一种可控的基于离子通道的大肠杆菌耐酸系统及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种可控的基于离子通道的大肠杆菌耐酸系统及其应用，基于大肠杆菌原有的谷氨酰胺介导的耐酸性系统，通过敲除原系统中的谷氨酸脱羧酶GadA和GadB，使得大肠杆菌在有谷氨酰胺存在的极度酸性条件下，其存活率与铵离子通道蛋白的表达量及培养基中铵离子的浓度相关，这样就可以通过调控胞外铵离子浓度和/或胞内铵离子通道蛋白的表达量来控制大肠杆菌的耐酸性，从而控制大肠杆菌在酸性条件下的存活。该耐酸系统还可以作为一个模式系统用于测定离子通道蛋白的底物和功能。
【专利说明】-种可控的基于离子通道的大肠杆菌耐酸系统及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大肠杆菌的一种耐酸性系统，特别涉及通过一种可控的基于离子通道 的耐酸性系统控制大肠杆菌的耐酸性的方法，属于微生物基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 耐酸性是大肠杆菌（E.coli)非常重要的性质，因为肠道细菌必须先通过胃里的极 度酸性环境并存活，才能进入小肠。
[0003] 目前已知大肠杆菌有四个可诱导的耐酸性系统来抵抗强酸性环境。其中，第二个 耐酸性系统（acid resistance system2，AR2)需要使用培养基中的谷氨酸（Glu)或者谷氨 酰胺（Gln)，分别对应依赖于谷氨酸的耐酸性系统（Glu-dAR)和依赖于谷氨酰氨的耐酸性 系统（Gln-dAR)。已知的AR2的主要功能蛋白包括逆向转运蛋白GadC，谷氨酰胺酶YbaS，以 及两个同工的谷氨酸脱羧酶GadA和GadB。其中，GadC可以逆向转运Gin和氨基丁酸 (Y -aminobutyric acid, GABA)，或者 Gin 和 Glu，或者 Glu 和 GABA ;YbaS 催化 Gin 水解生 成Glu和铵（主要以NH4+形式存在，但是有少量NH3，两者之间存在一定的电离平衡）；GadA 和GadB催化Glu的脱羧反应生成GABA和C0 2。在野生型菌株中，当静止期大肠杆菌细胞处 于PH2. 5的酸性条件下且细胞外的培养基中有Gin时，如图1所示，细胞外pHext为2. 5,细 胞内pHint为4. 2,细胞内外的H+电化学梯度驱动H+进入细胞，需要通过Gln-dAR不断排出 细胞内的H+才能保持pHint不会降低到导致细胞死亡。Gin被GadC转运进入细胞，然后被 细胞内的YbaS水解生成Glu和铵（NH 4+)，该过程可以消耗细胞内的一个H+，但是由于谷氨酸 的Y-C00H和NH4+的电离平衡，有可能重新释放出H+进入细胞质，所以该反应是否提供了 耐酸性取决于产物的后续利用。GadA和GadB催化Glu脱羧反应生成C0 2和GABA，该过程消 耗细胞质内的一个H+，C02扩散出细胞。GABA和少部分Glu被GadC转运出细胞，同时每排 出一分子的GABA或者Glu，GadC也向细胞内转运进入一分子的谷氨酰胺。也就是说，GadC 向细胞外排出脱羧产物GABA作为向细胞内转运新的氨基酸底物的交换，并且在该过程中 排出细胞内的H+，C0 2作为气体分子扩散出细胞。如果培养基中没有Gln，但是有Glu存在， 该系统同样可以利用Glu耐酸，只是不需要如上所述YbaS催化的那一步。
[0004] 上述谷氨酰胺介导的耐酸性系统的耐酸能力很强，可以保护大肠杆菌细胞在有谷 氨酰胺存在的极度酸性（PH2. 0-2. 5)条件下存活2h (存活率?100%)。由于该系统能以足 够快的速度排出细胞内的H+，维持大肠杆菌细胞可以存活的胞内pH值，使得其它离子通道 的功能不能表现出对耐酸存活率上的影响，所以不适用于人为调节控制大肠杆菌的耐酸能 力和测定离子通道蛋白的底物和功能。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种可控的基于离子通道的耐酸系统，从而实现人为调控 大肠杆菌的耐酸能力，并可用以测定一些离子通道蛋白的底物及其功能。
[0006] 本发明可控的基于离子通道的大肠杆菌耐酸系统，是通过下述方法构建的：
[0007] 1)构建大肠杆菌gadA和gadB基因双缺陷菌株；
[0008] 2)构建gadC表达载体和amtB表达载体；
[0009] 3)用步骤2)构建的表达载体转化步骤1)得到的双缺陷菌株，由此获得耐酸性可 控的大肠杆菌菌株。
[0010] 本发明的可控的基于离子通道的大肠杆菌耐酸系统，涉及大肠杆菌原有的谷氨酰 胺介导的耐酸性系统（glutamine-dependent acid resistance system, Gln-dAR)，通过敲 除原系统中的谷氨酸脱羧酶（GadA和GadB)，使得大肠杆菌在有谷氨酰胺存在的极度酸性 条件下，其存活率与铵离子通道蛋白的表达量及培养基中铵离子的浓度相关，这样就可以 通过调控胞外铵离子浓度和/或胞内铵离子通道蛋白（AmtB)的表达量来控制大肠杆菌的 耐酸性。
[0011] 该人造耐酸系统的工作机制如图4所示，细胞外pHext为2. 5,细胞内pHint为4. 2， 细胞内外的H+电化学梯度驱动H+进入细胞，需要通过耐酸性系统不断排出细胞内的H+才 内保持pHint不会降低导致细胞死亡。细胞内的YbaS催化谷氨酰胺水解产生谷氨酸和铵， 该过程消耗细胞质内的一个H+，但是由于谷氨酸的Y-C00H和铵的电离平衡，有可能重新释 放出H+进入细胞质，所以该反应是否提供了耐酸性取决于产物的后续利用。GadC每排出一 分子谷氨酸同时向细胞内转运进入一分子的谷氨酰胺，但是逆向转运过程不能把细胞内的 H+排出胞外。如果细胞外NH 4+浓度很低，NH4+通过AmtB排出胞外，从而把细胞内的H+排出 胞外。
[0012] 上述步骤1)可以通过P1噬菌体转导和位点特异性重组的方法删除gadA基因和 gadB基因。
[0013] 上述步骤2)中所述的gadC表达载体和amtB表达载体可以是这两个基因位于同 一个载体上，也可以是分别位于不同的两个载体上。表达gadC基因的启动子可以选择组成 型启动子IV sl_ ;表达amtB基因可以采用诱导型启动子，例如受IPTG调控的启动子Ptrc。
[0014] 上述步骤3)获得的耐酸性可控的大肠杆菌菌株表示为A gadA A gadB(p_gadC， p-amtB)菌株，由于删除了谷氨酸脱羧酶GadA和GadB，这样在极度酸性（pH2. 0-2. 5)条件 下，用质粒表达的谷氨酰胺/谷氨酸：GABA逆向转运蛋白GadC和细胞原有的谷氨酰胺酶 YbaS可以利用谷氨酰胺，生成谷氨酸和铵，为大肠杆菌细胞提供非常有限的耐酸性，同时， 用质粒载体表达AmtB很大程度增加了大肠杆菌细胞的耐酸性，但外加一定浓度的铵会抑 制该增强作用。
[0015] 基于上述大肠杆菌的可控的基于离子通道的耐酸系统，可以：1)通过调节培养基 中的铵离子浓度(而不改变培养基的低pH值)，和/或菌体内部铵离子通道蛋白（AmtB)的 表达量，控制大肠杆菌的存活率；2)在一定条件下增加大肠杆菌的耐酸性；3)将耐酸系统 作为一个模式系统用于测定离子通道蛋白的底物和功能。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 本发明提供了一种可调控的大肠杆菌耐酸性系统，便于控制大肠杆菌细胞在酸性 条件下的存活。在生产应用中，大肠杆菌发酵会产生大量的酸，该系统可以在铵浓度很低的 条件下为细胞提供耐酸性，保证细胞存活；当发酵完成，需要杀死细胞的时候，可以通过添 加氯化铵或少量氨水(不改变pH值）破坏细胞的耐酸性，从而杀死细胞。
[0018] 另外，我们希望这个系统可以应用于研究其它的离子通道，比如AmtB同源的Amt/ MEP/Rh家族的铵/氨通道蛋白，甚至别的参与调解pH的离子通道蛋白。Amt/MEP/Rh家族的 铵/氨通道蛋白的底物经常存在争议，因为铵在水中的电离平衡使得同时存在NH4+和NH3， 只有当转运底物是NH 4+时，AmtB才能在我们构建的系统中增强细胞的耐酸性。如果用其它 Amt/MEP/Rh家族蛋白替代AmtB，可以通过它们对耐酸性的影响推断其转运底物。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是依赖于谷氨酰氨的耐酸性系统（Gln-dAR)的机制模型示意图。细胞外pHext 为2. 5,细胞内pHint为4. 2。其中，括号内的_1，0，+1表示在所处的pH条件下，对应分子主 要的电离形式所带的电荷。
[0020] 图2显示了表达铵载体蛋白AmtB对A gadA A gadB (p-gadC)菌株依赖于谷 氨酰胺的耐酸性（Gln-dAR)功能的影响。其中，WT表示野生型菌株MG1655, BD9026是 A gadA A gadB (p-gadC)菌株，BD9047 是 A gadA A gadB (p-gadC, p-amtB)菌株(诱导表达野 生型AmtB)。
[0021] 图3显示了细胞外铵浓度对野生型菌株MG1655和A gadA A gadB (p-gadC, p-amtB) 菌株耐酸性的影响。
[0022] 图4显示了 A gadA A gadB (p-gadC, p-amtB)菌株的独立于谷氨酸脱羧酶之外的 人造耐酸性系统的工作机制。其中，括号内的_1，〇, +1表示在所处的pH条件下，对应分子 主要的电离形式所带的电荷。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图，通过实施例进一步阐述本发明，但并不因此限制本发明的保护范 围。
[0024] 1.具有可控的基于离子通道耐酸系统的菌株构建
[0025] 1) A gadA/B双突变菌株BD9025的获得
[0026] 从野生型大肠杆菌MG1655 (来自美国ATCC)的基因组中删除了编码谷氨酸脱羧酶 GadA和GadB的基因gadA和gadB。具体方法如下：
[0027] 通过P1噬菌体转导从已有的供体菌株JW3485-1 (由位于美国耶鲁大学的大肠杆 菌遗传库存中心（Coli Genetic Stock Center，CGSC)提供）将 A gadA:: kan 导入 MG1655， 然后通过位点特异性重组去除其中的kan基因；然后从供体菌株JW1488-7 (来自CGSC)将 A gadB: :kan通过P1噬菌体转导进入该菌株，再次通过位点特异性重组去除其中的kan基 因，得到A gadA/B双突变菌株BD9025。
[0028] 2)gadC和amtB表达载体的构建
[0029] 2. 1构建表达gadC的质粒pKU9003
[0030] 以MG1655染色体DNA为模板，利用引物XP142和引物XP143通过PCR得到gadC基 因，用 KpnI/Xbal 酶切后替换质粒 pZE12_luc (Lutz R, and Bujard H. (1997) Independent and tight regulation of transcriptional units in E.coli via the LacR/0, the TetR/0 and AraC/Il_12regulatory elements. Nucleic Acids Res. 25:1203-1210.)的luc 序列，得到pZE12-gadC。所述引物序列如下：
[0031] 引物 XP142 :5,-CGGGGTACCATGGCTACATCAGTACAGAC-3，（SEQ ID No:l);
[0032] 引物 XP143 :5,-CTAGTCTAGATTAGTGTTTCTTGTCATTC-3，（SEQ ID No:2)。
[0033] 用于表达gadC基因的启动子是，其序列如序列表中SEQ ID N〇:3所示，是 通过如下引物退火得到：
[0034] 引物 XP127 :5，-CTAGCTCGAGACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGAC ATAAATACCACTGGC-3' （SEQ ID No:4);
[0035] 引物 XP 128 :5，-CGGGGTACCGGTITCCTTTGCATACCCTGCTGATGTGCTCATTATAACCGCCAGT GGTATTTATGTCAAC-3' （SEQ ID No:5)。
[0036] 上述引物XP127和XP128退火得到序列后，用Xhol/Kpnl酶切，替换 pZE12-gadC原有的启动子，得到质粒pKU9003。序列通过测序鉴定。
[0037] 2. 2构建表达amtB的质粒pKU9007
[0038] 以MG1655染色体DNA为模板，用引物XP162和引物XP80通过PCR得到amtB基因， 然后用 XP162 和 XP81 再次 PCR 得到 amtB-linker-6H，用 Ncol/Hindlll 酶切后连入 pVTRA (Gene. 172:81-86, 1996)，得到质粒 pKU9007。表达 amtB 的启动子是 Ptrc，受 IPTG 调控。 [0039] 所用引物序列如下：
[0040] 引物 XP162 :5'-AGAGCCATGGGTAAGATAGCGACGATAAAAACTG-3，（SEQ ID No:6)
[0041] 引物 XP80 :5，-ATCCGCCTGCGCCGGCTGCTGCGCCTGATCCGCGTTATAGGCAITCTCGC-3，（ SEQ ID No:7)
[0042] 引物 XP81 :5，-CCCAAGCTTAATGATGATGATGATGATGATCCGCCTGCGCCGGCTGCTG-3 '（ SEQ ID No:8)
[0043] 3)实验菌株和对照菌株的获得
[0044] 将质粒pKU9003和pVTRA转入菌株BD9025,得到对照菌株BD9026 ;将质粒pKU9003 和PKU9007转入菌株BD9025,得到菌株BD9047。
[0045] 上述构建的菌株和质粒列于表1中。
[0046] 表1质粒和菌株列表
[0047]
【权利要求】
1. 一种构建大肠杆菌的可控耐酸系统的方法，包括以下步骤： 1) 构建大肠杆菌gadA和gadB基因双缺陷菌株； 2) 构建gadC表达载体和amtB表达载体； 3) 用步骤2)构建的表达质粒转化步骤1)得到的双缺陷菌株，由此获得具有可控耐酸 系统的大肠杆菌菌株。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)通过P1噬菌体转导和位点特异性重 组的方法删除gadA基因和gadB基因。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)将gadC和amtB基因构建在同一个 表达载体上，或者构建在两个不同的表达载体上。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)构建的表达载体采用组成型启动子 表达gadC基因，而采用诱导型启动子表达amtB基因。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述组成型启动子是，所述诱导型启 动子是Ptrc。
6. -种调控大肠杆菌耐酸性的方法，根据权利要求1?5任一所述的构建大肠杆菌的 可控耐酸系统的方法获得具有可控耐酸系统的大肠杆菌菌株，然后通过调节胞外铵离子浓 度和/或胞内铵离子通道蛋白AmtB的表达量来调控该菌株的耐酸性。
【文档编号】C12N1/21GK104450593SQ201310450356
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】刘歆, 王吉龙, 杨建国, 王忆平 申请人:北京大学