分枝杆菌快速药敏检测方法及检测靶标的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种分枝杆菌快速药敏检测方法和检测靶标，以及用于所述检测方法的试剂盒；其中，所述检测靶标选自核糖体RNA的间隔序列中的任意一种或几种的组合。本发明方法，仅需要少量的细菌即可进行药敏检测，检测时间仅需24-72h；而且RNA提取方法检测，不需要去除基因组DNA即可进行检测；同时本发明方法具有较高的灵敏度和特异度。
【专利说明】分枝杆菌快速药敏检测方法及检测靶标
【技术领域】[0001]本发明涉及一种分枝杆菌的检测方法和检测靶标，尤其涉及一种所需细菌少、检测时间短、操作方便的药敏检测方法和靶标。
【背景技术】
[0002]分枝杆菌是一类细长略弯曲的微生物，主要种类包括结核分枝杆菌、非典型分枝杆菌、腐物寄生性分枝杆菌和麻风分枝杆菌等，其中含有多种致病菌。分枝杆菌不产生内、外毒素，致病性可能与细菌在组织细胞中大量繁殖引起的炎症、菌体成分和代谢物质的毒性以及对菌体成分产生的免疫损伤有关。其中，麻风病目前并没有特异性的预防方法，而结核病自20世纪80年代以来由于与HIV混合感染、移民以及耐药菌株的出现而全面复活。
[0003]中国是22个结核病高发国家之一，而且中国结核病人中携带耐药菌株的患者占28%-40%，远高于其它国家，耐药结核菌株的增加给结核病的防治带来极大困难。目前结核的治疗仍然以抗结核药物化学治疗为主，但是近年来对一种或多种抗结核药物同时耐药的菌株(多耐药菌)明显增多，因此准确的药敏实验结果对于指导临床治疗和合理用药至关重要。
[0004]分枝杆菌药敏检测已有诸多报道，目前分枝杆菌药敏实验多采用绝对浓度法和比例法(全国临床检验操作规程第三版)，如CN102010886A公开的结核分枝杆菌药敏检测方法。但是分枝杆菌生长缓慢，在传统罗氏(L-J)培养基上，需要4-8周才能生长出菌落，在经4周后才能得到药敏结果。
[0005]CNlOl 130808B采用连续超千倍放大系统在早期培养过程中，观察单个细菌的增殖和微小菌簇的增殖形态，从而可以早期判断药物作用的结果，但是该方法依然需要一周的时间获得药敏结果。
[0006]目前，PCR、探针杂交、DNA测序等分子生物学方法已应用于分枝杆菌的直接检测，DNA检测时基因突变检测的金标准，但是检测成本过高，DNA芯片检测在理论上可以对样品大量序列进行检测和分析，但是目前尚未见到有适用于临床的DNA芯片实现商业化。实验室研究以及临床检测所用的核酸定量扩增检测方法主要以实时荧光定量PCR为主，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测反应进程，通过标准曲线进行定量分析。但是实时荧光定量PCR检测在操作方法和检测成本上存在很大局限性，CN1661359B公开了一种核酸等温扩增定量检测方法，将等温放大与TaqMan或TaqMan MGB荧光探针结合，该专利提出用逆转录酶的外切酶的酶活性降解所述荧光探针产生的应该信号。CN101333565B公开了一种将核酸恒温放大与检测同步进行的检测方法，在密闭容器中进行恒温放大反应，并同时检测体系中荧光信号的变化，根据荧光信号的变化时间和强度对核酸样品进行定量或定性检测。
[0007]但是具体到分枝杆菌的药敏检测，找到有效的检测靶标是进行药敏检测的根本和基础。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的是寻找分枝杆菌药敏检测靶标、并在此基础上进行快速药敏检测的问题。
[0009]本发明的目的在于提供一种分枝杆菌快速药敏检测方法及靶标。
[0010]本发明的第一个方面提供了一种用于分枝杆菌快速药敏检测的靶标，所述靶标选自一种或几种核糖体RNA的间隔序列。
[0011]其中，所述核糖体RNA的间隔序列优选为选自5s rRNA与16s rRNA之间的间隔序列(pre-16s RNA)、16s rRNA与23s rRNA之间的间隔序列(pre_23s RNA)、及含有此部分序列全部或者部分的序列中的任意一种作为扩增或者检测靶标。
[0012]本发明第二个方面是提供一种分枝杆菌快速药敏检测方法，所述方法包括如下步骤:
[0013]以本发明第一个方面所述任意一种或几种靶标RNA序列设计RNA探针和引物，在逆转录酶和RNA聚合酶的作用下，对靶标RNA进行RNA扩增，通过比较对照组和加药组内靶标RNA量的差异，判断药物敏感性。
[0014]其中，所述的RNA探针的两端优选为用荧光基团和淬灭基团进行标记。
[0015]其中，本发明所述的RNA探针优选为茎环结构。
[0016]其中，本发明所述的RNA引物，优选地，其中一条引物与所述靶标RNA序列相匹配，并且带有T7启动子；另一条引物为合成cDNA互补链的引物。
[0017]在本发明第二个方面所述的方法的一种优选实施例中，所述RNA扩增反应在40-45°C条件下进行，优选为41-44°C，更优选为42_43°C，最优选为42°C。
[0018]在本发明第二个方面所述的方法的一种优选实施例中，在所述RNA扩增过程中，每一次扩增循环检测一次荧光信号，共检测至少30个循环，优选为至少35个循环，更优选为至少40个循环。
[0019]在本发明第二个方面所述的方法的一种优选实施例中，以检测到的荧光信号值的log值为纵坐标，循环数为横坐标，进行绘图，确定检测曲线达到阈值所需的循环数，即dt值；其中加药组dt减去对照组dt得到的△ dt与判断界值对比，如果大于判断界值则判断为敏感，如果小于判断界值则判断为耐药。
[0020]本发明第三个方面是提供一种分枝杆菌快速药敏检测试剂盒，包括针对本发明第一个方面所述任意一种或几种靶标设计的RNA引物和RNA探针。
[0021]在本发明一种优选实施例中，所述RNA引物和RNA探针如下:
[0022]正向引物:5’-GTCTTGACTCCATTGCCGGA-3’ ；
[0023]反向引物:5’-TGACAAAACAAACGGCCACG-3’ ；
[0024]探针序列:5’-CGUGGAUUAGACUGGCAGCCACG-3’。
[0025]在本发明另一种优选实施例中，所述RNA引物和RNA探针如下:
[0026]正向引物:5’-CCGTGAGGGGTTCTTGTCTG-3’ ；
[0027]反向引物:5’-AAGTCCGAGTGTTGCCTCAG-3’ ；
[0028]探针序列:5’-CGACGGCAACACUCGGACUUGGUCG-3’。
[0029]在本发明一种优选实施例中，所述分枝杆菌为结核分枝杆菌。
[0030]本发明所提供的新型分枝杆菌快速药敏检测方法，通过比较对照管和加药管内分枝杆菌特定靶标RNA的差异，判断药物敏感性。该方法的优点在于，仅需要少量的细菌即可进行药敏检测，检测时间仅需24-72h，且RNA提取方法检测，不需要去除基因组DNA即可进行检测；另外本发明方法还具有较高的灵敏度和特异度。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为本发明以pre_16s RNA为检测靶标的药敏检测方法的灵敏度和特异度检测
结果;
[0032]图2为本发明以pre-23s RNA为检测靶标的药敏检测方法的灵敏度和特异度检测结果。
【具体实施方式】
[0033]实施例1
[0034]结核分枝杆菌临床分离株共计96份，每一份均分为均等的两份，一份加入液体培养基培养(对照组)，另一份加入含有利福平药物的液体培养基培养(加药组)，利福平浓度lug/ml，在 37°C C 培养 2 天。
[0035]将培养后样本13000r/min离心5min，弃上清，加入50ul样本稀释液(用DEPC处理过的无菌H2O配制10mmol/L柠檬酸钠,pH值为8.0),重悬后放入超声清洗器中进行超声处理15min，超声功率300W。
[0036]超声结束后，各取2ul处理物加入预先混合好的30ul扩增检测液，扩增检测液中含 40mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液(pH 值为 8.l),8mmol/L 氯化镁，25mmol/L 氯化钠，2mmol/L亚精胺，5mmol/L 二硫苏糖醇，80mg/L牛血清白蛋白，脱氧核糖腺苷三磷酸、脱氧核糖胸苷三磷酸、脱氧核糖鸟苷三磷酸和脱氧核糖胞苷三磷酸各200 μ mol/L,腺苷三磷酸、鸟苷三磷酸、胞苷三磷酸和尿苷三磷酸各lmmol/L，引物浓度和探针浓度均为0.5mmol/L。
[0037]其中，所述引物和探针以pre-16s RNA为检测靶标进行设计，探针5’端进行FAM标记，3’端进行DABCYL标记。所述引物和探针序列如下:
[0038]正向引物:5’ -GTCTTGACTCCATTGCCGGA-3 ’
[0039]反向引物:5’ -TGACAAAACAAACGGCCACG-3 ’
[0040]探针序列:5’-CGUGGAUUAGACUGGCAGCCACG-3’
[0041 ] 将反应管置于PCR仪上60°C、IOmin, 42°C、5min,同时将酶液预热至42°C。预热后，向每支反应管中加入IOul酶液(含M-MLV和T7RNA转录酶各2000U)，混匀后将反应管快速转至实时荧光定量PCR仪中启动反应程序。反应程序为荧光通道设定为FAM,每个循环为42 0C、Imin，共40个循环；荧光信号收集I次/min，共检测40次。
[0042]样本曲线与阈值线交叉点的横坐标读数(检测时间)。
[0043]将加药组的dt值减去对照组的dt值,得到Λ dt值。用Λ dt与判断界值相比较，大于判断界值则判断为敏感，小于等于判断界值也判定为耐药。
[0044]同时与标准药敏检测方法Bactec MGIT960相比较，本方法检测利福平药敏的灵敏度和特异度分别达到90.2%和88.7% (`图1)。
[0045]采用上述方法，以表1和2中的RNA序列为检测靶标，检测结核分枝杆菌对主要抗结核药物的药敏性，并与标准药敏检测方法Bactec MGIT960相比较，检测灵敏度和特异度。[0046]实施例2
[0047]结核分枝杆菌菌株共计20份(敏感株和耐药株各10份)，每一份均分为均等的两份，一份加入液体培养基培养(对照组)，另一份加入含有利福平药物的液体培养基培养(加药组)，利福平浓度lug/ml，在37 °C培养2天。
[0048]将培养后样本13000r/min离心5min，弃上清，加入50ul样本稀释液(用DEPC处理过的无菌H2O配制10mmol/L柠檬酸钠,pH值为8.0),重悬后放入超声清洗器中进行超声处理15min，超声功率300W。
[0049]超声结束后，各取2ul处理物加入预先混合好的30ul扩增检测液，扩增检测液中含 40mmol/L 的 Tris-HCl 缓冲液(pH 值为 8.l),8mmol/L 氯化镁，25mmol/L 氯化钠，2mmol/L亚精胺，5mmol/L 二硫苏糖醇，80mg/L牛血清白蛋白，脱氧核糖腺苷三磷酸、脱氧核糖胸苷三磷酸、脱氧核糖鸟苷三磷酸和脱氧核糖胞苷三磷酸各200 μ mol/L,腺苷三磷酸、鸟苷三磷酸、胞苷三磷酸和尿苷三磷酸各lmmol/L，引物浓度和探针浓度均为0.5mmol/L。
[0050]其中，所述引物和探针以pre-23s RNA为检测靶标进行设计，探针5’端进行FAM标记，3’端进行DABCYL标记。所述引物和探针序列如下:
[0051 ]正向引物:5，-CCGTGAGGGGTTCTTGTCTG-3 ’
[0052]反向引物:5’ -AAGTCCGAGTGTTGCCTCAG-3 ’
[0053]探针序列:5’-CGACGGCAACACUCGGACUUGGUCG-3，
[0054]按照实施例1所述的 方法仅药敏检测，同时与标准药敏检测方法Bactec MGIT960相比较，本方法检测利福平药敏的灵敏度和特异度分别达到100%和100% (图2)。
[0055]采用同样的方法，以pre_16s RNA和pre_23s RNA为检测祀标,检测结核分枝杆菌对异烟肼、吡嗪酰胺和乙胺丁醇等一线抗结核药物的药敏性，结果显示，本发明方法也具有良好的灵敏度和特异度。
[0056]因此，pre_16s RNA和pre_23s RNA可以作为检测分枝杆菌药敏性的检测祀标,用于药物合成、筛选等领域，此外，以pre_16s RNA和pre_23s RNA为检测祀标,进行分枝杆菌药敏性检测，用菌量少、检测速度快，可以快速的提供检测结果，作为结核等分枝杆菌感染的用药和治疗的参考和依据。
[0057]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【权利要求】
1.一种用于分枝杆菌快速药敏检测的靶标，其特征在于，所述靶标选自一种或几种核糖体RNA的间隔序列，所述核糖体RNA的间隔序列选自5s rRNA与16s rRNA之间的间隔序列、16s rRNA与23s rRNA之间的间隔序列、及含有此部分序列全部或者部分的序列中的任意一种作为扩增或者检测靶标。
2.根据权利要求1所述的靶标，其特征在于，所述分枝杆菌为结核分枝杆菌。
3.一种分枝杆菌快速药敏检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:以权利要求I所述任意一种或几种靶标RNA序列设计RNA探针和引物，在逆转录酶和RNA聚合酶的作用下，对靶标RNA进行RNA扩增，通过比较对照组和加药组内靶标RNA量的差异，判断药物敏感性。
4.根据权利要求3快速药敏检测方法，其特征在于，所述的RNA探针的两端用荧光基团和淬灭基团进行标记。
5.根据权利要求4快速药敏检测方法，其特征在于，所述的RNA引物中，其中一条引物与所述靶标RNA序列相匹配，并且带有T7启动子；另一条引物为合成cDNA互补链的引物。
6.根据权利要求4快速药敏检测方法，其特征在于，在所述RNA扩增过程中，每一次扩增循环检测一次荧光信号，共检测至少30个循环； 以检测到的荧光信号值的log值为纵坐标，循环数为横坐标，进行绘图，确定检测曲线达到阈值所需的循环数，即dt值；其中加药组dt减去对照组dt得到的Λ dt与判断界值对t匕，如果大于判断界值则判断为敏感，如果小于判断界值则判断为耐药。
7.根据权利要求4快速药敏检测方法，其特征在于，所述靶标选自5srRNA与16s rRNA之间的间隔序列、16s rRNA与23s rRNA之间的间隔序列、及含有此部分序列全部或者部分的序列中的任意一种作为扩增或者检测靶标。
8.一种分枝杆菌快速药敏检测试剂盒，其特征在于，包括针对权利要求1所述任意一种或几种检测靶标设计的RNA引物和RNA探针。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA引物和RNA探针为: 正向引物:5 ’ -GTCTTGACTCCATTGCCGGA-3，；
反向引物:5 ’ -TGACAAAACAAACGGCCACG-3 ’ ； 探针序列:5’ -CGUGGAUUAGACUGGCAGCCACG-3’。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA引物和RNA探针为: 正向引物:5 ’ -CCGTGAGGGGTTCTTGTCTG-3，； 反向引物:5 ’ -AAGTCCGAGTGTTGCCTCAG-3，； 探针序列:5’ -CGACGGCAACACUCGGACUUGGUCG-3’。
【文档编号】C12Q1/68GK103555828SQ201310471718
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】崔振玲, 胡忠义, 程松, 张长明, 于明辉 申请人:上海市肺科医院, 上海仁度生物科技有限公司