一种利用硫酯酶合成Cilengitide的方法
【专利摘要】发明的目的是提供一种Cilengitide的新型的合成方法，即利用硫酯酶（TE）介导的化学酶法催化合成抗肿瘤化合物Cilengitide，在提高了合成效率的同时又降低合成成本。本发明的合成方法与传统的化学合成法相比，在催化时间上缩短了48倍，由原先的32h（化学法）缩短为40min。在得率上由先前的27.2%，提高到了79.3%。因此，该方法使用可以大幅度的提高Cilengtide的合成效率，降低合成成本。
【专利说明】—种利用硫酯酶合成Ci Iengitide的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于绿色化工和酶催化【技术领域】，具体涉及一种利用硫酯酶(TE)介导的化学酶法催化合成抗肿瘤化合物Cilengitide的方法。
【背景技术】[0002]Cilengitide 是含有 RGD (arginine - glycine - aspartate)的五环妝。作为整合素抑制因子，也是癌症个体化治疗研究的一个新类别抗新血管生成的孤儿药物，这类药物可以竞争、干扰肿瘤细胞与细胞外基质蛋白(extracellular matrix protein,ECM)的相互作用，阻止内源性配体与之结合，从而抑制肿瘤血管的生成和细胞的增殖、侵袭和转移作用。目前抗肿瘤化合物Cilengitide已经完成了包括胶质瘤(glioblastoma, GBM)在内的多种肿瘤的I1-1II期临床试验。GBM是最具侵略性的恶性肿瘤，而“Cilengitide”是目前唯一处于III期临床并用于治疗该癌症的整合素拮抗剂。近期结合III期临床的数据，EMA(European Medicines Agency)对 Cilengitide 做出很高评价，预期不久 Cilengitide 将通过III期临床评估，作为治疗GBM的特效药走向市场。但与乐观的前期临床研究不同，目前以传统的环肽化学全合成获得的Cilengitide价格十分昂贵(约为35000元/g)，这将使得其在未来市场化的推广中障碍重重，进而难以惠及普通大众。同时化学全合成法也存在高污染、高消耗、多副反应和产率低等不足。因此，如何改变Cilengitide现有环肽合成方式，寻找新的合成途径，在提高合成效率的同时又降低合成成本是值得深入研究的一个问题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种Cilengitide的新型的合成方法，即利用利用硫酯酶(TE)介导的化学酶法催化合成抗肿瘤化合物Cilengitide,在提高了合成效率的同时又降低合成成本。
[0004]本发明首先提供硫酯酶的一种新用途,是在合成Cilengitide中的应用；
[0005]本发明还提供一种合成CiIengitide的方法，是用硫酯酶来催化底物合成Cilengitide。
[0006]上述的底物多肽的序列为:asp-phe-met-val-L_arg-gly ；
[0007]更具体的，底物为 L-asp-D-phe-N-met-L-val-L-arg-gly ；
[0008]为了使底物能更好的和TE酶结合，在C端加上了一个BMT (苄硫醇)，
[0009]上述的硫酯酶，包含有:
[0010]I)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；
[0011]2)与I)中的酶具有同源性,且能用来催化用于合成Cilengitide的底物来合成Cilengitide 的酶。
[0012]上述2)中的同源性，为具有90%以上同源性；优选为95%以上同源性，最佳为98%或以上的同源性。
[0013]上述的硫酯酶，还包括有其它来源的，与氨基酸序列为SEQ ID N0:1的酶同源性低于60%，也具有催化底物合成Cilengitide的酶，上述的酶的氨基酸序列为SEQ IDNO:5-12。
[0014]为了增加催化合成的效率，对氨基酸序列为SEQ ID NO:1的硫酯酶进行了突变的改造，改造后的硫酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
[0015]本发明的合成方法与传统的化学合成法相比，在催化时间上缩短了 48倍，由原先的的32h (化学法)缩短为40min。在得率上由先前的27.2%，提高到了 79.3%。因此，该方法使用可以大幅度的提高Cilengtide的合成效率，降低合成成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1:本发明硫酯酶催化合成的Cilengtide的HPLC分析图谱；图中各个峰分别为=Cilengitide 线性底物(Su, 30min)，水解产物(Hy, 17min),环化产物(Cy，19min)。图中，A，B，C为标准品的HLPC图谱；D为没有TE酶加入的催化反应阴性对照图谱；E为TE酶加入的催化反应的图谱；
[0017]图2:Cilengitide标准品的二级图谱；
[0018]图3:用于TE催化的Cilengitide线性底物的二级图谱；
[0019]图4:TE酶催化后产物中环肽的二级图谱；
[0020]图5:TE酶催化后产物中线性底物的二级图谱。
【具体实施方式】
[0021]对于本发明所涉及的术语的解释如下:
[0022]1、TE:thioesterase 中文译为硫酯酶，编号:EC3.1.2.14 ；
[0023]2、Cilengitide:一种含有 RGD (arginine - glycine - aspartate)的五环妝化合物，为整合素抑制因子。具有抗肿瘤作用。中文常被翻译为“西仑吉肽”或“西伦吉肽”
[0024]3、同源性:是指氨基酸序列间的相似程度。
[0025]4、BMT:英文“benzyl mercaptane”的缩写中文一般翻译成“节硫醇”
[0026]5、PPANT:英文“Phosphopanthetein”的缩写中文一般翻译成“磷酸泛酰巯基乙胺，，
[0027]6、SNAC:英文“N-acetylcysteamine”的缩写中文一般译成“乙酰半胱胺”
[0028]7、Thiophenol:中文一般译成“硫酚”
[0029]8、底物 L-asp-D-phe-N-met-L-val-L-arg-gly ;其中 L、D 代表 L 型氛基酸和 D 型氨基酸，N-met代表N端进行甲基化修饰；
[0030]下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
[0031]实施例1:硫酯酶原核表达载体的构建
[0032]1.1引物设计
[0033]根据GenBank公布的微囊藻硫酯酶基因序列BAA83994设计以下引物。上游引物 PET-28TE-F1:5' -ATA GCT AGC ATC TAT GCT CAA GAG ATG AAT-3'，下游引物PET-28TE-R1:5/ -TTC AAG CTT TTA CGA CTG TTT TGG GTT GAG-3'。上下游引物分别引ANde I和Bam HI酶切位点(下划线所示)，酶切位点前碱基为保护碱基。引物均由上海英骏生物技术有限公司引物合成。
[0034]1.2硫酯酶结构域的克隆
[0035]微囊藻基因组DNA的提取按DNeasy plant Mini Kit50试剂说明书扩增得到的片段约720bp，取割胶回纯后的DNA2 □ I用于连接反应，体系5 □ 1，全部用于转化。取200 □ I转化液涂板，培养过夜。随机挑选10个阳性克隆进行鉴定，活化后送至invitrogen公司测序鉴定。测序结果表明所获得的阳性克隆的核苷酸序列与GenBank编号为BAA83994的序列一致。其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，翻译的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
[0036]1.3硫酯酶载体构建
[0037]将筛选为阳性克隆的pMD18T-TE及pET28a(+) (Novagen)采用碱裂法小量抽提质粒用于双酶切的质粒。具体操作步骤按照generay质粒微量提取试剂盒(离心柱型)说明书。将纯化后的质粒用Nde I和Bam HI (New England lab) 37°C孵育器3h酶切，将酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带，用E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit纯化。取回收片段作重组连接反应，10 μ I连接过夜，用于转化。取200 μ I转化液涂板，培养过夜。随机挑选10个阳性克隆进行鉴定，活化后送至invitrogen公司测序鉴定。
[0038]1.4硫酯酶体外诱导表达
[0039]重组表达质粒pET28a_TE转化BL21 (DE3) pLysE表达菌株(转化方法按照《分子克隆实验指南》)。挑选单菌落分别接种于5ml含卡那霉素(50μ g/ml)LB培养基，37°C过夜培养。各取1.8ml过夜培养物于2ml的菌种保存管中，然后加入200 μ I的无菌甘油(终浓度10%)，混匀后于-70°C保存，剩余菌液作为诱导表达的母液。将上述母液按1:100比例分别接种于5ml含卡那霉素(50μ g/ml)M9培养基，37°C培养，测定0D600=0.5~0.7时，取Iml作为诱导前样品，剩余培养液`中加入适量IPTG (终浓度0.5mM),于16°C，继续培养6h。
[0040]1.5硫酯酶诱导产物的纯化
[0041]将成熟菌液于50ml离心管，4000g,4°C离心20min收集菌体。加5ml columnbuffer/g重悬菌体,重悬后的菌体于镟润振荡器连续振荡20min,之后于Precellys24菌体破碎仪中6500rpm4X30s镟润破碎，12000rpm离心IOmin后,取上清进行目的蛋白纯化。
[0042]a)用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱,流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液(Binding Buffer:20mM Tris-HCl (PH7.9) IOmM 咪唑 0.5M NaCl)；
[0043]b)使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子,洗去杂蛋白；
[0044]c)使用 Elution Buffer 洗脱，收集洗脱峰(Elution Buffer:20mM Tris-HCl(PH7.9) 200~500禮咪唑0.5M NaCl)，将流出液收集后备用；
[0045]d)洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，4°C保存；
[0046]e)将梯度洗脱后的流出液用Millipore超滤管(15mllOKD)于5000g水平转子超滤40min，对目的蛋白浓缩后_20°C备用。对诱导产物的全细胞裂解物，空载阴性对照，重组体未诱导阴性对照，流穿液及浓缩目的蛋白用5%浓缩胶和12%分离胶SDS-PAGE检测。
[0047]实施例2:硫酯酶催化合成Cilengitide产物
[0048]以实施例1制备、表达纯化的硫酯酶蛋白为催化反应酶的来源(硫酯酶可以按照序列进行人工合成)来催化合成Cilengitide产物,催化合成步骤如下:首先设计合成适于硫酯酶催化的 Cilengtide 的线性多肽底物 L-aspartyl-D-phenylalanyl-N-methyl-L-valyl-L-arginyl-glycyl ;该底物通过人工合成。用于磷酸缓冲液将其溶解稀释到终浓度为0.5mM线性肽，随后加入实验例I中制备的TE蛋白酶，并用MOPS缓冲液补足到500μ 1，最终使TE酶与线性底物的浓度比达到1:10。将该混合液置于24°C的温度下孵育6h后立即放入_70°C，使酶催化反应停止，完成Cilengitide产物的合成。随后将反应产物进行冷冻干燥，干燥后反应产物加入适量甲醇重新溶解后，溶解物于12000rpm，离心IOmin加注到制备型的HPLC,并依据Cilengitide标准品的吸收波长和出峰时间进行分离制备Cilengitide的纯品(液相条件:4.6 X 250mn, VYDAC-C18。Solvent C:0.l%acetic acid inl00%water ；Solvent D:100%methanol,检测波长:220nm ;梯度:D, 0 ~39min40% ~90%, 40min90%),分离后的Cilengitide进行冷冻干燥,保存待用。[0049]将催化反应合成的产物冷冻干燥后，加350 μ I甲醇溶解，溶解物于12000rpm，离心lOmin，在40μ I溶解物上清加160 μ I甲醇(稀释5倍)后取IOyl上机。液相条件:4.6Χ250mn, VYDAC-C18。Solvent C:0.l%acetic acid inl00%water ；SolventD:100%methanol,流速:600ul/min ;上样体积:10ul ；检测波长:220nm ;梯度:D,0 ~39min40% ~90%,40min90%。
[0050]催化后的Cilengitide产物,线性水解Cilengitide及剩余底物均能与标准品的液相出峰时间相一致(图1)，Cilengitide标准品一级质谱数据显示其的分子量是589.3(计算值)，催化反应产物中的实际观察值为=589.34。Cilengitide线性底物的标准品一级质谱数据显示其分子量为713.5 (计算值)，催化反应产物中的实际观察值为713.4(表1)。为进一步验证催化产物是否为Cilengitide,分别对Cilengitide标准品、线性肽标准品以及催化后的产物进行MS-MS分析，如图2、3、4和5所示。在40v能量的攻击下，标准品Cilengitide和催化产物中均有特征离子碎片:86.3m/z312.1m/zl20.2m/z,所以从一级和二级数据均能证实该催化产物为Cilengitide。对序列为SEQ ID NO:1的酶进行人工合成，其也具有上述的催化合成Cilengitide的能力,催化效果也与重组表达的酶一致。
[0051]表1:催化产物的一级质谱数据
[0052]
【权利要求】
1.一种硫酯酶的用途,其特征在于,是在合成Cilengitide中的应用。
2.一种合成Cilengitide的方法，其特征在于，是用硫酯酶来催化底物合成Cilengitide0
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于所述的底物为L-asp-D-phe-N-met-L-val-L-arg-gly0
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的底物的C端连接了BMT。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的硫酯酶，包含有: 1)氨基酸序列为SEQID NO:1的酶； 2)与I)中的酶具有同源性，且能用来催化用于合成Cilengitide的底物来合成Cilengitide的硫酯酶。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的2)中的同源性，为具有90%以上同源性。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的2)中的同源性，为具有95%以上同源性。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的2)中的同源性，为具有98%或以上的同源性。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的硫酯酶的氨基酸序列为SEQIDNO:5-12中的任一个或几个。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的硫酯酶的氨基酸序列为SEQIDNO:3。
【文档编号】C12P21/04GK103525889SQ201310471179
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月11日 优先权日:2013年10月11日
【发明者】朱鹏, 严小军, 方剑, 范建忠, 黄海龙 申请人:宁波大学, 宁波博奥生物工程有限公司