一种提高聚酮类化合物发酵产量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高聚酮类化合物发酵产量的方法。其包括步骤：在添加了天然油脂的培养基中培养过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因工程菌，从发酵产物中提取聚酮类化合物，所述的基因工程菌为将含有表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达载体的重组大肠杆菌接合转移放线菌制得的过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达转化体。该方法在于通过基因工程技术在聚酮类化合物的产生菌中过量表达外源的酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白，使之利用廉价的天然油脂为原料，提高聚酮类化合物的发酵产量。该方法未见文献报道。该方法操作简单易行，且利用廉价的天然油脂为聚酮类化合物提供合成前体，成本很低，便于推广应用。
【专利说明】-种提高聚鋼类化合物发酵产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种提高聚丽类化合物发酵产量的方法。
【背景技术】
[0002] 聚丽类化合物是一类重要的次级代谢产物，它是由简单脂肪酸经过类似长链脂肪 酸的合成途径生成的，所得的化合物具有一系列复杂的结构，结构的多样性导致了生物活 性的多样性。在自然界中已发现的天然聚丽物质约有2万种，大多数抗生素和一些其他的 重要药物如抗癌药、免疫抑制剂等均属于该个大家族。作为治疗药用途的该类化合物包括 临床上应用的红霉素、四环素、利福霉素、两性霉素、阿霉素、洛伐他了、雷帕霉素等重要抗 生素，W及农牧业用的阿弗菌素和莫能星、泰乐菌素等。
[0003] 许多有生物活性的聚丽类化合物由于其宿主不能进行大规模发酵生产而受到限 巧1|(如海绵和腰鞭毛虫的共生菌)，或由于宿主菌难于培养而产率很低。目前有研究将该些 生物中合成聚丽类化合物的途径转入合适的宿主，W提高目的产物的产率，常用的宿主如 大肠杆菌、链霉菌W及植物等。
[0004] 但是，生物代谢通路在异源宿主中的复制并非一个简单的技术问题，为了进一步 提高聚丽类化合物的发酵产量，有必要对其进行进一步研究，开发新的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对现有的聚丽类化合物的发酵产量不够高，难W 满足实际应用需求的现状，提供一种提高聚丽类化合物发酵产量的方法。本发明通过基因 工程技术改造放线菌，使之能够利用廉价的原料增加胞内醜基辅酶A的含量，为聚丽类次 级代谢产物的合成提供前体，从而大大提高聚丽类化合物的发酵产量。
[0006] 本发明提供的技术方案之一是；一种提高聚丽类化合物发酵产量的方法，其包括 步骤；在添加了天然油脂的培养基中培养过表达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的基因 工程菌，从发酵产物中提取聚丽类化合物，所述的基因工程菌为将含有表达醜基辅酶A合 成酶和醜基载体蛋白的重组表达载体的重组大肠杆菌接合转移放线菌制得的过表达醜基 辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的重组表达转化体。
[0007] 本发明中，所述的过表达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的基因工程菌能够过 表达外源的醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白，使所述基因工程菌能够利用廉价的原料增 加胞内己醜辅酶A和丙醜辅酶A的含量，从而丰富聚丽类化合物的直接合成前体，提高聚丽 类化合物的产量。
[0008] 本发明中，所述的提高聚丽类化合物发酵产量的方法还包括所述的基因工程菌的 制备步骤：将表达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的重组表达载体转化大肠杆菌，然后 将所得的重组大肠杆菌接合转移放线菌，所得的过表达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白 的重组表达转化体即为所述的基因工程菌。
[0009] 本发明中，所述的醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白优选来源于攻瑰抱链霉菌 (Str巧tomyces roseosporus)的醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白，其分别由来源于攻瑰 抱链霉菌（Str巧tomyces roseosporus)的化巧和化tF基因编码，所述的攻瑰抱链霉菌 更优选攻瑰抱链霉菌NRRL11379菌株。其中，所述的来源于攻瑰抱链霉菌（Streptomyces roseosporus)的醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的氨基酸序列分别优选如SEQ ID NO. 1 和SEQ ID NO. 2所示。所述的来源于攻瑰抱链霉菌（Streptomyces roseosporus)的Dp1:E 和化tF基因的核巧酸序列分别优选如SEQ ID N03和SEQ ID N04所示。
[0010] 对于上述氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的醜基辅酶A合 成酶和醜基载体蛋白，本领域技术人员知晓，与其具有一定的同源性(较佳地为同源性大于 85%)的同源蛋白应当能够实现与其相同或基本相同的功能。对于上述核巧酸序列如SEQ ID N03和SEQ ID NO. 4所示的化巧和化tF基因，本领域技术人员知晓，与其具有一定的同源 性(较佳地为同源性大于85%)的同源基因应当能够实现与其相同或基本相同的功能。
[0011] 本发明中，所述的重组表达载体可通过本领域的常规方法获得，即；将编码所述醜 基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的基因连接于表达载体上构建而成。所述的表达载体为本 领域常规，所述表达载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、瞻菌体或病毒载体等，优选放线菌常 用的各种整合型或复制型载体，所述的整合型载体包括各种瞻菌体整合位点适用的载体， 如pSET152、pS0K804，pSAM2等，所述的复制型载体优选pWhm3等，本发明中所述的表达载体 最优选为质粒PSET152,即所述的重组表达载体最优选通过将编码所述醜基辅酶A合成酶 和醜基载体蛋白的基因连接于质粒PSET152构建而成。
[0012] 其中，在所述的重组表达载体中，启动编码所述醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋 白的基因表达的启动子可W为常规，只要其能启动目标基因表达即可，较佳地，所述的启动 子为红霉素抗性基因启动子erm*E，其编码核巧酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0013] 本发明中，所述的放线菌为本领域常规所述，只要其存在聚丽类化合物或聚丽 NWS杂合化合物的合成途径，且能满足使所述的重组表达载体稳定地自行复制，使所述重 组表达载体携带的编码醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的基因能被有效表达即可。其 中较佳地，所述放线菌为游动放线菌（Actinoplanes sp.)或者吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus),更优选游动放线菌（Actinoplanes sp. )N902-109(阳RM BP-3832)菌株或 者吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus)ATCC29253菌株。将前述重组表达载体转化 至上述菌株中，即可得本发明优选的基因工程菌株。
[0014] 本发明中，所述的培养基为本领域常规的适合放线菌生长的培养基。所述的天然 油脂为本领域常规，更佳的是天然植物油脂，优选豆油、玉米油和花生油中的任一种或多 种。
[0015] 本发明中，所述的聚丽类化合物为本领域常规所述，优选雷帕霉素。
[0016] 本发明提供的技术方案之二是；一种生产雷帕霉素的基因工程菌，其为将含有表 达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的重组表达载体的重组大肠杆菌接合转移放线菌制 得的过表达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的重组表达转化体。
[0017] 所述的放线菌为本领域常规所述，只要其存在雷帕霉素的合成途径，且能满 足使编码所述的醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白的基因被有效表达即可。其中较 佳地，所述放线菌为游动放线菌（Actinoplanes sp.)或者吸水链霉菌（Str巧tomyces hygroscopicus),更优选游动放线菌（Actinoplanes sp. )N902-109(阳RM BP-3832)菌株或 者吸水链霉菌ATCC29253菌株。
[0018] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0019] 本发明所用试剂和原料除特别说明之外，均市售可得。
[0020] 本发明的积极进步效果在于：本发明的特点在于提供了一种新的提高聚丽类化合 物发酵产量的方法。本发明的方法在于通过基因工程技术在聚丽类化合物的产生菌中过量 表达醜基辅酶A合成酶和醜基载体蛋白，使之利用廉价的天然油脂为培养基原料，过量合 成聚丽类化合物的上游合成底物己醜辅酶A和丙醜辅酶A，从而大幅度提高聚丽类化合物 的发酵产量。本发明的方法尚属首创，目前为止未见有公开文献报道过。本发明的操作方 法简单易行，且利用廉价的天然油脂为聚丽类化合物的合成提供前体物质，成本很低，具有 很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为本发明的质粒构建图谱。
[0022] 图2显示过表达化tE和化tF基因对雷帕霉素产量的影响，左边为野生型的游动 放线菌（Actinoplanes sp. )N902-109(阳RM BP-3832)菌株，右边为本发明过表达Dp巧和 化tF基因的基因工程菌。
【具体实施方式】
[0023] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0024] 下述实施例中使用的菌株和质粒信息如下：
[00巧]大肠杆菌D册a (购自TaKaRa公司），攻瑰抱链霉菌（Streptomyces roseosporus) NRRL11379 (购自NRRL);大肠杆菌ET12567 (PUZ8002)(购自Biovector中国质粒载体菌 株细胞株基因保藏中也)、质粒PSET152 (购自Biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保 藏中也)、pIB139 (购自Biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中也)，pACK4aBS载体 (购自盘古基因有限公司）。游动放线菌（Actinoplanes sp. )N902-109(阳RM BP-3832)菌 株，购自日本IPOD国际专利菌种保藏中也（WTE)，其保藏编号是阳RM BP-3832。
[0026] Kod肥0 plus DM聚合酶购自Toyobo公司；
[0027] 限制性内切酶购自TaKaRa公司或化rmentas公司；
[0028] T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；
[0029] Axygengel纯化试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自Axygen公司；
[0030] Eas^aq DNA聚合酶购自全式金生物工程有限公司；
[0031] 其它常规试剂均为国产或进口分装。
[0032] PCR 仪为 Bio-rad PTC200。
[003引 实施例1攻瑰抱链霉菌（Streptomyces roseosporus)基因组的抽提 [0034] 基因组抽提包括下述步骤：
[00巧](1)攻瑰抱链霉菌的培养：将攻瑰抱链霉菌接种于50ml液体YEME培养基中，所述 YEME培养基包括；0. 3%酵母提取物、0. 5%蛋白腺、0. 3%麦芽糖提取物、1%葡萄糖、10%藏糖 和5mM MgCls，所述的百分比为质量体积百分比（W/V)，28°C (300巧m)培养，使菌体生长至 对数中后期。
[0036] (2)攻瑰抱链霉菌的收集：取1ml培养物于1. 5ml EP管中，室温、80(K)巧m离也 5min，弃上清，沉淀重新息浮于1ml TE (P服.0)缓冲液中。
[0037] (3)菌体裂解；加入6y 150mg/ml的溶菌酶，37C作用30分钟。再加2mol/ LNaC150y l，10%SDS110y l，20mg/ml的蛋白酶K3y 1，50°C作用化或37°C过夜(此时菌液应 为透明粘稠液体)。
[0038] (4)抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酷：氯仿：异戊醇 (25 : 24 : 1)，混匀，室温放置5?lOmin。12000巧m离也lOmin。抽提两次。
[00測 （5)沉淀；加0. 6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置lOmin。12000巧m离也lOmin。
[0040] (6)洗涂；沉淀用75%的己醇洗涂。
[0041] (7)抽（瞭)干后，溶于50 y 1 d地2〇中，取25 y 1电泳，结果显示所提取的菌体基因 组质量良好，适合作PCR模板用。
[0042] 实施例2重组表达载体pSET152erm*E-DptEF的构建：
[004引 UDptEF基因的克隆：
[0044] W实施例1所得的攻瑰抱链霉菌基因组为模板，利用引物pi和P2进行高保真PCR 扩增，得到约246化P的片段，该片段包含完整的化巧和化tF基因，其完整序列如SEQ ID NO. 6所示。其中，引物pi和p2的序列分别如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示。
[0045] (1)反应体系（50y 1)包括；5y IIOXKOD 肥 0 plus 缓冲液，3y 125mM MgC12, 1.5yl2. 5mmol/L dNTP 溶液，2. 5yl DMS0,30pmol Pl，30pmol P2，1U K孤肥 0 plus DM 聚合酶，50ng基因组，加双蒸水至50 y 1。
[0046] (2)PCR 反应程序为；95 °C 5min，30 个循环（94 °C 30s，56 °C 30s，72 °C 120s)， 72〇C lOmin。
[0047] PCR片段经过琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒纯化回收。
[004引将1 y L pACMaBS载体与3 y L纯化片段混合，37C赔育15分钟，置冰上1?2分 钟，转化大肠杆菌D册a，涂布氨予LB平板。W引物pi和P2进行菌落PCR验证，能够扩增 出相应条带（246化P)的菌落为阳性菌落。挑取阳性菌落经过LB液体培养，抽提质粒，并经 过限制性内切酶（Ndel，甜al)酶切验证并测序，获得正确的pACK4aBS-DptEF克隆。
[0049] 2、红霉素启动子erm*E的克隆：
[0050] W PIB139质粒为模板，利用引物p3和p4进行高可信度PCR扩增，得到约IWbp 片段，其中，引物p3和p4的序列分别如SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10所示。
[0051] (1)反应体系（50y 1)包括；5y IIOXKOD 肥 0 plus 缓冲液，3y 125mM MgC12, 1.5yl2. 5mmol/L dNTP 溶液，2. 5yl DMS0,30pmol P3,30pmol P4，1U K孤肥 0 plus DM 聚合酶，50ng基因组，加双蒸水至50 y 1。
[0052] (2)PCR 反应程序为；95 °C 5min，30 个循环（94 °C 30s，56 °C 30s，72 °C 120s)， 72〇C lOmin。
[005引 PCR片段经过琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒纯化回收。
[0054] 将1 y L pACMaBS载体与3 y L纯化片段混合，37C赔育15分钟，置冰上1-2分 钟，转化大肠杆菌D册a,涂布氨予LB平板，W引物P3和p4进行菌落PCR验证，能够扩增出 相应条带（190bp)的菌落为阳性菌落。挑取阳性菌落经过LB液体培养，抽提质粒，并经过 限制性内切酶（BamHI，Ndel)酶切和测序验证，获得正确的pACK4aBS-ermE克隆。
[00巧]3、构建重组载体 pSET152erm*E-DptEF :
[0056] 将克隆有红霉素启动子的重组质粒pACK4aBS-erm*E W BamHI，Ndel酶切得到启 动子片段约IWbp，将PSET152质粒W BamHI、甜al酶切获得载体片段约5. 7化，将重组质 粒pACK4aBS-DptEF W Ndel、甜al酶切获得DptEF片段约2. 46化，分别进行凝胶纯化，H个 片段W摩尔比5 ;1 ;5的比例在T4DNA连接酶的作用下16C连接过夜。取连接液5y L转化 D册a感受态细胞，之后涂布终浓度50 y g/血浓度的安普霉素LB平板，长出的单克隆通过液 体LB培养，抽提质粒，并利用Ndel，甜al酶切，得到预期大小的载体条带和化tEF插入片段 条带，进一步通过测序，验证得到正确的pSET152erm*E-DptEF质粒。本发明的载体构建过 程如图1所7]^。
[0057] 实施例3.向游动放线菌中转化pSET152erm*E-DptEF:
[0058] 制备游动放线菌抱子息液；在结合转移前5天左右，将游动放线菌甘油保藏液取 3 y 1涂布I-Isp2固体培养基，所述的I-Isp2固体培养基包括1%麦芽糖提取物、0. 4%酵母 抽提物yeast extract、0. 4%葡萄糖，2%琼脂粉，所述的百分比为质量体积百分比（W/V)，其 抑为7. 0。28°C培养120小时左右，用无菌刮棒刮取表面菌体，用15-20ml无菌水洗并通过 玻璃珠在旋润振荡器上震荡10次，每次10砂钟后，将息液通过棉花塞的无菌注射器针筒， 滤出液经过7000转/分离也后，弃去上清，用适量0. 4-1. 0ml无菌水重息即可得到抱子息 液。
[0059] 将重组表达载体pSET152erm*E-DptEF通过电击法转化入大肠杆菌ET12567 (PUZ8002)，涂布在含有终浓度50 y g/mL卡那霉素、50 y g/mL安普霉素、25 y g/mL氯 霉素的LB平板上，37C培养过夜，得到的的阳性克隆为重组大肠杆菌，WET12567 (pSET152erm*E-Dpt邸，pUZ8002)表示。
[0060] 接合转移前一天，接种 ET12567 (pSET152erm*E-DptEF，PUZ8002)重组大肠杆菌 单菌落到3mL LB试管中，加入抗生素卡那霉素（50 y g/mL)，安普霉素（50 y g/mL)，氯霉素 (25 yg/mL)培养过夜，次日W 1%接种量接入含有同浓度的H种抗生素的10血LB H角瓶 中，37C培养至0D0. 4-0. 6。保持无菌状态，450化pm, 4°C离也收集菌体，弃上清，用同体积无 菌LB洗涂一次，重复离也和洗涂一次，重息在约200 y L LB中。将大肠杆菌菌液与制备好 的游动放线菌抱子息液50 y L充分混合，涂布1-2块含有终浓度lOmMMgCls的MS平板上，所 述MS平板的组成为；2%甘露醇、2%豆饼粉、2%琼脂粉，所述的百分比为质量体积百分比（W/ V)。
[0061] 28C培养20小时后，每板均匀平铺混合了 0. 7ml无菌水、15y 1蔡巧丽酸（50mg/ ml溶解于0. IN的化OH中）和15y 1安普霉素（50mg/ml)的溶液。28°C继续培养5-10天 至单克隆长出。将单克隆在接合转移平板上划线分单菌落，使之与混杂的大肠杆菌分离，得 到纯化后的重组单克隆菌株。将菌株接种I-Isp2液体培养基，所述的I-Isp2液体培养基 包括1%麦芽糖提取物、0. 4%酵母抽提物yeast extract、0. 4%葡萄糖，其抑为7. 0。28C 培养48-72小时后，抽提基因组，利用引物pi和p2进行PCR验证重组单克隆的正确性，结 果能够扩增出预期的2. 46化DptEF条带，确认为整合了重组载体的重组表达转化子。
[00的]引物序列
[0063]
【权利要求】
1. 一种提高聚酮类化合物发酵产量的方法，其特征在于，其包括步骤：在添加了天然 油脂的培养基中培养过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因工程菌，从发酵产物 中提取聚酮类化合物，所述的基因工程菌为将含有表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白 的重组表达载体的重组大肠杆菌接合转移放线菌制得的过表达酰基辅酶A合成酶和酰基 载体蛋白重组表达转化体。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，其还包括所述的基因工程菌的制备步骤：将 表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达载体转化大肠杆菌，然后将所得的重组 大肠杆菌接合转移放线菌，所得的过表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的重组表达转 化体即为所述的基因工程菌。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的重组表达载体通过将编码所述酰基 辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因连接于质粒pSET152构建而成。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述的重组表达载体中，启动编码所述酰 基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白的基因表达的启动子为红霉素抗性基因启动子erm*E，其 序列如SEQIDNO. 5所示。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的放线菌为游动放线菌(Actinoplanes sp.)或者吸水链霉菌（Streptomyceshygroscopicus)。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白为 来源于玫瑰孢链霉菌（Streptomycesroseosporus)的酰基辅酶A合成酶和酰基载体蛋白， 其分别由来源于玫瑰孢链霉菌的DptE和DptF基因编码。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的来源于玫瑰孢链霉菌的酰基辅酶A合 成酶和酰基载体蛋白的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的来源于玫瑰孢链霉菌的DptE和DptF 基因的核苷酸序列分别如SEQIDN03和SEQIDN04所示。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的聚酮类化合物为雷帕霉素；所述的天 然油脂为豆油、玉米油和花生油中的任一种或多种。
10. -种生产雷帕霉素的基因工程菌，其为将含有表达酰基辅酶A合成酶和酰基载体 蛋白的重组表达载体的重组大肠杆菌接合转移放线菌制得的过表达酰基辅酶A合成酶和 酰基载体蛋白的重组表达转化体。
【文档编号】C12N1/20GK104513840SQ201310461966
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】胡海峰, 黄鹤 申请人:上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院