pCBI为对照)基因枪法转化经高渗培养的洋葱内表皮，轰击后的洋葱内表皮用MS培养基、37°C、暗培养I天后，取一部分包含载体pCB1-GaPR0P5CS (或载体pBI121、或载体pCBI)的洋葱内表皮转移至PEG6000浓度为15%(150g/L)的MS培养基上37°C、暗培养24小时(即旱胁迫诱导培养)；另一部分继续在不含PEG6000的MS培养基上37°C、暗培养24小时(即未经旱胁迫诱导培养);将洋葱内表皮进行GUS染色，部分结果如图7所示。
[0067]结果表明，转pCBI_GaPR0P5CS的洋葱内表皮经旱胁迫诱导培养后，明显比未经旱胁迫诱导培养的⑶S染色结果的颜色深，且与转pBI121的洋葱内表皮经旱胁迫诱导培养和未经旱胁迫诱导培养的GUS染色结果相当，颜色均较深；RpCBI的洋葱内表皮在旱胁迫诱导培养或未经旱胁迫诱导培养下的⑶S染色结果与转pCB1-GaPR0P5CS的洋葱内表皮未经旱胁迫诱导培养的GUS染色结果相当，均未被染色。这说明启动子GaPR0P5CS在旱胁迫条件下的诱导活性与PBI121中的启动子CaMV35S的活性相当。
[0068]本实施例中⑶S染色的方法如下:
[0069]将准备好的材料浸泡在⑶S染液(0.1M磷酸钠缓冲液(PH7.0) , IOmM EDTA(卩118.0)，51111铁氰化钾，51111亚铁氰化钾，1.01111 X-Gluc, 0.l%Triton X-100)中，于 37°C保温8h ;将染色后的材料转入70%乙醇中脱色2-3次，观察染色结果，如果材料被染成蓝色，说明⑶S基因表达，且蓝色越深，⑶S基因表达量越高。
[0070]实施例4、转基因烟草植株的获得
[0071]一、转基因烟草植株的获得
[0072]1、采用冻融法将重组载体pCBI_GaPR0P5CS转化根癌农杆菌菌株LBA4404，获得含有重组载体pCB1-GaPR0P5CS的根癌农杆菌，即重组根癌农杆菌LBA4404/pCBI_GaPR0P5CS。
[0073]2、用YEB液体培养基将重组根癌农杆菌LBA4404/pCBI_GaPR0P5CS培养至菌液0D600为0.5-0.6，获得侵染液。
[0074]3、取5周龄的烟草(Nicotiana tabacum)NC89的叶片,用浸染液浸泡3分钟,将叶片置于无菌滤纸上并吸干表面液体，转到共培养培养基上25°C黑暗条件下共培养两天。将经培养两天的烟草叶盘转移至分化培养基中，半个月继代一次，诱导幼芽的生成；待幼芽长粗壮后，转移置生根培养基中诱导生根，诱导生根成功后，将烟草幼苗转移置装有营养基质的培养钵中，将培养钵中的烟草移栽至大棚生长。共获得11个Ttl代转化pCB1-GaPR0P5CS的烟草植株。
[0075]上述培养基的配方如下:
[0076]I)农杆菌培养用YEB培养基(pH7.4):牛肉浸膏5g/L，酵母膏lg/L，蛋白胨5g/L，蔗糖 5g/L，MgS04 ? 7H200.04g/L，琼脂 1.5g/100mL，卡那霉素 50mg/L，利福平 20mg/L。
[0077]2)MS基本培养基(pH6.0):50X大量元素50ml，1000X微量元素5ml，1000X铁盐5ml, 1000X有机物5ml,鹿糖25g,琼脂8g,无菌水定容至1L。
[0078]3)烟草共培养基:MS 基本培养基+ 6-BA (2mg/L) + NAA (0.lmg/L)。
[0079]4)烟草分化培养基:MS 基本培养基+ 6-BA (2mg/L) + IAA (0.2mg/L) + Kan(100mg/L) + CB (600mg/L)。
[0080]5)烟草生根培养基:MS 基本培养基+ Kan (100mg/L) + CB (600mg/L) + NAA(0.2mg/L)。
[0081]4、按照步骤I一3的方法,将pCBI转化烟草(Nicotiana tabacum) NC89,获得13个Ttl代转化pCBI的烟草植株。
[0082]5、按照步骤 I一3 的方法，将 pCB1-35S 转化烟草(Nicotiana tabacum)NC89，获得18个Ttl代转化pCB1-35S的烟草植株。
[0083]6、按照步骤 I一3 的方法,将 pCBI_rd29A 转化烟草(Nicotiana tabacum)NC89,获得13个Ttl代转化pCB1-rd29A的烟草植株。
[0084]二、PCR 检测
[0085]取Ttl代转化pCBI_GaPR0P5CS的烟草植株的叶片，提取基因组DNA，以该DNA为模板，以实施例1中的引物AD2和SP3为引物，进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳，扩增得到795bp条带的烟草植株即为阳性植株。结果共得到11株阳性转pCB1-GaPR0P5CS的烟草植株。
[0086]取TO代转化pCBI的烟草植株的叶片，提取基因组DNA，以该DNA为模板，用BamHI和EcoRI双酶切检测出2.0kb条带的烟草植株即为阳性植株。结果共得到13株阳性转pCBI的烟草植株。
[0087]取TO代转化pCB1-35S的烟草植株的叶片，提取基因组DNA，以该DNA为模板，以P35S1:5，-ccacagatggttagagaggct-3，，P35S2::5，-tgcgaaggatagtgggattgt-3’ 为引物PCR扩增目的基因Camv35s，将扩增产物进行电泳，扩增得到790bpbp条带的烟草植株即为阳性植株。结果共得到18株阳性转pCB1-35S的烟草植株。
[0088]取Ttl代转化pCBI_rd29A的烟草植株的叶片，提取基因组DNA，以该DNA为模板，以Prd29Al:5，-ATGATTTGATGGAGGAGCCA-3，，Prd29A2:5，-AAACAGAGGAGGGTCTCAC-3，为引物PCR扩增目的基因rd29A，将扩增产物进行电泳，扩增得到SOObp条带的烟草植株即为阳性植株。结果共得到13株阳性转pCB1-rd29A的烟草植株。
[0089]T0代表示转基因当代植株，T1代表示Ttl代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。
[0090]实施例4、植物旱胁迫诱导型表达启动子(GaPR0P5CS)的烟草功能验证
[0091]一、⑶S染色鉴定
[0092]将上述实施例得到的烟草植株在相同正常条件下培育，使其正常生长发育，在开花当天将阳性转pCB1-GaPR0P5CS的烟草植株(TLG)、阳性转pCBI_35S的烟草植株(TLS)、阳性转pCB1-rd29A的烟草植株(TLR)和阳性转pCBI的烟草植株的烟草植株(TLC)以及未经基因转化的野生型烟草(Nicotiana tabacum) NC89植株(WT)进行分别如下两种处理:
[0093]A正常处理:10天的正常浇水处理，其它培养条件正常；
[0094]B干旱处理:10天的不浇水处理，其它培养条件正常。
[0095]取各处理单株的根和叶片进行GUS染色:将准备好的材料浸泡在GUS染液(0.1M磷酸钠缓冲液(PH7.0)，10mM EDTA (PH8.0)，5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，1.0mMX-Gluc, 0.l%Triton X-100)中，于37°C温育过夜；将染色后的材料转入70%乙醇中脱色2-3次，观察染色结果，如果材料被染成蓝色，说明GUS基因表达，且蓝色越深，GUS基因表达量越闻。
[0096]结果:转pCBI的烟草植株和WT的根、叶都未被染成蓝色；转pCBI_GaPR0P5CS的烟草植株在干旱处理后比正常处理后的蓝色程度明显深(如图示8所示);转pCB1-35S的烟草植株在干旱处理后比正常处理后的蓝色程度无明显区别，都能染成蓝色；RpCB1-rd29A的烟草植株在干旱处理后比正常处理后的蓝色程度稍深。
[0097]结果表明，启动子GaPR0P5CS能够在干旱胁迫下启动子⑶S基因超量表达，并且在根和叶片中都具有启动活性，活性与启动子CaMV35S的启动活性相当，且比启动子rd29A在干旱胁迫下的启动活性更强。
[0098]二、⑶S蛋白的荧光活性检测
[0099]⑶S蛋白能与底物MUG (4-甲基伞型酮-P -葡萄糖醛酸苷)反应产生荧光物质MU(分4-甲基伞型酮)。MU的激发波长为365nm,发射波长为456nm,其含量可由突光分光光度计测出。因此，根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少可以定量检测GUS蛋白的含量。
[0100]实验停止浇水5天后，取干旱处理和正常处理的各单株的根、叶和花，分别定量检测其中的⑶S蛋白含量。结果表明，转pCB1-GaPR0P5CS的植株(TLG)叶片中⑶S蛋白含量明显高于空白对照和转PCBI都高很多，转PCB1-35S植株GUS蛋白含量比转基因GaPR0P5CS-PCBI植株略高(如图9所示)。
[0101]上述⑶S蛋白含量的具体检测方法如下，⑶S蛋白含量的测定，Bradford法测定叶片中⑶S蛋白含量:
[0102]I)植物总蛋白的提取
[0103]取烟草嫩叶，称取Ig叶片，放置_70°C，3个小时，取出叶片用液氮研磨成粉，转移至5ml的离心管中，后加入3ml的提取缓冲液，充分振荡摇匀。lOOOOrpm，30min离心，收集上清液，于4°C冰箱中保存。
[0104]2)样品中⑶S酶活反应的荧光测定
[0105]A.取出4°C保存的反应缓冲液放于37°C水浴预热；
[0106]B.取5支2ml的离心管，编号为1、2、3、4、5，在5支离心管中分别加入900ul反应终止液；
[0107]C.在新的2ml的离心管中加入0.5ml预热的反应缓冲液和250ul的烟草叶片提取液，上下颠倒直至混匀，混匀时间不超过2分钟，取出120 混合液先加到I号管中，此时作为0时反应的样品开始记时；
[0108]D.将反应管放入37°C水浴中加热，并分别在6、12、24、48分钟时，取出120 yl混合液，依次加入到2~5号管中，并作为酶反应6、12、24、48分钟时的样品。
[0109]E.将I号管作为空白对照,在激发光365nm,发射光455nm下,测定2-5号管中的荧光吸收值通过标准曲线上计算出各样品中的4-MU含量。
[0110]4-MU标准曲线的制作:配置4-MU梯度浓度液，在激发光365nm，发射光455nm，狭缝IOnm条件下测定各浓度液的荧 光值，以所述终止液为空白溶液，绘制4-MU标准曲线。
【权利要求】
1.一种DNA分子，为如下I)或2)或3)的分子: 1)由序列表中序列I所示的核苷酸序列组成； 2)与I)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交的分子。
2.含有权利要求1所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于:所述表达盒由权利要求1所述的DNA分子、由权利要求1所述的DNA分子启动转录的目的基因和终止子组成。
4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为pCB1-GaPROP5CS，是在中间载体PCBI的PstI和BamHI位点间插入了序列表序列I所示的DNA片段；所述中间载体pCBI是在载体pCAMBIA2300的BamHI和EcoRI位点间连入了载体pBI121的BamHI和EcoRI位点间的含有GUS基因的DNA片段。
5.权利要求1所述DNA分子在启动植物中目的基因表达中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述表达为干旱胁迫诱导表达。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述干旱胁迫为PEG胁迫或缺水胁迫。
8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求3所述的表达盒导入植物中，得到所述目的基因受干旱胁迫诱导表达的转基因植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:所述导入是通过权利要求4所述重组载体实现的。
10.根据权利要求5—9中任一所述的应用或方法，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为烟草。
【文档编号】C12N1/21GK103484464SQ201310450331
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】李付广, 曾小林, 张雪妍 申请人:中国农业科学院棉花研究所