一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括组件A、B、C、D、E、F、G和H；组件A为用于制备骨髓单个核细胞的物质；组件B为用于培养骨髓间充质干细胞形成集落的物质；组件C为用于对骨髓间充质干细胞集落进行计数的物质；组件D为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成骨细胞的能力的物质；组件E为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成脂肪细胞的能力的物质；组件F为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有抑制T淋巴细胞增殖的能力的物质；组件G为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有作为造血干细胞的饲养细胞的能力的物质。本发明提供的试剂盒操作简单、方便实用，可以检测造血干细胞移植术后骨髓造血微环境恢复情况，为间充质干细胞的研究应用奠定了基础。
【专利说明】一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒。
【背景技术】
[0002]造血干细胞移植是治疗多种恶性血液病的最有效的手段之一。在移植入健康的造血干细胞之前，通常需要借助各种药物或者放射线对患者体内的恶性血液病细胞进行清除(医学上常称之为预处理)，这种大剂量的药物或者放射线往往在杀灭了肿瘤细胞的同时也破坏了患者骨髓内的造血微环境。
[0003]骨髓造血微环境位于骨髓腔内，主要指骨髓内的基质细胞(包括成骨细胞、成脂肪细胞、间充质干细胞和内皮细胞等)，它们通过分泌各种细胞因子(IFN-Y、IL-1 β、IL-17、IL-6 > IL-7 > VEGF> SCF> TGF- β )和表达表面黏附分子(Angiopoientin-Ι、β _catenin、CD44、CXCLl2, Jaggedl、Noctch-1、N-cadherin、VLA-4、VLA-5、Tie-2)来支持造血干细胞的自我更新和多向分化。当患者接受了造血干细胞移植术后，输入的健康的造血干细胞首先归巢到骨髓造血微环境中并且植入，进行增殖，再迁移到脾脏和胸腺等免疫器官内进行造血系统和免疫系统的重建。如果造血干细胞移植术后造血和免疫重建严重迟缓,细胞免疫持续功能低下，将会引起严重感染和白血病复发，甚至导致患者死亡。因此，检测造血干细胞移植术后患者骨髓造血微环境的重建对于评价患者造血系统和免疫系统能否恢复以及恢复的快慢至关重要，可以为优化治疗方案提供有力的科学依据。然而，目前对于骨髓造血微环境的重建还缺乏科学有效的检测方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是 提供一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒。
[0005]本发明提供了一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒，包括组件A、组件B、组件C、组件D、组件E、组件F、组件G和组件H ;所述组件A为用于制备骨髓单个核细胞的物质；所述组件B为用于培养骨髓间充质干细胞形成集落的物质；所述组件C为用于对骨髓间充质干细胞集落进行计数的物质；所述组件D为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成骨细胞的能力的物质；所述组件E为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成脂肪细胞的能力的物质；所述组件F为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有抑制T淋巴细胞增殖的能力的物质；所述组件G为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有作为造血干细胞的饲养细胞的能力的物质；
[0006]所述组件H为记载有如下判断标准的载体:如果满足如下(I)至(5)，造血干细胞移植术后骨髓微环境重建成功:
[0007](I)患者进行造血干细胞移植术后9个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞数量与该患者进行造血干细胞移植术的预处理前的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞数量没有显著差异；
[0008](2)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有分化成成骨细胞的能力；
[0009](3)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有分化成成脂肪细胞的能力；
[0010](4)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有抑制T淋巴细胞增殖的能力；
[0011](5)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有作为造血干细胞的饲养细胞的能力。
[0012]所述(4)中，所述“抑制T淋巴细胞增殖”指的是“PHA或同种异体T淋巴细胞刺激引起的T淋巴细胞增殖”。
[0013]所述(4)和/或(5)中，所述骨髓间充质干细胞具体可为转至第0-6代的骨髓间充质干细胞，具体可为转至第4代的骨髓间充质干细胞。
[0014]所述组件A为人淋巴细胞分离液或所述组件A包括人淋巴细胞分离液。
[0015]用所述组件A制备骨髓单个核细胞的方法具体如下:
[0016]( I)用PBS缓冲液吹打悬浮骨髓样本，得到细胞悬液；
[0017](2)取试管，加入4毫升人淋巴细胞分离液和4毫升步骤(1)得到的细胞悬液，保持界面完整，1500rpm离心15分钟，取骨髓单个核细胞层(即自上而下的第二层)。
[0018]所述组件B为含5-20% (具体可为10% )体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基或所述组件B包括含10%体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基。
[0019]用所述组件B培养骨髓间充质干细胞形成集落的方法具体如下:取6孔培养板，按照2X IO5个细胞/平方厘米的密度接种骨髓单个核细胞，采用含5-20% (具体可为10%)体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基，在35-38°C、5-15%C02条件下(具体在37°C、5%C02条件下)培养14天，每隔两天全量更换相同的培养基。
[0020]所述组件C为结晶紫或所述组件C包括结晶紫。
[0021]所述组件D包括成骨分化诱导液和碱性磷酸酶染色试剂。
[0022]所述成骨分化诱导液具体如下:含50 μΜ抗坏血酸磷酸盐、0.1 μΜ地塞米松、IOmM β -磷酸甘油和5-20% (具体可为10% )体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基。
[0023]用所述组件D诱导骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞的方法具体如下:取骨髓间充质干细胞，加入成骨分化诱导液，在37°C、5%C02条件下培养14天(每隔两天全量更换相同的成骨分化诱导液)，然后利用碱性磷酸酶染色试剂盒鉴定成骨细胞。
[0024]所述组件D具体可由成骨分化诱导液和碱性磷酸酶组成。
[0025]所述组件E包括成脂肪分化诱导液和油红O。
[0026]所述成脂肪分化诱导液的具体如下:含I μ M地塞米松、10 μ g/ml胰岛素和5_20%(具体可为10% )体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基。
[0027]用所述组件E诱导骨髓间充质干细胞分化成成脂肪细胞的方法具体如下；取骨髓间充质干细胞，加入成脂肪分化诱导液，在37°C、5%C02条件下培养14天(每隔两天全量更换相同的成脂肪分化诱导液)，然后利用油红染色鉴定脂肪细胞。
[0028]所述组件E具体可由成脂肪分化诱导液和油红组成。
[0029]所述组件F包括离体的人⑶3+T淋巴细胞和CFSE。
[0030]用所述组件F鉴定骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的抑制能力的一种具体方法如下:(I)取ImL人⑶3+T淋巴细胞的细胞悬液，加入CFSE并使其浓度为10 μ Μ，室温孵育25分钟，然后加入IOmL含2% (体积比)胎牛血清的PBS缓冲液以终止反应，1000rpm离心10分钟，收集细胞；(2)取6孔板，按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种骨髓间充质干细胞，然后接种步骤(1)得到的人CD3+T淋巴细胞(使骨髓间充质干细胞与人CD3+T淋巴细胞的数量比为1:10)，加入PHA并使其浓度为2 μ g/ml，在37°C、5%C02条件下培养2_4天，收集人CD3+T淋巴细胞并采用流式细胞仪检测。
[0031 ] 用所述组件F鉴定骨髓间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的抑制能力的另一种具体方法如下:(I)取ImL人⑶3+T淋巴细胞的细胞悬液，加入CFSE并使其浓度为10 μ Μ，室温孵育25分钟，然后加入IOmL含2% (体积比)胎牛血清的PBS缓冲液以终止反应，1000rpm离心10分钟，收集细胞；(2)取6孔板，按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种骨髓间充质干细胞，然后接种步骤(1)得到的人CD3+T淋巴细胞(使骨髓间充质干细胞与人CD3+T淋巴细胞的数量比为1:10)，然后按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种用IOGy剂量的钴-60照射过的同种异体的人⑶3+Τ淋巴细胞，在37°C、5%C02条件下培养2-4天，收集人⑶3+T淋巴细胞并采用流式细胞仪检测。
[0032]所述组件F包括同种异体的人⑶3+T淋巴细胞和CFSE。
[0033]所述组件F具体可由人⑶3+T淋巴细胞和CFSE组成。
[0034]所述组件F具体可由同种异体的人⑶3+T淋巴细胞和CFSE组成。
[0035]所述组件G包括离体的人⑶34+造血干细胞、含5-20% (具体可为10% )体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基和造血干细胞集落专用培养基。
[0036]用所述组件G鉴定骨髓间充质干细胞具有作为造血干细胞的饲养细胞的能力的方法具体如下:取6孔板，按照IXlO5个细胞/平方厘米的密度接种骨髓间充质干细胞，然后接种人CD34+造血干细胞(使 骨髓间充质干细胞与人CD34+造血干细胞的数量比为5:1)，在37°C、5%C02条件下共培养7周(采用含5-20% (具体可为10%)体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基，每周半量更换相同的培养基)；培养7周的过程中，每周吸出的悬浮细胞(造血干细胞具有悬浮的特性)，接种于96孔培养板，采用造血干细胞集落专用培养基，在37°C、5%C02条件下培养5天。
[0037]所述试剂盒还包括PBS缓冲液。所述PBS缓冲液具体可为pH7.4、IM的PBS缓冲
液组成。
[0038]所述低糖DMEM培养基既可以直接从公司购买，也可以自己配制。所述低糖DMEM培养基的制备方法具体如下:取12.1g低糖DMEM粉末、2mmol L-谷氨酰胺、2.4g NaHCOjP25mmol HEPES，溶于水并用水定容至1L。
[0039]所述试剂盒具体可由所述组件A、所述组件B、所述组件C、所述组件D、所述组件E、所述组件F、所述组件G和所述组件H组成。
[0040]所述试剂盒具体可由所述组件A、所述组件B、所述组件C、所述组件D、所述组件E、所述组件F、所述组件G、所述组件H和所述PBS缓冲液组成。
[0041]骨髓间充质干细胞是骨髓造血微环境中一种极其重要的干细胞。骨髓间充质干细胞可以分泌多种造血调节因子，在体内和体外都可以支持造血干细胞增殖并分化为多种血液细胞和免疫细胞。骨髓间充质干细胞不仅自己直接支持造血活动，其分化出的子代细胞也具有造血调节能力。骨髓间充质干细胞是骨髓微环境中多种细胞的祖细胞，其在适宜的环境中可以分化为成骨细胞、成脂肪细胞等细胞，参与造血和免疫调节活动。此外，骨髓间充质干细胞具有自我更新能力，即它能够自我复制，从而保持其数量的稳定 。
[0042]基于对于骨髓造血微环境的结构和间充质干细胞生物学特性的深刻认识，本发明的发明人提出通过检测造血干细胞移植术后患者骨髓间充质干细胞的数量和功能，进而评价骨髓造血微环境功能恢复情况的新策略，并加以了验证。本发明的发明人发现，患者骨髓内的间充质干细胞数量在造血干细胞移植术后早期(I个月)大幅减少，然后逐渐增多，在移植后9个月时能够恢复到移植前的水平。同时，本发明的发明人发现，移植后的间充质干细胞的造血支持能力和免疫调节能力依然保留。因此，通过检测造血干细胞移植后的患者骨髓间充质干细胞数量和功能可以辅助评价造血恢复和免疫重建情况。本发明基于扎实的研究基础，是该领域的原始性创新，有助于优化现有的临床检测体系。
[0043]本发明提供的试剂盒操作简单、方便实用，可以检测造血干细胞移植术后骨髓造血微环境恢复情况，为间充质干细胞的研究应用奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1为实施例1中骨髓间充质干细胞集落的形态。
[0045]图2为实施例1中骨髓间充质干细胞集落的数量。
[0046]图3为实施例1中碱性磷酸酶染色的结果。
[0047]图4为实施例1中油红O染色的结果。
[0048]图5为实施例2的结果。
[0049]图6为实施例3中的照片。
[0050]图7为实施例3中照造血干细胞集落的数量。
【具体实施方式】
[0051]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0052]造血干细胞集落专用培养基:StemCellTechnologies公司，货号为28404。
[0053]人淋巴细胞分离液:天津灏洋生物，货号为LTS1077。
[0054]低糖DMEM粉末:GIBC0公司，货号为31600-034。
[0055]低糖DMEM培养基的制备方法:取12.1g低糖DMEM粉末、2mmol L-谷氨酰胺、
2.4gNaHC03和25mmol HEPES，溶于水并用水定容至1L。
[0056]结晶紫染料:碧云天公司产品，货号为C0121。
[0057]抗坏血酸磷酸盐:SIGMA公司产品，货号为A-8960。
[0058]地塞米松:SIGMA公司，货号为D-2915。
[0059]β-磷酸甘油:MERCK公司，货号为Art4168。
[0060]碱性磷酸酶染色试剂盒=SIGMA公司，货号为85L3R。
[0061]胰岛素:SIGMA公司，货号为1-6634。
[0062]油红O:Amresco公司，货号为0684。[0063]CFSE,全称为 5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester(CFSE是一种可以标记在细胞上的绿色荧光染料，其荧光强度随着细胞分裂增殖而渐次衰减，利用这个原理能够以流式细胞仪测定细胞的增殖情况):Sigma，产品目录号为21888-25MG-F。
[0064]PHA (Phytohemagglutinin):Sigma,货号为 Sigma_L1668。
[0065]人CD3+T 淋巴细胞:用免疫磁珠(MACS pan T lymphocytes Isolation Kit,Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)从知情同意的健康献血者外周血中分离获得，分离纯度在90%以上。
[0066]人CD34+造血干细胞:用免疫磁珠(MACS CD34+cell Isolation Kit, MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, Germany)从知情同意的健康献髓者骨髓中分离获得,分离纯度在90%以上。
[0067]实施例中所用的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH7.4、1M的PBS缓冲液。
[0068]实施例1、骨髓间充质干细胞集落的培养和鉴定
[0069]一、骨髓间充质干细胞集落的培养
[0070]15位知情同意的志愿者(该15位志愿者已进行了造血干细胞移植术后2年的追踪，该次造血干细胞移植术均已成功，存活状态良好)，分别为急性淋巴细胞白血病患者8位、急性髓性细胞白血病患者4位、慢性髓性细胞白血病患者3位，各个志愿者均进行了造血干细胞移植术，分别于进行造血干细胞移植术的预处理前取骨髓样本(骨髓样本-O)、进行造血干细胞移植术后I个月取骨髓样本(骨髓样本-1)、进行造血干细胞移植术后3个月取骨髓样本(骨髓样本_3)、进行造血干细胞移植术后6个月取骨髓样本(骨髓样本_6)、进行造血干细胞移植术后9个月取骨髓样本(骨髓样本-9)。取骨髓样本的方式为无菌条件下穿刺抽取至抗凝管。
[0071]1、制备骨髓单个核细胞
[0072]( I)用PBS缓冲液吹打悬浮骨髓样本，得到细胞悬液。
[0073](2)取I支试管，加入4毫升人淋巴细胞分离液和4毫升步骤(1)得到的细胞悬液，保持界面完整，1500rpm离心15分钟，取骨髓单个核细胞层(即自上而下的第二层)，用PBS缓冲液洗涤两遍(每次洗涤采用1500rpm离心10分钟的方式收集细胞)，对细胞进行计数。
[0074]2、骨髓间充质干细胞集落的培养
[0075]取6孔培养板，按照2 X IO5个细胞/平方厘米的密度接种骨髓单个核细胞，采用含10% (体积比)胎牛血清的低糖DMEM培养基，在37°C、5%C02条件下培养14天(只有骨髓间充质干细胞可以形成集落)，每隔两天全量更换相同的培养基。
[0076]二、骨髓间充质干细胞集落数量的统计
[0077]完成步骤一后，采用结晶紫染料对骨髓间充质干细胞集落进行染色(染色时间为10分钟)，然后用PBS缓冲液洗涤两遍，在显微镜下拍照、计数并进行统计学分析。
[0078]某一急性髓性细胞白血病患者的骨髓间充质干细胞集落的形态见图1 (A对应骨髓样本-O的结果，B对应骨髓样本-6的结果；图中标尺代表5毫米)。其它患者的骨髓样本-O的结果与图1A —致，骨髓样本-6的结果与图1B —致。结果表明，对于15位患者来说，预处理前和移植术后各个时间点的骨髓间充质干细胞的集落形态相似。
[0079]每5X IO6个骨髓单个核细胞进行步骤一的2的培养后，骨髓间充质干细胞集落的数量见图2 (每个点代表一位患者)。骨髓间充质干细胞集落的数量，在造血干细胞移植术后I个月最少，之后缓慢回升，到造血干细胞移植术后9个月时基本恢复(即对于每个患者来说，骨髓样本-6与骨髓样本-O的骨髓间充质干细胞的集落数量没有显著差异)。
[0080]三、骨髓间充质干细胞多向分化能力的鉴定
[0081]参照如下参考文献中的方法进行:Zhu H, Guo ZK, Jiang XX, Li protocol forisolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.NatProtoc.2010;5 (3):550-560。[0082]完成步骤一后，取骨髓间充质干细胞集落，加入成骨分化诱导液(含50 μ M抗坏血酸磷酸盐、0.1 μ M地塞米松、IOmM β-磷酸甘油和10%体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基);在37°C、5%C02条件下培养14天(每隔两天全量更换相同的成骨分化诱导液)，然后利用碱性磷酸酶染色试剂盒鉴定成骨细胞。进行碱性磷酸酶染色后的照片见图3 (对应某一急性髓性白血病患者的骨髓样本_6)，a中标尺代表5毫米，b中标尺代表200微米。其它患者的骨髓样本-6的结果与图3 —致。骨髓间充质干细胞进行成骨诱导后碱性磷酸酶染色为阳性，表明其具有分化为成骨细胞的能力。
[0083]完成步骤一后，取骨髓间充质干细胞集落，加入成脂肪分化诱导液(含I μ M地塞米松、10 μ g/ml胰岛素和10%体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基);在37°C、5%C02条件下培养14天(每隔两天全量更换相同的成脂肪分化诱导液)，然后利用油红O染色鉴定脂肪细胞。进行油红O染色后的照片见图4 (对应某一急性髓性白血病患者的骨髓样本_6)，c中标尺代表5毫米，d中标尺代表200微米。其它患者的骨髓样本-6的结果与图4 一致。骨髓间充质干细胞进行成脂肪诱导后可以分化为富含脂滴的成脂肪细胞，表明其具有分化为成脂肪细胞的能力。
[0084]碱性磷酸酶染色鉴定和油红染色的鉴定结果表明，造血干细胞移植术后的骨髓间充质干细胞具有多向分化的能力。
[0085]四、骨髓间充质干细胞的传代
[0086]完成步骤一后，取骨髓间充质干细胞集落，连续传至第4代。
[0087]五、对比实验
[0088]另外15位知情同意的志愿者(该15位志愿者已进行了造血干细胞移植术后2年的追踪，该次造血干细胞移植术均已失败)，分别为急性淋巴细胞白血病患者8位、急性髓性细胞白血病患者4位、慢性髓性细胞白血病患者3位，依次取骨髓样本并进行上述步骤一和步骤二，对于每个患者来说，骨髓样本-6的骨髓间充质干细胞的集落数量显著低于骨髓样本_0。
[0089]实施例2、骨髓间充质干细胞抑制T淋巴细胞增殖的能力
[0090]1、将人⑶3+T淋巴细胞重悬于含5% (体积比)胎牛血清的PBS缓冲液，得到IO7个细胞/ml的细胞悬液。
[0091]2、取ImL步骤I得到的细胞悬液，加入CFSE并使其浓度为10 μ M，室温孵育25分钟，然后加入IOmL含2% (体积比)胎牛血清的PBS缓冲液以终止反应，1000rpm离心10分钟，收集细胞，用PBS缓冲液洗涤(每次洗涤采用1000rpm离心10分钟的方式收集细胞)。
[0092]3、淋巴母细胞转化试验
[0093]第一组:取6孔板，按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种实施例1中得到的从骨髓样本-O中制备并转至第4代的骨髓间充质干细胞，然后接种步骤2得到的人CD3+T淋巴细胞(使骨髓间充质干细胞与人⑶3+T淋巴细胞的数量比为1:10)，加入PHA并使其浓度为2μ g/ml，在37°C、5%C02条件下培养，分别在培养第2天(图5A)和第4天(图5B)收集人CD3+T淋巴细胞并采用流式细胞仪检测。
[0094]第二组:取6孔板，按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种实施例1中得到的从骨髓样本-6中制备并转至第4代的骨髓间充质干细胞，然后接种步骤2得到的人CD3+T淋巴细胞(使骨髓间充质干细胞与人⑶3+T淋巴细胞的数量比为1:10)，加入PHA并使其浓度为2μ g/ml，在37°C、5%C02条件下培养，分别在培养第2天(图5A)和第4天(图5B)收集人CD3+T淋巴细胞并采用流式细胞仪检测。
[0095]第三组:取6孔板，接种步骤2得到的人⑶3+T淋巴细胞(与步骤一的中的人⑶3+T淋巴细胞等量)，加入PHA并使其浓度为2μ g/ml，在37°C、5%C02条件下培养，分别在培养第2天(图5A)和第4天(图5B)收集人⑶3+T淋巴细胞并采用流式细胞仪检测。
[0096]第四组:取6孔板，接种步骤2得到的人⑶3+T淋巴细胞(与步骤一的中的人⑶3+T淋巴细胞等量)，在37°C、5%C02条件下培养，分别在培养第2天(图5A)和第4天(图5B)收集人CD3+T淋巴细胞并采用流式细胞仪检测。
[0097]4、混合淋巴细胞反应
[0098]第一组:(I)取6孔板，按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种实施例1中得到的从骨髓样本-O中制备并转至第4代的骨髓间充质干细胞，然后接种步骤2得到的人⑶3+T淋巴细胞(使骨髓间充质干细胞与人⑶3+T淋巴细胞的数量比为1:10) ；(2)然后按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种用IOGy剂量的钴-60照射过的⑶3+T淋巴细胞(用钴-60照射的目的是灭活该部分T淋巴细胞的增殖能力，以避免干扰结果；步骤(2)与步骤Cl)中的人⑶3+T淋巴细胞源自不同个体)以刺激步骤(1)中的人⑶3+T淋巴细胞增殖，在37°C、5%C02条件下培养，分别在培养第2天(图5C)和第4天(图5D)收集人⑶3+T淋巴细胞并采用流式细胞仪检测。
[0099]第二组:(I)取6孔板，按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种实施例1中得到的从骨髓样本-6中制备并转至第4代的骨髓间充质干细胞，然后接种步骤2得到的人⑶3+T淋巴细胞(使骨髓间充质干细胞与人⑶3+T淋巴细胞的数量比为1:10) ；(2)然后按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种用IOGy剂量的钴-60照射过的⑶3+T淋巴细胞(用钴-60照射的目的是灭活该部分T淋巴细胞的增殖能力，以避免干扰结果；步骤(2)与步骤Cl)中的人⑶3+T淋巴细胞源自不同个体)以刺激步骤(1)中的人⑶3+T淋巴细胞增殖，在37°C、5%C02条件下培养，分别在培养第2天(图5C)和第4天(图5D)收集人⑶3+T淋巴细胞并采用流式细胞仪检测。
[0100]第三组:(I)取6孔板，接种步骤2得到的人⑶3+T淋巴细胞(与步骤一的中的人⑶3+T淋巴细胞等量)；(2)然后按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种用IOGy剂量的钴-60照射过的CD3+T淋巴细胞(用钴-60照射的目的是灭活该部分T淋巴细胞的增殖能力，以避免干扰结果；步骤(2)与步骤(1)中的人CD3+T淋巴细胞源自不同个体)以刺激步骤Cl)中的人⑶3+T淋巴细胞增殖，在37°C、5%C02条件下培养，分别在培养第2天(图5C)和第4天(图5D)收集人CD3+T淋巴细胞并采用流式细胞仪检测。
[0101]第四组:取6孔板，接种步骤2得到的人⑶3+T淋巴细胞(与步骤一的中的人⑶3+T淋巴细胞等量)，在37°C、5%C02条件下培养，分别在培养第2天(图5A)和第4天(图5B)收集人CD3+T淋巴细胞并采用流式细胞仪检测。
[0102]结果见图5 (对应某一急性髓性白血病患者)。其它患者的结果与图5—致。结果表明，PHA或同种异体T淋巴细胞能刺激的T淋巴细胞增殖，而造血干细胞移植术后获得的骨髓间充质干细胞能够抑制PHA或同种异体T淋巴细胞刺激的T淋巴细胞增殖。
[0103]实施例3、骨髓间充质干细胞促进造血干细胞增殖的能力
[0104]取6孔板，按照I X IO5个细胞/平方厘米的密度接种实施例1中得到的从骨髓样本-O或骨髓样本-6中制备并转至第4代的骨髓间充质干细胞，然后接种人CD34+造血干细胞(使骨髓间充质干细胞与人⑶34+造血干细胞的数量比为5:1)，在37°C、5%C02条件下共培养7周(采用含10%体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基，每周半量更换相同的培养基)；培养7周的过程中，每周吸出的悬浮细胞(造血干细胞具有悬浮的特性)，接种于96孔培养板，采用造血干细胞集落专用培养基，在37°C、5%C02条件下培养5天，然后在显微镜下对造血干细胞集落拍照，计数并进行统计学分析。[0105]照片见图6 (对应某一急性髓性白血病患者；A对应骨髓样本-O的结果，B对应骨髓样本-6的结果)。共培养7周的过程中，每周取悬浮细胞培养后统计造血干细胞集落的数量的结果见图7 (15位患者的平均值)。造血干细胞移植术后获得的骨髓间充质干细胞能够作为饲养细胞促进造血干细胞增殖并形成形态正常的集落，即该骨髓充质干细胞具有正常造血支持能力。
【权利要求】
1.一种鉴定造血干细胞移植术效果的试剂盒，包括组件A、组件B、组件C、组件D、组件E、组件F、组件G和组件H ;所述组件A为用于制备骨髓单个核细胞的物质；所述组件B为用于培养骨髓间充质干细胞形成集落的物质；所述组件C为用于对骨髓间充质干细胞集落进行计数的物质；所述组件D为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成骨细胞的能力的物质；所述组件E为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有分化成成脂肪细胞的能力的物质；所述组件F为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有抑制T淋巴细胞增殖的能力的物质；所述组件G为用于鉴定骨髓间充质干细胞是否具有作为造血干细胞的饲养细胞的能力的物质； 所述组件H为记载有如下判断标准的载体:如果满足如下(I)至(5)，造血干细胞移植术后骨髓微环境重建成功: (O患者进行造血干细胞移植术后9个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞数量与该患者进行造血干细胞移植术的预处理前的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞数量没有显著差异; (2)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有分化成成骨细胞的能力； (3)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有分化成成脂肪细胞的能力； (4)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有抑制T淋巴细胞增 殖的能力； (5)患者进行造血干细胞移植术后6个月的骨髓样本中的骨髓间充质干细胞具有作为造血干细胞的饲养细胞的能力。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述组件A为人淋巴细胞分离液或所述组件A包括人淋巴细胞分离液。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述组件B为含5-20%体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基或所述组件B包括含5-20%体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基。
4.如权利要求1至3中任一所述的试剂盒，其特征在于:所述组件C为结晶紫或所述组件C包括结晶紫。
5.如权利要求1至4中任一所述的试剂盒，其特征在于:所述组件D包括成骨分化诱导液和碱性磷酸酶染色试剂。
6.如权利要求1至5中任一所述的试剂盒，其特征在于:所述组件E包括成脂肪分化诱导液和油红O。
7.如权利要求1至6中任一所述的试剂盒，其特征在于:所述组件F包括离体的人CD3+T淋巴细胞和CFSE。
8.如权利要求1至7中任一所述的试剂盒，其特征在于:所述组件G包括离体的人⑶34+造血干细胞、含5-20% (具体可为10% )体积份胎牛血清的低糖DMEM培养基和造血干细胞集落专用培养基。
9.如权利要求1至8中任一所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括PBS缓冲液。所述PBS缓冲液具体可为pH7.4、IM的PBS缓冲液组成。
【文档编号】C12Q1/02GK103540642SQ201310479003
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】王恒湘, 丁丽, 郭子宽, 朱恒 申请人:中国人民解放军空军总医院