一种绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法
【专利摘要】本发明涉及一种制备生物乙醇的方法，特别涉及一种绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法，制备方法为，首先将浒苔洗净、干燥，粉碎至60-100目，加入柠檬酸缓冲液得到浒苔混合液；将酿酒酵母A和酿酒酵母B分别采用麦芽汁培养基培养成酿酒酵母A种子液和酿酒酵母B种子液；然后再浒苔混合液中加入纤维素酶和半纤维素酶，混合均匀，在45-55℃条件下酶解40-60小时得到水解液；按照体积比为5-10%的接种量，在水解液中加入酿酒酵母A种子液和酿酒酵母B种子液发酵。本发明采用纤维素酶和半纤维素酶协同作用，使得浒苔中的还原糖含量明显上升，提高了生物乙醇的产率。本发明对设备要求不高、反应条件温和、工艺简单、对环境污染小。
【专利说明】一种绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种制备生物乙醇的方法，特别涉及一种绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法。
【背景技术】
[0002]目前，世界石油资源供应渐趋紧张、环境污染日益严重，能源问题也越来越受到人们的关注。能源不仅是资源更是经济增长的重要投入要素，是人类生存和发展的物质基础。近两年来，各大能源消费国竞先寻求替代石油的新能源，生物乙醇燃料以其突出的环保性和可再生性，受到许多国家的重视和积极扶持。生物乙醇作为可再生资源，可减少对石油的消耗，能直接作为液体燃料或者同汽油混合使用。
[0003]將苔(Enteromorpha prolifera)是一种常见的大型海洋绿藻,它属于海藻中的绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、石药目(Ulvales)、石药科(Ulvaceae)。我国野生浒苔资源十分丰富，仅在福建沿海年产量就10万吨以上，养殖海域中一年四季均可发生。与其他海藻相比，浒苔生长繁殖快，无须购置种苗，是一种廉价的海洋生物质资源。近年来由于海水富营养化、全球变暖及海水中C02含量增多，浒苔呈爆发式生长，导致“绿潮”，造成海洋灾害。自2007年至2013年，黄海连续7年爆发大规模漂浮浒苔“绿潮”，严重影响海洋生态及沿海旅游业发展。在2013年6月，仅青岛附近海域每天打捞起的浒苔就达4000吨以上，对于清理上岸的数千吨浒苔，大多都被当做垃圾填埋或焚烧，大量的生物质资源被白白浪费了，十分可惜。
[0004]浒苔中总糖含量为39.50%、纤维素含量为13.3%、半纤维素含量为28.01%、淀粉含量为2.475%、水溶性多糖含量为11.503%、水溶性戊聚糖含量为11.25%。浒苔中的纤维素与半纤维素含量较高，是制备生物乙醇的主要组分。纤维素分子间通过大量的氢键连接形成纤维素晶体结构，这种结果使得纤维素的性质十分稳定，只有在催化剂作用下才能很好的水解反应。目前，选用的催化剂主要有纤维素酶或者酸，但酸解纤维素对反应容器要求较高，其环境污染性也较高。利用纤维素酶解是效果较好，反应温和且污染小的一种选择。但是，采用纤维素酶水解得到的还原糖得率低，直接影响了生物乙醇的产率。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种采用纤维素酶和半纤维素酶协同作用，共同降解浒苔，双酵母共同发酵来制备生物乙醇的方法，该方法加大了浒苔的利用率，增加了生物乙醇的产率。
[0006]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0007]—种绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法，其步骤包括:
[0008](I)、将浒苔洗净、干燥，粉碎至60-100目，加入pH=5~5.5的柠檬酸缓冲液得到浒苔混合液；
[0009](2)、在步骤(I)中的浒苔液中，加入纤维素酶和半纤维素酶，混合均匀，在45-55°C条件下酶解40-60小时得到水解液；在灭菌后的水解液中加入酿酒酵母A种子液和酿酒酵母B种子液；种子液总量与水解液体积比为5-10%;酿酒酵母A的保藏号为CICC1043，酿酒酵母B的保藏号为CICC32868 ;优选的酶解温度为50°C，酶解时间为48小时；
[0010](3)、将步骤(2)中的发酵液在30-37°C下发酵2-3天。
[0011]所述步骤(I)中，浒苔的干燥温度为55_65°C，干燥时间为12-24小时。
[0012]所述步骤(I)中，柠檬酸缓冲液的浓度为0.lmol/L, pH值为5.2。
[0013]所述步骤(I)中，干燥后的浒苔和柠檬酸缓冲液的用量比为0.04-0.08g/mL。优选的，干燥后的浒苔和柠檬酸缓冲液的用量比为0.05g/mL。
[0014] 所述步骤(2)中，纤维素酶与浒苔的用量比为120_160U/g，半纤维素酶与浒苔的用量比为120-160U/g。优选的，纤维素酶对浒苔底物的用量为150U/g，半纤维素酶对浒苔底物的用量为150U/g。
[0015]所述步骤(2)中，接种时酿酒酵母A和酿酒酵母B的种子液体积比为1:1，接种后发酵液中酵母菌总数为2000-3000万个/mL。
[0016]所述步骤(2)中，将酿酒酵母A和酿酒酵母B分别采用麦芽汁培养基培养作为酿酒酵母A种子液和酿酒酵母B种子液。
[0017]所述步骤(2)中，将水解液用200目的滤网过滤，并在115°C条件下灭菌10分钟。优选的，将水解液用两层纱絹(200目)过滤。
[0018]酿酒酵母A和酿酒酵母B均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0019]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0020]1、本发明采用纤维素酶和半纤维素酶协同作用，在较温和的条件下降解浒苔，增加了浒苔的利用率，使得浒苔中的还原糖含量明显上升，与单独使用纤维素酶相比，浒苔中的还原糖含量提闻了 30%。
[0021]2、本发明采用两种酵母菌共同发酵，加快了发酵时间，增加了最终产物生物乙醇的产率，与单独使用一种酿酒酵母A相比，生物乙醇的产率提高了 25%。
[0022]3、本发明对设备要求不高、反应条件温和、工艺简单、对环境污染极小，而且以泛滥为灾的绿潮藻浒苔为原料，变废为宝，既解决了海洋生态问题又解决了能源紧张问题。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例，对本发明作进一步说明:
[0024]浒苔:黄海暴发的绿潮藻，主要品种为浒苔；
[0025]纤维素酶:购于国药集团化学试剂有限公司(编号64001132)；
[0026]半纤维素酶:购于鼎国生物技术有限公司(编号M0033)；
[0027]酵母菌:酵母菌种均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，酿酒酵母 ASaccharomyces cerevisiae (保藏编号 CICC1043)；酿酒酵 B Saccharomycescerevisiae (保藏编号 CICC32868)。
[0028]酵母菌培养基:麦芽汁琼脂培养基。
[0029]实施例1
[0030]I)酵母菌A种子液的制备:[0031]麦芽汁琼脂培养基的制备:5° Β?麦芽汁1.0L，琼脂15.0g,自然pH ；
[0032]接一满环酿酒酵母A于麦芽汁琼脂斜面培养基28 °C活化培养24h ；
[0033]接种一满环斜面培养的酿酒酵母A于装有50mL麦芽汁培养基的三角瓶中，28°C，170r/min培养24h_48h，即得酵母菌A种子液。
[0034]2)酵母菌B种子液的制备方法同酵母菌A种子液的制备方法。
[0035]3)将浒苔除去贝壳、沙石等杂物后，用清水漂洗3-4遍，置于60°C烘箱中干燥12h，烘干后用粉碎机粉碎I分钟，将干燥的浒苔粉碎至60-100目。
[0036]取5g上述浒苔粉置于三角瓶中，加入IOOmL柠檬酸缓冲液(柠檬酸缓冲液的pH值为5.2，浓度为0.lmol/L);在三角瓶中分别加入750U的纤维素酶与750U的半纤维素酶，混匀，将三角瓶放置于50°C的水浴锅中，反应48小时得到水解液，将水解液用两层纱絹(200目)过滤，在115°C灭菌IOmin ;按体积比为10%的接种量，在水解液中加入酿酒酵母A(CICC1043)种子液与酿酒酵母B (CICC32868)种子液，酿酒酵母A种子液与酿酒酵母B种子液的加入配比为1:1 (体积比)，170r/min振荡培养60min，发酵液中酿酒酵母A和酿酒酵母B的数量为2500万个/mL。
[0037]将反应容器密封，在37°C条件下静置发酵50h，制得生物乙醇。
[0038]检测结果:
[0039]上述实验中，在三角瓶置于50°C的水浴锅中，反应48小时后，水解液用DNS法测定还原糖含量，测定还原糖 得率为59.08% ;使用SBA-40E生物传感分析仪检测最终生物乙醇得率为:37.4%ο
[0040]对比例I
[0041]酵母菌种子液的制备方法同实施例1。
[0042]将浒苔除去贝壳、沙石等杂物后，用清水漂洗3-4遍，置于60°C烘箱中干燥12h，烘干后用粉碎机粉碎I分钟，将干燥的浒苔粉碎至60-100目。
[0043]取5g上述浒苔粉置于三角瓶中，加入IOOmL柠檬酸缓冲液(柠檬酸缓冲液的pH值为5.2，浓度为0.lmol/L);在三角瓶中分别加入750U的纤维素酶，混匀，将三角瓶放置于50°C的水浴锅中，反应48小时得到水解液；按10%的接种量，在水解液中加入酿酒酵母A(CICC1043)种子液，发酵液中酿酒酵母A的数量为2000万个/mL，将反应容器密封，在37°C条件下静置发酵50h，制得生物乙醇。
[0044]对比实验中，在三角瓶置于50°C的水浴锅中，反应48小时后，水解液用DNS法测定还原糖含量，测定还原糖得率为45.41% ;检测最终生物乙醇得率为:22.5%。
[0045]以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
【权利要求】
1.一种绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法，其步骤包括: (1)、将浒苔洗净、干燥，粉碎至60-100目，加入pH=5~5.5的柠檬酸缓冲液得到浒苔混合液； (2)、在步骤(I)中的浒苔混合液中，加入纤维素酶和半纤维素酶，混合均匀，在45-55°C条件下酶解40-60小时得到水解液；在灭菌后的水解液中加入酿酒酵母A种子液和酿酒酵母B种子液；种子液总量与水解液体积比为5-10%;酿酒酵母A的保藏号为CICC1043，酿酒酵母B的保藏号为CICC32868 ； (3)、将步骤(2)中的发酵液在30-37°C下发酵2-3天。
2.根据权利要求1所述的绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(I)中，浒苔的干燥温度为55-65°C，干燥时间为12-24小时。
3.根据权利要求1所述的绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(I)中，柠檬酸缓冲液的浓度为0.lmol/L, pH值为5.2。
4.根据权利要求1所述的绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(I)中，干燥后的浒苔和柠檬酸缓冲液的用量比为0.04-0.08g/mL。
5.根据权利要求1所述的绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，纤维素酶对浒苔底物的用量为120-160U/g，半纤维素酶对浒苔底物的用量为120-160U/g。
6.根据权利要求1所述的绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，酶解温度为50°C，酶解时间为48小时。
7.根据权利要求1所述的绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，接种时酿酒酵母A和酿酒酵母B的种子液体积比为1:1，接种后发酵液中酵母菌总数为2000-3000万个/mL。
8.根据权利要求1所述的绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，将酿酒酵母A和酿酒酵母B分别采用麦芽汁培养基培养作为酿酒酵母A种子液和酿酒酵母B种子液。
9.根据权利要求1所述的绿潮藻浒苔酶解制备生物乙醇的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，将水解液用200目的滤网过滤，并在115°C条件下灭菌10分钟。
【文档编号】C12R1/865GK103468751SQ201310455653
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】费岚, 邵飞, 何培民, 贾睿, 胡乐琴, 黄希文, 李少香, 温文科 申请人:上海海洋大学