乳腺癌相关基因的捕获及其探针的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】一种乳腺癌相关基因的捕获方法，其以依据乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建方法获得探针对待测样本中含有待捕获的靶标基因组区域DNA模板杂交。捕获得到的片段经高通量测序后，再基于乳腺癌致病基因的已知信息，利用生物信息学方法进行数据分析，从而获得待测样本中核酸序列的遗传变异情况。本发明提供的各种方法及其获得文库（或克隆库），因可以调整相对捕获效率从而确保了在所有靶标基因上的一致性捕获，解决了目前文献报道的芯片捕获中的不均一性和高成本而极大阻碍了NGS测序平台的使用效率。
【专利说明】乳腺癌相关基因的捕获及其探针的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测与癌症相关的核苷酸组合物，具体涉及一种基于捕获探针集(特异杂交靶基因片段)制备的方法而实现从生物样品中选择性捕获和扩增特定的外显子或靶标基因组区域。
【背景技术】 [0002]乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子作用下，发生了基因突变，致使细胞增生失控之后发生的。据统计，美国2010年确诊的乳腺癌新发病例有209060例，死于乳腺癌的患者有40230例。
[0003]据统计，近年来，在乳腺癌发病率持续上升的同时，欧美等发达国家的乳腺癌死亡率却呈下降趋势。广泛开展的乳腺癌普查与不断提高的早期发现率被认为是其死亡率下降的主要原因。近十几年来我国乳腺癌发病率逐年上升，乳腺癌已居女性恶性肿瘤的首位，是仅次于肺癌的第二位癌症死亡原因，而且发病年龄趋于年轻，已严重威胁我国妇女的健康。在美国，新发乳腺癌病例中80%以上是早期。而在我国超过半数的患者在发现时已经是晚期。乳腺的原位癌是几乎可以100%治愈的，I期乳腺癌5生存率是97%.1I期乳腺癌是75.9%，III期仅为45%。显而易见，乳腺癌的早期诊断是提高乳腺癌患者生存率和生存质量、提高乳腺癌治愈率、降低死亡率的关键，基于此共识已经吸引了众多学者将研究热点投向乳腺癌的早期诊断。目前，随着转化医学的不断发展，不少以基因检测技术为主的研究项目已取得了标志性的阶段成果，使得该技术越来越受关注。
[0004]传统的乳腺癌检测方法主要包括:X线诊断、超声显像检查、细胞学及组织学诊断等，这些方法虽然在乳腺癌的常规检测中起了重要作用，但大都不适用于在真正意义上对乳腺癌进行准确地早期诊断。随着分子生物学及免疫学研究的进展，乳腺癌的研究由细胞水平进入分子水平研究领域，生物诊断技术成为一种很有发展的检测和治疗手段，特别是近年来人类基因组研究取得的丰硕成果进一步推动了生物诊断技术的发展，分子诊断已逐步成为乳腺癌诊断的一个重要内容(US5，747，282、US5，693，473和US5，837，492)。
[0005]目前常用的基因检测方法有免疫组织化学(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、荧光定量PCR及酶联免疫吸附测定(ELISA)等，这些方法主要基于对癌症发生导致的异常，如:癌基因的扩增或表达的肿瘤标志物进行检测，而为了更早地预防乳腺癌的发生，需要在癌症发生前就提前通过基因检测准确筛查出高风险人群，并对这一人群进行有针对性的健康管理，才能做到真正的提早预防，真正实现乳腺癌的早发现和早治疗。虽然现在也有一些文献或专利报道，通过基因芯片检测一些关键癌基因的表达丰度变化情况来，但基因芯片检测涉及的基因很多，而且在检测早期样本中由于基因丰度变化较低可能会检测不到，这给癌症检测带来较大的假阴性。
[0006]将上述检测方法联合使用，已能实现提高乳腺癌基因突变检测的灵敏性并降低检测的假阴性率。但这样亦提高了成本，对于一些经济较不发达地区，这些检测方法的联合使用存在着较大的局限性。因此，开发适合的、低成本的乳腺癌相关基因的检测方法，是亟待实现的技术进步。
【发明内容】
[0007]本发明的一个方面在于提供一种用于从人的不同样品(癌组织样本或血液)中选择性地捕获(或筛选)特定外显子(如:乳腺癌相关基因)或目标基因组区域的捕获探针文库的构建方法。
[0008]本发明所提供的捕获探针文库构建方法，其通过针对一些重要乳腺癌靶基因高突变位点设计多对引物探针，并应用构建好的探针库杂交捕获待检样本的特异区域而实现快速、高效的乳腺癌早期检测不失为一种高性价比手段。
[0009]本发明提供的方法，涉及乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建，是对乳腺癌发病风险高突变基因(如:但不仅限于BRCAl、BRCA2和CHEK2等)或乳腺癌病例样本全外显子组测序(Exome-seq)获得的高突变位点相关基因作为目标基因。这些目标基因不仅包括通过纸件或电子方式记载在期刊、书籍、专利文献或数据库(如:NCBI)中，那些已发现尚未公开、即将发现或未曾发现的与乳腺癌高发病风险相关的基因或核苷酸也应当理解为目标基因，而落入本发明的所涉及的范围。
[0010]一种具体的实施方式，涉及乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建方法，其包括:
[0011]i)依据目标基因，设计捕获探针，探针至少须符合如下要求:
[0012]I)捕获探针长度为60-80nt ;2)各探针的Tm值50°C-65°C ;3)无发卡等特殊结构；以及4)进行blast 比对，以校对探针的特异性。
[0013]ii)将与所设计的捕获探针序列一致的寡核苷酸，连接入DNA克隆载体(含有多克隆位点)，获得乳腺癌相关基因捕获探针克隆库；
[0014]在待捕获核酸片段较大的情况下，还包括iii)基于所获得的捕获探针克隆库，利用生物素标记数量和位置确定的扩增引物或接头元件(adapter)制备含有利于靶标片段抓取的捕获探针文库(Database),具体操作如下:
[0015]I)将上述获得的乳腺癌相关基因捕获探针的DNA克隆载体片段化处理(如:超声)，获得含有靶标基因的DNA克隆载体片段，片段长度为100-1000 ；
[0016]2)在DNA克隆载体片段两端加上生物素标记数量和位置确定的接头，获得带有生物素标记接头的含有靶标基因的DNA克隆载体片段；
[0017]3)通过表明带有亲和素修饰的磁珠而分离纯化带有生物素标记接头的含有靶标基因的DNA克隆载体片段，从而得到已知生物素标记数量和位置的捕获探针集即带有生物素标记的捕获探针文库。
[0018]本发明的另一个方面在于提供一种从人的不同样品(癌组织样本或血液)中选择性地捕获(或筛选)特定外显子(如:乳腺癌相关基因)或目标基因组区域的高效低成本的方法。
[0019]本发明的乳腺癌相关基因的捕获(或筛选)方法，是通过针对一些重要乳腺癌靶基因高突变位点设计多对引物探针，并应用构建好的探针库杂交捕获待检样本的特异区域，而选择性地捕获(或筛选)特定外显子或目标基因组区域，从而以高性价比的手段，实现了快速、高效的乳腺癌(高风险基因)早期检测。
[0020]一种具体的实施方式，将本发明获得的乳腺癌相关基因捕获探针克隆库或乳腺癌相关基因捕获探针文库与含有待捕获的祀标基因组区域DNA片段杂交，捕获疾病相关的核酸片段。
[0021]获取靶标基因组区域DNA模板及其文库，是本领域技术人员应当掌握的常规操作技术，其通过教科书所记载的技术手段即可实现，至少有如下4种方法可以获取DNA模板及其文库，如:
[0022]I)从来自生物样品(癌组织或血液等)的总RNA或mRNA通过逆转录而获得所需要的DNA模板；或
[0023]2)通过进行多重PCR反应而获得DNA模版；或
[0024]3 )提取自生物样品的基因组DNA模板；
[0025]4)通过基因合成获得DNA模板。
[0026]本发明根据现有的或已获得的乳腺癌高风险致病基因的信息，构建了乳腺癌疾病特异检测的捕获探针文库(或克隆库)，将捕获探针文库与片段化的DNA模板杂交。通过对捕获得到的片段进行高通量测序，并基于乳腺癌致病基因的已知信息，利用生物信息学方法进行数据分析，还获得了待测样本中与乳腺癌高风险致病基因相关的核酸序列的遗传变异?目息。
[0027]本发明提供的各种方法及其获得文库(或克隆库)，尤其适合于选择性的捕获高度特异性的祀标基因，例如:与特定疾病相关的基因(乳腺癌相关基因等)。由于在这样的应用中，通常要靶向数十个甚至数百个特定的基因，因此，高特异性的捕获效率和高通量的测序验证必不可少，并为其奠定了基础。
[0028]本发明提供的各种方 法及其获得文库(或克隆库)，因可以调整相对捕获效率从而确保了在所有基因靶标上的一致性捕获。解决了目前文献报道的芯片捕获中的不均一性而极大阻碍了 NGS测序平台的使用效率。
【具体实施方式】
[0029]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
[0030]具体而言，本发明根据现有的或已获得的乳腺癌高风险致病基因的信息，构建了乳腺癌疾病特异检测的捕获探针文库；对待测样本中含有待捕获的靶标基因组区域DNA模板片段化，两端加上adapter (接头)，富集后用于检测。制得的捕获探针文库与片段化的DNA模板杂交，捕获得到的片段。经高通量测序后，再基于乳腺癌致病基因的已知信息，利用生物信息学方法进行数据分析，从而获得待测样本中核酸序列的遗传变异情况。
[0031]1.样品采集、运送和保存
[0032]无菌操作分别收集疾病样本和正常血液样本，更进一步的可分别收集原癌灶、癌旁(或正常全外周血液样本)，上述样本在2~8°C条件下保存应不超过72小时；-20°C可保存I个月；要长期保存的，需分装后储存于_70°C。如集中检验，标本需在(TC以下环境中运送并于24小时内送达实验室。
[0033]2.乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建[0034]探针必须是纯净和特异的，不受其他不同核酸序列的影响。通常情况下，探针是克隆的DNA序列，人工合成的寡核苷酸或从体外转录克隆DNA序列后获得的RNA，或者是一些寡肽也可以作为探针。本发明可按照以下方式获得靶标基因的捕获探针文库，具体如下描述:
[0035]i)首先，选择用于制备捕获探针文库的乳腺癌相关靶基因，探针的序列对应于特定疾病致病基因的外显子(或外显子前后两端200bp)或特定目标区域。可通过以下几种方式实现:
[0036]①文献报道的乳腺癌发病风险高突变基因，BRCAl、BRCA2、CHEK2等；②乳腺癌病例样本全外显子组测序(Exome-seq)获得的高突变位点相关基因。
[0037]ii )确定目标基因后(闻突变基因)，基于NCBI等数据库获得基因的序列，利用专业引物设计软件(Primer或Oligo)设计出每个基因的分子探针，探针设计原则包括:①设计好的探针与NCBI等数据库进行blast比对以确保探针设计的特异性；②核苷酸的个数为60-80nt ;③各探针的Tm值适中(50-65°C);④无发卡等特殊结构。探针的序列与靶标基因的序列同源性在50%-80%之间，且与靶标基因杂交时要求二者的identity值要大于90%，这样可保证探针杂交的特异性。
[0038]iii)将设计出的探针序列合成为寡核苷酸探针，确认合成探针无误后连接入克隆载体(PUC19或pET29等，含有多克隆位点)，PCR验证后获得乳腺癌相关基因捕获探针克隆库；
[0039]如果待捕获核酸片段较大，可进一步基于上述获得的捕获探针克隆库，利用生物素标记数量和位置确定 的扩增引物或接头元件制备含有利于靶标片段抓取的捕获探针文库。具体操作步骤包括:1)采用超声波等将上述获得的乳腺癌相关基因捕获探针克隆(DNA克隆载体)片段化处理，获得含有靶标基因的DNA克隆载体片段；2)在DNA克隆载体片段两端加上生物素标记数量和位置确定的接头，获得带有生物素标记接头的含有靶标基因的DNA克隆载体片段；3)通过表明带有亲和素修饰的磁珠而分离纯化带有生物素标记接头的含有靶标基因的DNA克隆载体片段，从而得到已知生物素标记数量和位置的捕获探针集即带有生物素标记的捕获探针文库(Database )。
[0040]表1捕获探针序列信息表
[0041]
【权利要求】
1.一种乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建方法，其包括: i)依据目标基因，设计捕获探针，所述探针至少须符合如下要求: I)捕获探针长度为60-80nt ;2)各探针的Tm值50°C _65°C ;3)无发卡等特殊结构；以及4)进行blast比对，以校对探针的特异性； ii)将与所设计的捕获探针序列一致的寡核苷酸，连接入DNA克隆载体，获得乳腺癌相关基因捕获探针克隆库。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建方法，其特征是所述的DNA克隆载体含有多克隆位点。
3.根据权利要求1所述的乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建方法，其特征是所述的DNA克隆载体为PUC19或pET29。
4.根据权利要求1所述的乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建方法，其特征是还包括所述的乳腺癌相关基因捕获探针的DNA克隆载体片段化处理，获得捕获探针文库。
5.根据权利要求1所述的乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建方法，其特征是还包括: 1)将所述的乳腺癌相关基因捕获探针的克隆库片段化处理，获得含有靶标基因的DNA克隆载体片段，片段长度为100-1000 ； 2)在DNA克隆载体片段两端加上生物素标记数量和位置确定的接头，获得带有生物素标记接头的含有靶标基因的DNA克隆载体片段； 3)通过表明带有亲和素修饰的磁珠而分离纯化带有生物素标记接头的含有靶标基因的DNA克隆载体片段，从而得到已知生物素标记数量和位置的捕获探针集即带有生物素标记的捕获探针文库。
6.根据权利要求5所述的乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建方法，其特征是所述的片段化处理方法为物理超声。
7.根据权利要求5所述的乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建方法，其特征是所述的片段长度为100-1000。
8.一种根据权利要求1-7之一所述的乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建方法，用于从待测样本中获得与乳腺癌高风险致病基因相关的核酸序列的遗传变异信息。
9.一种捕获乳腺癌相关基因的探针，其特征是依据权利要求1-7之一所述的乳腺癌相关基因捕获探针文库的构建方法制得。
10.一种捕获乳腺癌相关基因的方法，其特征是将依据权利要求9所述的捕获乳腺癌相关基因的探针与含有待捕获的 祀标基因组区域DNA片段杂交，捕获疾病相关的核酸片段。
【文档编号】C12N15/11GK103757709SQ201310504391
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】张一桐, 张祥林, 胡秋萍, 陈昌岳, 陶晔 申请人:上海美吉生物医药科技有限公司