两株低温泡菜乳酸菌的增殖培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种低温泡菜乳酸菌10℃条件下的增殖培养基，属于生物【技术领域】。适宜植物乳杆菌的增殖培养基：蛋白胨0.5%～1.5%，牛肉膏0.1%～1.0%，乳糖0.5%～1.5%，葡萄糖1.0%～2.0%，磷酸氢二钾0.2%，白菜汁补足1000mL，调pH至7.2，121℃灭菌15min；适宜肠膜明串珠菌的增殖培养基：蛋白胨1.0%～2.0%，牛肉膏0.5%～1.5%，乳糖0.1%～1.0%，葡萄糖1.0%～2.0%，磷酸氢二钾0.2%，白菜汁补足1000mL，调pH至7.2，121℃灭菌15min；采用该培养基，活菌数分别可达6.05×109cfu/mL和7.35×109cfu/mL，较白菜汁基础培养基提高了6.1倍和10.4倍，而与采用MRS培养基相比，活菌数相近，且节约成本。
【专利说明】两株低温泡菜乳酸菌的增殖培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种低温泡菜乳酸菌增殖的改良白菜汁培养基，属于生物【技术领域】。【背景技术】
[0002]乳酸菌作为一类化能异养菌，蛋白质分解和氨基酸合成能力较弱，只能通过糖类发酵获取能量，对培养基的营养要求比较苛刻，所以需向其生长的环境提供适量的营养物质，如碳源、氮源等。
[0003]实验室培养乳酸菌常用的MRS培养基不仅成分复杂、成本高、制作繁琐，而且接种乳酸菌培养后的发酵液黏度以及蛋白沉淀又不利于菌体的分离收集，而泡菜乳酸菌的培养可采用廉价易得的白菜汁、胡萝卜汁等。由于不同乳酸菌生长条件存在一定差异，因此筛选出不同种类乳酸菌的最适增殖培养基具有重要意义。
[0004]目前为止较多研究的是常温下分离的乳酸菌，所以泡菜工业化生产使用的菌剂也多为中温型乳酸菌制备的，然而四川泡菜生产上蔬菜的收获和盐溃发酵也多集中在冬季，气温偏低，常温乳酸菌对泡菜的发酵速度过慢或停止，因而酸度低，杂菌抑制能力弱，为保证腌溃蔬菜不变质，必须增加食盐用量，导致在成品泡菜生产中增加脱盐工艺和废水处理成本，甚至还需要添加有机酸以符合泡菜酸度的要求，不但影响了泡菜品质还制约着泡菜的工业化生产,耐低温乳酸菌的应用可以 解决这一生产问题。
[0005]迄今为止，对于低温乳酸菌的研究报道较少，杨晓辉等研究了 30°C条件下，分离自泡菜的4株低温发酵乳酸菌Lat.ULat.2、Leu.1和leu.2在不同蔬菜汁培养基中的增殖情况；田菊梅等研究了 2株低温乳酸菌CGMCC4775和CGMCC4776在20-30°C条件下，混菌培养的增殖情况；然而对于低温(10°C)条件下，低温泡菜酸菌加富培养的研究尚未见报道。
[0006]本专利是以两株源于四川泡菜的优良耐低温泡菜乳酸菌3m_l {Lactobacillusplan tarum) (GenBank 注册号:KC292491)矛口 8m_9(Z<9Wco/?o5^oc mesen teroides ) (GenBank注册号:KC292492)为对象，10°C条件下，通过在白菜汁培养基中添加碳源、氮源及缓冲剂优化了其最适的增殖培养基配方，与MRS培养基相比，节约了成本，以白菜汁为基础培养基更接近泡菜乳酸菌发酵的蔬菜环境，为低温乳酸菌发酵菌剂的制备和低温发酵泡菜的应用奠定了基础。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种既能节约成本、提高低温泡菜乳酸菌活菌数，又利于菌体收集且还为泡菜低温发酵提供驯化环境的培养基。
[0008]本发明提供了一种低温泡菜乳酸菌10°C条件下的增殖培养基，适宜于植物乳杆菌的增殖培养基为:蛋白胨0.5%~1.5%，牛肉膏0.1%~1.0%，乳糖0.5%~1.5%，葡萄糖
1.0%~2.0%，磷酸氢二钾0.2%，白菜汁(选取清洗、浙干的新鲜白菜打浆过100目纱布得到菜汁)补足1000mL,调pH至7.2，121 °C灭菌15min ;适宜于肠膜明串珠菌的增殖培养基为:蛋白胨1.0%~2.0%，牛肉膏0.5%~1.5%，乳糖0.1%~1.0%，葡萄糖1.0%~2.0%，磷酸氢二钾 0.2%,白菜汁补足 1000mL, il pH 至 7.2，121°C灭菌 15min。
[0009]本发明的具体发明过程如下。
[0010]I)将两次活化的低温乳酸菌接种于白菜汁基础培养基中，10°C培养192h，每12h取样，测定发酵液活菌数、0D600/10和pH，绘制生长曲线，确定菌株的最佳收获期为72h。
[0011]2)选择合适的碳源、氮源、缓冲剂及浓度，配制成各种不同的增殖培养基，10°C培养72h，并测定培养前后发酵液的活菌数和pH，同时与白菜汁基础培养基和MRS培养基进行比较，确定最佳增殖因子为蛋白胨、牛肉膏、乳糖、葡萄糖和磷酸氢二钾。
[0012]3)选择步骤2)确定的最佳增殖因子，通过正交试验设计配制培养基，10°C培养72h,并测定培养前后发酵液的活菌数和pH，确定低温乳酸菌的最优培养基配方，其中适宜于植物乳杆菌的增殖培养基为:蛋白胨0.5%~1.5%，牛肉膏0.1%~1.0%，乳糖0.5%~
1.5%，葡萄糖1.0%~2.0%，磷酸氢二钾0.2%，白菜汁(选取清洗、浙干的新鲜白菜打浆过100目纱布得到菜汁)补足1000mL,调pH至7.2，121°C灭菌15min ;适宜于肠膜明串珠菌的增殖培养基为:蛋白胨1.0%~2.0%，牛肉膏0.5%~1.5%，乳糖0.1%~1.0%，葡萄糖1.0%~
2.0%，磷酸氢二钾 0.2%,白菜汁补足 1000mL, il pH 至 7.2，121°C灭菌 15min。
[0013]4)上述步骤中活菌数测定采用平板菌落计数法；0D600/10采用无菌生理盐水将培养液稀释10倍，在600nm下测定其吸光度值；pH采用精密pH计直接测定。
[0014]本发明所用的培养基为:MRS培养基:蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，酵母粉0.5%，葡萄糖2.0%，吐温80 0.1%，磷酸氢二钾0.2%，醋酸钠0.5%，硫酸镁0.058%,硫酸锰0.025%,蒸馏水补足1000mL,调pH至6.2-6.4，121°C灭菌15min ;白菜汁基础培养基:选取清洗、浙干的新鲜白菜打浆过100目纱布得·到菜汁至1000mL (不加蒸馏水)，调pH至7.2，121°C，灭菌15min。此两种固体培养基在液体培养基中再加20g/L琼脂。
[0015]本发明低温泡菜乳酸菌的增殖培养基选用了廉价易得的白菜为原料，成分简单、操作方便，该培养基不仅能提高低温乳酸菌的活菌数，而且与采用MRS培养基培养相比，其活菌数相近，且离心收集得率明显要高。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为10°C条件下植物乳杆菌在白菜汁基础培养基中的生长曲线。
[0017]图2为10°C条件下肠膜明串珠菌在白菜汁基础培养基中的生长曲线。
[0018]图3为在白菜汁基础培养基中添加不同营养因子对低温乳酸菌生长的影响。
[0019]图4为正交试验培养基成分表。
[0020]图5为植物乳杆菌的培养基优化的四因素三水平正交试验表。
[0021]图6为肠膜明串珠菌的培养基优化的四因素三水平正交试验表。
【具体实施方式】
[0022]实例1:一种适宜于植物乳杆菌3m_l的改良白菜汁培养基:蛋白胨0.5%~1.5%,牛肉膏0.1%~1.0%,乳糖0.5%~1.5%,葡萄糖1.0%~2.0%,磷酸氢二钾0.2%,白菜汁补足 1000mL, il pH7.2，121°C灭菌 15min。
[0023]将两次活化的植物乳杆菌3m_l分别接种于白菜汁基础培养基、MRS培养基以及优化的改良白菜汁培养基中，10°C培养72h，测定发酵液培养前后的活菌数，并将其在6000rpm条件下离心IOmin,测定沉降细胞活菌数。
[0024]由结果可知植物乳杆菌3m_l在上述培养基中初始活菌数分别为1.21 X IO7Cfu/mL、l.22X 107cfu/mL 和 1.19 X 107cfu/mL,经过 72h 培养，活菌数分别为 9.90 X 108cfu/mL、6.07X 109cfu/mL和6.05X 109cfu/mL,与采用白菜汁基础培养基培养相比，提高了 6.1倍，与采用MRS培养基培养的活菌数相近无差异，然而离心后其收集细胞得率达到96.20%,明显高于采用MRS培养基培养的收集细胞得率(80.44%)，且配制1000mL上述改良白菜汁培养基需花费9元，而自行配制1000mL MRS培养基需花费13元，商品化的合成MRS培养基每1000 mL需要40元。
[0025]实例2:—种适宜于肠膜明串珠菌8m_9增殖的培养基:蛋白胨1.0%~2.0%，牛肉膏0.5%~1.5%%,乳糖0.1%~1.0%,葡萄糖1.0%~2.0%,磷酸氢二钾0.2%,白菜汁补足1000mL,调 pH 至 7.2，121°C灭菌 15min。
[0026]将两次活化的肠膜明串珠菌8m_9分别接种于白菜汁基础培养基、MRS培养基以及优化的白菜汁培养基中，10°C培养72h，测定发酵液培养前后的活菌数，并将其在6000rpm条件下离心lOmin，测定沉降细胞活菌数。
[0027]由结果可知肠膜明串珠菌8m_9在上述培养基中初始活菌数分别为1.21 X IO7Cfu/mL、l.23X 107cfu/mL 和 1.19 X 107cfu/mL,经过 72h 培养，活菌数分别为 7.05 X 108cfu/mL、
6.47 X 109cfu/mL和7.47 X 109cfu/mL，与采用白菜汁基础培养基培养相比，提高了 10.4倍，与采用MRS培养基培养的活菌数相近无差异，然而离心后其收集细胞得率达到97.32%，明显高于采用MRS培养基培养的收集细胞得率(85.42%)，且配制1000mL上述改良白菜汁培养基需花费10元，而自行配 制1000mL MRS培养基需花费13元，商品化的合成MRS培养基每1000 mL需要40元。
[0028]以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。
【权利要求】
1.一种低温泡菜乳酸菌的增殖培养基，适宜于植物乳杆菌(耐低温菌)的增殖培养基为:蛋白胨0.5%~1.5%，牛肉膏0.1%~1.0%，乳糖0.5%~1.5%，葡萄糖1.0%~2.0%，磷酸氢二钾0.2%，白菜汁(选取清洗、浙干的新鲜白菜打浆过100目纱布得到菜汁)补足1000mL,调pH至7.2，121°C灭菌15min;适宜于肠膜明串珠菌(耐低温菌)的增殖培养基为:蛋白胨1.0%~2.0%,牛肉膏0.5%~1.5%,乳糖0.1%~1.0%,葡萄糖1.0%~2.0%,磷酸氢二钾0.2%,白菜汁补足 1000mL, il pH 至 7.2，121°C灭菌 15min。
2.根据权利要 求1所述的培养基，其特征在于培养温度为10°C。
【文档编号】C12R1/25GK103589664SQ201310495192
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】不公告发明人 申请人:四川农业大学