一种高生物利用度蓝莓花青素的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种高生物利用度蓝莓花青素的制备方法。该方法包括以下操作步骤：蓝莓花青素溶液的准备，蓝莓花青素的糖苷酶催化转化，蓝莓花青素转化产物的膜分离，透过液中蓝莓花青素的分离，高生物利用度蓝莓花青素的干燥与保存。有益技术效果是：（1）采用集反应与分离于一体的膜反应器进行酶催化反应，既提高了酶的使用效率，降低了生产成本，又可以将反应产物连续地排出，降低甚至消除反应产物对酶的抑制作用、提高了催化反应的速度；（2）集成膜反应系统、反渗透系统、萃取系统制备高生物利用度的蓝莓花青素，适用于工业化；（3）本发明制得的高生物利用度蓝莓花青素生物利用度高于60%，具有更高的医疗保健价值和更宽的实际应用领域。
【专利说明】一种高生物利用度蓝莓花青素的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品功能成分的精深加工领域，具体涉及一种高生物利用度蓝莓花青素的制备方法。
【背景技术】
[0002]蓝莓花青素是从蓝莓(也叫越橘)果中提取获得的以2-苯基苯并吡喃为母核的类黄酮化合物，它由飞燕草色素、矢车菊色素、芍药色素、锦葵色素、牵牛花青素共5种花青素苷元，以及各花青素苷元与葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、乙酰葡萄糖、乙酰半乳糖、乙酰阿拉伯糖连接形成的花青素糖苷组成。蓝莓花青素的抗氧化活性是\的20倍、Ve的50倍，具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗心血管疾病以及促进视红素再合成、保护视力等生理功能。为此，蓝莓花青素倍受消费者的青睐。研究证明，花青素苷元是蓝莓花青素发挥生理功能的活性形式，它们是活性花青素；但活性花青素含量很低，不足蓝莓花青素总量的10%，蓝莓花青素主要是以花青素糖苷的形式存在，并且，现有的提取技术只能得到花青素糖苷；这些花青素糖苷需要经过人体肠道微生物产生的糖苷酶水解成花青素苷元后才能在体内发挥活性作用。尽管蓝莓花青素对人体的健康功效受到高度关注，但由于活性花青素在蓝莓花青素中所占比例少，分离纯化难度大、成本高，所以，当前蓝莓花青素产品仍是以从蓝莓果中提取生产的花青素糖苷含量为5-40%的粗提物为主，加工水平初级，产品附加值不高，因为主要是糖苷形式，常因人群个体差异保健效果不明显，生物利用度低，严重限制了蓝莓花青素在医药、化妆品和保健品等领域的开发应用。
[0003]由于人体肠道微生物产生的糖苷酶的数量和活力有限，因此，在体外把蓝莓花青素糖苷转化为蓝莓花青素苷元将是提高蓝莓花青素生物利用度的有效途径。当前，花青素糖苷转化为花青素苷元的方法主要有酸水解法和酶水解法两种。酸水解法要求温度高，水解反应缺乏专一性，除水解糖 苷键外也能破坏母核上的其它基团，造成蓝莓花青素活性的降低甚至消失，并且酸水解会对环境产生污染，应用效果并不理想。酶水解法是通过特异性糖苷酶控制性水解花青素糖苷的糖苷键而生成活性花青素苷元，具有糖苷键专一性、可控性强、活性苷元结构稳定、效率高等优势。可见，应用酶水解法催化蓝莓花青素糖苷转化为蓝莓花青素苷元，将是提高蓝莓花青素的生物利用度的理想方法。
[0004]超滤以超滤膜为过滤介质、以膜两侧的压力差为驱动力，使原液流过超滤膜表面时，体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液；体积小于膜表面微孔径的物质则被透过膜微孔，成为透过液；从而实现对原液的分离和浓缩等目的。反渗透是以半透膜为过滤介质、以膜两侧的压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，可以达到分离、提取、纯化和浓缩的目的。近年来，超滤、反渗透均已进入工业应用，具有耗能低、无污染、工艺简单、操作简便等优点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是要提供一种生物利用度高的蓝莓花青素的制备方法。[0006]本发明首先通过糖苷酶将蓝莓花青素糖苷催化转化为蓝莓花青素苷元，再通过超滤膜将糖苷酶与转化产物分离，然后根据蓝莓花青素溶于乙醇而糖不溶于乙醇的原理，通过乙醇萃取获得转化产物中的蓝莓花青素苷元，最后通过冷冻干燥获得高生物利用度低的蓝莓花青素。目前尚未见相关技术报道。
[0007]一种高生物利用度的蓝莓花青素的具体制备操作步骤如下:
(1)蓝莓花青素溶液的准备；取蓝莓花青素提取物溶解于pH值为3-5的缓冲溶液中，配制成每100 ml缓冲溶液中含10-50g蓝莓花青素提取物的蓝莓花青素溶液；
(2)蓝莓花青素的糖苷酶催化转化；取步骤(1)制备的蓝莓花青素溶液放入酶反应器中，按蓝莓花青素溶液:糖苷酶为100 ml: l_5g的比例加入糖苷酶，进行酶的催化转化反应，获得蓝莓花青素转化液；
(3)蓝莓花青素转化产物的膜分离；取步骤(2)制备的蓝莓花青素转化液，使其通过截留分子量为3000-5000 Da的超滤膜，在温度不高于40°C、流速不低于10 ml/min、操作压力
0.5-1.0MPa的条件下超滤分离，截留液返回酶反应器中，收集透过液；
(4)透过液中蓝莓花青素的分离；取步骤(3)制备的透过液，使其通过反渗透膜系统，在温度不高于40 °C、操作压力1.0-2.0MPa的条件下进行反渗透浓缩；反渗透的透过液可以用于缓冲溶液的配制，收集反渗透的截留液；将反渗透的截留液在温度40-50 °C、真空度0.09-0.1MPa的条件下减压浓缩至膏状，收集膏状物；取膏状物，按膏状物:无水乙醇=Iml: 30-50ml的比例加入无水乙醇，均匀搅拌3_5分钟，然后在转速5000-10000转/分钟、温度4-10 °C的条件下离心10-15分钟，收集离心上清液，即得到高生物利用度的蓝莓花青素乙醇溶液；
(5)高生物利用度蓝莓花青素的干燥与保存:取步骤(4)制备的高生物利用度的蓝莓花青素乙醇溶液，在温度30-40 °C、真空度0.09-0.1MPa的条件下减压浓缩，得到乙醇和膏状的高生物利用度蓝莓花青素；乙`醇可重复使用，膏状的高生物利用度蓝莓花青素通过冷冻干燥，即得到高生物利用度的蓝莓花青素粉末；高生物利用度的蓝莓花青素粉末中总花青素含量3 50%、花青素苷元占花青素总量的30%以上、生物利用度大于60%。
[0008]步骤(1)中所述的蓝莓花青素提取物为深紫色粉末或膏状，微溶于水，总花青素含量3 20%，花青素糖苷占总花青素含量的95%以上。
[0009]步骤(1)中所述缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。
[0010]步骤(2)中所述糖苷酶为活力不低于100 U/mg的糖苷酶，即β -葡萄糖苷酶或α-阿拉伯糖苷酶或β-半乳糖苷酶的一种或几种的混合物。
[0011]所述几种的混合物为β -葡萄糖苷酶、α -阿拉伯糖苷酶和β -半乳糖苷酶的混合物，且三者的质量比为2:1:1。
[0012]步骤(2)中所述的酶催化转化反应的条件为反应温度30_40°C，搅拌转速50-100转/分钟，反应时间为2-5小时、避光。
[0013]与现有技术相比，本发明方法具有如下优点:(1)本发明采用膜反应器进行蓝莓花青素的酶催化反应，集反应与分离于一体，酶可以回收循环使用，提高了酶的使用效率，降低了生产成本，同时，反应产物可以连续地排出，降低甚至消除了产物对酶的抑制作用、提高了催化反应的速度，缩短了生产周期；(2)本发明集成膜反应系统、反渗透系统、萃取系统制备高生物利用度的蓝莓花青素，适用于工业化；(3)本发明生产出的高生物利用度蓝莓花青素中总花青素含量3 50%、花青素苷元占花青素总量的30%以上、生物利用度高于60%，具有更高的医疗保健价值和更宽的实际应用领域。
[0014]生物利用度(bioavailability, F)是指蓝莓花青素被机体吸收进入体循环的相对量，用F表示，F= (D/A) X 100%。A为静脉注射蓝莓花青素进入体循环所能达到的浓度，D为口服相同蓝莓花青素剂量后体循环所能达到的浓度。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
[0016]以下实施例所用原料的来源说明如下:
蓝莓花青素提取物的生产单位为宝鸡市普兰特生物工程有限公司，为深紫色粉末，微溶于水，总花青素含量3 25%，花青素糖苷占总花青素含量的95%以上；
醋酸、醋酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠为国产分析纯，醋酸和柠檬酸钠的生产厂家均为天津市博迪化工有限公司，柠檬酸和醋酸钠的生产厂家均为西陇化工股份有限公司，醋酸-醋酸钠缓冲溶液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的配制参考高俊凤编写的《植物生理学实验指导书》第178页配制而成。无水乙醇生产厂家为上海永铭化工有限公司。葡萄糖苷酶和半乳糖苷酶均购于天津希恩思生化科技有限公司，α-阿拉伯糖苷酶的生产单位为西化仪(北京)科技有限公司。
[0017]实施例1:
一种高生物利用度的蓝莓 花青素的具体制备操作步骤如下:
(I)蓝莓花青素溶液的准备；取市售的蓝莓花青素提取物，溶解于PH值为5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成每100 ml缓冲溶液中含30g蓝莓花青素提取物的蓝莓花青素溶液；
(2 )蓝莓花青素的糖苷酶催化转化；取蓝莓花青素溶液放入酶反应器中，按蓝莓花青素溶液:糖苷酶=100 ml:1g的比例加入活力为500 U/mg的β -葡萄糖苷酶，在温度为40°C、搅拌转速为50转/分钟、避光的条件下进行酶催化转化反应5小时，获得蓝莓花青素转化液；
(3)蓝莓花青素转化产物的膜分离；取蓝莓花青素转化液，使其通过截留分子量为4000Da的超滤膜，在温度40°C、流速30 ml/min、操作压力0.5MPa的条件下超滤分离，截留液返回酶反应器中，收集透过液；
(4)透过液中蓝莓花青素的分离；取透过液，使其通过反渗透膜系统，在温度35°C、操作压力1.0MPa的条件下进行反渗透浓缩；反渗透的透过液可以用于缓冲溶液的配制，收集反渗透的截留液；将反渗透的截留液在温度45°C、真空度0.09-0.1Mpa的条件下减压浓缩至膏状，收集膏状物；取膏状物，按膏状物:无水乙醇=1 ml: 30 ml的比例加入无水乙醇，均匀搅拌5分钟，然后在转速5000转/分钟、温度10°C的条件下离心15分钟，收集离心上清液，即得到高生物利用度的蓝莓花青素乙醇溶液；
(5)高生物利用度蓝莓花青素的干燥与保存:取高生物利用度的蓝莓花青素乙醇溶液，在温度35°C、真空度0.09-0.1MPa的条件下减压浓缩，得到乙醇和膏状的高生物利用度蓝莓花青素；乙醇可重复使用，膏状的高生物利用度蓝莓花青素通过冷冻干燥，即得到总花青素含量为60.50%、花青素苷元占花青素总量的41.60%、生物利用度为70.8%的蓝莓花青素粉末，密封、避光、4°C保存。
[0018]实施例2:
一种高生物利用度的蓝莓花青素的具体制备操作步骤如下:
(1)蓝莓花青素溶液的准备；取蓝莓花青素提取物溶解于pH值为3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，配制成每100 ml缓冲溶液中含50g蓝莓花青素提取物的蓝莓花青素溶液；
(2)蓝莓花青素的糖苷酶催化转化；取蓝莓花青素溶液放入酶反应器中，按蓝莓花青素溶液:糖苷酶=100 ml:5g的比例加入活力分别为100 U/mg和150 U/mg的α -阿拉伯糖苷酶和β -半乳糖苷酶，在温度为35°C、搅拌转速为80转/分钟、避光的条件下进行酶催化转化反应3小时，获得蓝莓花青素转化液；
(3)蓝莓花青素转化产物的膜分离；取蓝莓花青素转化液，使其通过截留分子量为5000Da的超滤膜，在温度30°C、流速10 ml/min、操作压力0.SMPa的条件下超滤分离，截留液返回酶反应器中，收集透过液； (4)透过液中蓝莓花青素的分离；取透过液，使其通过反渗透膜系统，在温度不高于30°C、操作压力1.5MPa的条件下进行反渗透浓缩；反渗透的透过液可以用于缓冲溶液的配制，收集反渗透的截留液；将反渗透的截留液在温度40°C、真空度0.09-0.1Mpa的条件下减压浓缩至膏状，收集膏状物；取膏状物，按膏状物:无水乙醇=1 ml: 50 ml的比例加入无水乙醇，均匀搅拌3分钟，然后在转速10000转/分钟、温度4°C的条件下离心10分钟，收集离心上清液，即得到高生物利用度的蓝莓花青素乙醇溶液；
(5)高生物利用度蓝莓花青素的干燥与保存:取高生物利用度的蓝莓花青素乙醇溶液，在温度30°C、真空度0.09-0.1MPa的条件下减压浓缩，得到乙醇和膏状的高生物利用度蓝莓花青素；乙醇可重复使用，膏状的高生物利用度蓝莓花青素通过冷冻干燥，即得到总花青素含量为55.89%、花青素苷元占花青素总量的33.74%、生物利用度为63.8%的蓝莓花青素粉末，密封、避光保存于冰箱冷藏室。
[0019]实施例3:
一种高生物利用度的蓝莓花青素的具体制备操作步骤如下:
(1)蓝莓花青素溶液的准备；取蓝莓花青素提取物溶解于pH值为4.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，配制成每100 ml缓冲溶液中含IOg蓝莓花青素提取物的蓝莓花青素溶液；
(2)蓝莓花青素的糖苷酶催化转化；取蓝莓花青素溶液放入酶反应器中，按蓝莓花青素溶液:糖苷酶=100 ml:3g的比例加入活力100 U/mg的β-葡萄糖苷酶、活力200 U/mga-阿拉伯糖苷酶、活力200 U/mg的β -半乳糖苷酶，在温度为30°C、搅拌转速为100转/分钟、避光的条件下进行酶催化转化反应2小时，获得蓝莓花青素转化液；其中β -葡萄糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶和β-半乳糖苷酶的加入量的比例为2:1:1;
(3)蓝莓花青素转化产物的膜分离；取蓝莓花青素转化液，使其通过截留分子量为3000Da的超滤膜，在温度20°C、流速50 ml/min、操作压力1.0MPa的条件下超滤分离，截留液返回酶反应器中，收集透过液；
(4)透过液中蓝莓花青素的分离；取透过液，使其通过反渗透膜系统，在温度20°C、操作压力2.0MPa的条件下进行反渗透浓缩；反渗透的透过液可以用于缓冲溶液的配制，收集反渗透的截留液；将反渗透的截留液在温度50°C、真空度0.09-0.1Mpa的条件下减压浓缩至膏状，收集膏状物；取膏状物，按膏状物:乙醇=1 ml:40 ml的比例加入无水乙醇，均匀搅拌4分钟，然后在转速8000转/分钟、温度6°C的条件下离心12分钟，收集离心上清液，即得到高生物利用度的蓝莓花青素乙醇溶液；
(5)高生物利用度蓝莓花青素的干燥与保存:取高生物利用度的蓝莓花青素乙醇溶液，在温度40 °C、真空度0.09-0.1MPa的条件下减压浓缩，得到乙醇和膏状的高生物利用度蓝莓花青素；乙醇可重复使用，膏状的高生物利用度蓝莓花青素通过冷冻干燥，即得到总花青素含量69.13%、花青素苷元占花青素总量的50.67%、生物利用度为81.7%的蓝莓花青素粉末，密封、避光保存于冰箱`冷冻室。
【权利要求】
1.一种高生物利用度蓝莓花青素的制备方法，其特征在于包括如下操作步骤: (1)蓝莓花青素溶液的准备；取蓝莓花青素提取物溶解于PH值为3-5的缓冲溶液中，配制成每100 ml缓冲溶液中含10-50g蓝莓花青素提取物的蓝莓花青素溶液； (2)蓝莓花青素的糖苷酶催化转化；取步骤(1)制备的蓝莓花青素溶液放入酶反应器中，按蓝莓花青素溶液:糖苷酶为100 ml: l_5g的比例加入糖苷酶，进行酶的催化转化反应，获得蓝莓花青素转化液； (3)蓝莓花青素转化产物的膜分离；取步骤(2)制备的蓝莓花青素转化液，使其通过截留分子量为3000-5000 Da的超滤膜，在温度不高于40°C、流速不低于10 ml/min、操作压力0.5-1.0 MPa的条件下超滤分离，截留液中主要成分为糖苷酶，返回酶反应器中重复使用，收集透过液； (4)透过液中蓝莓花青素的分离；取步骤(3)制备的透过液，使其通过反渗透膜系统，在温度不高于40 °C、操作压力1.0-2.0 MPa的条件下进行反渗透浓缩；反渗透的透过液可以用于缓冲溶液的配制，收集反渗透的截留液；将反渗透的截留液在温度40-50 °C、真空度0.09-0.1 MPa的条件下减压浓缩至膏状，收集膏状物；取膏状物，按膏状物:无水乙醇=Iml: 30-50ml的比例加入无水乙醇，均匀搅拌3_5分钟，然后在转速5000-10000转/分钟、温度4-10 °C的条件下离心10-15分钟，收集离心上清液，即得到高生物利用度的蓝莓花青素乙醇溶液； (5)高生物利用度蓝莓花青素的干燥与保存:取步骤(4)制备的高生物利用度的蓝莓花青素乙醇溶液，在温度30-40 °C、真空度0.09-0.1 MPa的条件下减压浓缩，得到乙醇和膏状的高生物利用度蓝莓花青素；乙醇可重复使用，膏状的高生物利用度蓝莓花青素通过冷冻干燥，即得到高生物利用度的蓝莓花青素粉末；高生物利用度的蓝莓花青素粉末中总花青素含量3 50%、花青素苷元占花青素总量的30%以上、生物利用度大于60%。
2.根据权利要求1所述的一种高生物利用度蓝莓花青素的制备方法，其特征在于:步骤(I)中所述的蓝莓花青素提取物为深紫色粉末或膏状，微溶于水，总花青素含量3 20%,花青素糖苷占总花青素含量的95%以上。
3.根据权利要求1所述的一种高生物利用度蓝莓花青素的制备方法，其特征在于:步骤(I)中所述缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述的一种高生物利用度蓝莓花青素的制备方法，其特征在于:步骤(2)中所述糖苷酶为活力不低于100 U/mg的糖苷酶，即葡萄糖苷酶或α-阿拉伯糖苷酶或β_半乳糖苷酶的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求4所述的一种高生物利用度蓝莓花青素的制备方法，其特征在于:所述几种的混合物为葡萄糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶和半乳糖苷酶的混合物，且三者的质量比为2:1:1。
6.根据权利要求1所述的一种高生物利用度蓝莓花青素的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的酶催化转化反应的条件为反应温度30-40°C，搅拌转速50-100转/分钟，反应时间为2-5小时，避光。
【文档编号】C12P17/06GK103509834SQ201310483928
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月16日 优先权日:2013年10月16日
【发明者】潘利华, 贺元康, 罗建平, 樊基圣 申请人:合肥工业大学