一种快速检测牛pnpla3基因单核苷酸多态性的方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测秦川牛PNPLA3基因单核苷酸多态性（SNP）的RFLP方法，以包含PNPLA3基因的待测牛全基因组DNA为模板，以人为设计的引物对P1、P2、P3、P4、P5为引物，PCR扩增牛PNPLA3基因，发现27个SNP位点；从中挑选错义突变位点4个并分别设计引物对P2-BglI、P2-RsaI、P3-BmgT120I和P3-MspI。用这4对引物进行PCR扩增，并用上述四种限制性内切酶分别酶切该PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，电泳结果显示秦川牛基因PNPLA3基因第2062位、第2078位、第35800位和第35932位的单核苷酸多态性。由于PNPLA3基因涉及体重、日增重等生长性状，PNPLA3蛋白具有脂肪酶和酰基转移酶的活性而且在维持能量平衡方面也具有重要的作用，本发明所述检测方法可用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择（MAS）育种，有利于快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
【专利说明】—种快速检测牛PNPLA3基因单核苷酸多态性的方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于动物分子育种领域，具体涉及一种快速检测类磷脂酶插入域3马铃薯糖蛋白 3 (the patatin like phospholipase domaincontaining3, PNPLA3)基因单核苷酸多态性(SNP)的RFLP (限制性片段长度多态性)方法，具体的说，是一种利用限制性内切酶对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行片段大小分离，利用凝胶成像系统分析片段大小，从而确定其SNP的基因型，由于它与秦川体重和日增重存在显著关联，可以作为黄牛分子育种的分子标记。
【背景技术】
[0002]单核苷酸多态性(SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。
[0003]牛是人类的重要家畜物种资源之一，它在各国社会经济和人们生活中扮演着重要角色。随着我国经济的发展和人们生活水平的提高，社会对牛产品的需求不断加强，期望牛育种专家尽快培育出更早、更好、更快地获得牛产品的优良品种。在高产、优质和高效的牛育种目标上，牛育种专家一直关注生长发育性状，但现在的问题是仅靠传统育种手段不断改良并提高这些性状，显然是不行的，还需要标记辅助选择(MAS)介导的现代分子育种技术的介入。
[0004]在众多探寻分子遗传标记的方法中，PCR-RFLP是其中一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后使用限 制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，就能准确的鉴别SNP位点。PCR-RFLP方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。
[0005]PNPLA3蛋白具有脂肪酶和酰基转移酶的活性，人和鼠源PNPLA3蛋白N端都具有patatin结构域,patatin中核心模体是(GxsxG)和(DGG)。具有该结构域的脂酶具有水解磷脂，中性脂质和酰基转移酶活性。不同细胞中超表达人和鼠的PNPLA3，分级分离PNPLA3蛋白检测发现PNPLA3具有甘油三酯脂酶活性。细胞中超表达人和鼠的PNPLA3，检测产物发现甘油三酯含量并没有降低，不能降低细胞内源甘油三酯水平。同时，在人HEK293细胞中超表达PNPLA3发现甘油三酯水平还有上升的趋势。以往针对PNPLA3基因的功能和多态性研究主要集中在人和小鼠上，对牛PNPLA3基因的研究报道很少，因此对牛PNPLA3基因的研究是具有重要的意义。
[0006]国内外未见关于牛PNPLA3基因的遗传变异研究，该基因位点的功能研究及其遗传变异与经济性状(如体重等)关联研究仍是空白。由于PNPLA3基因功能涉及体重等生长性状，本发明提供的检测方法为PNPLA3基因的SNP与中国秦川牛生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国黄牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的黄牛种群。
[0007]主要参考文献
[0008]BAULANDE, S.，LASNIER, F.，LUCAS, M.&PAIRAULT, J.(2001) Adiponutrin, atransmembrane protein corresponding to a novel dietary-and obesity-linkedmRNA specifically expressed in the adipose lineage.Journal of BiologicalChemistry,276:33336 - 33344.[0009]JENKINS, C.M.，MANCUSO，D.J.，YANj W.，SIMS, H.F.，GIBSON, B.&GR0SS，R.W.(2004)Identification, cloning, expression,and purification of three novel humancalcium-1ndependent phospholipase A2family members possessing triacylglycerollipase and acylglycerol transacyIase activities.Journal of BiologicalChemistry, 279:48968 - 48975
[0010]KERSHAW, E.E.，HAMM, J.K.，VERHAGEN, L.A.，PERONIj 0.，KATICj M.&FLIER，J.S.(2006) Adipose triglyceride lipase: function,regulation by insulin，andcomparison with adiponutrin.Diabetes, 55:148 - 157.[0011]LAKE，A.C.，SUN, Y.，LI，J.L.，KIM，J.E.，JOHNSON, J.W.，LI, D.，REVETTj T.，SHIHj H.H.，
[0012]L.SUj S.H.WANGj R.L.HANj G.R.SUNj Y.C.BAIj S.J.LV AND X.T.KANG (2012)Polymorphisms of the PNPLA3gene and their associations with chicken growth andcarcass traits.British Poultry Science, 53:453—459.[0013]WILSON, P.A.，GARDNER, S.D.，LAMBIEj N.M.，C0MMANS, S.A.&CR0WTHER, D.J.(2006)Characterization of the human patatin—like phospholipase family.Journal ofLipid Research, 47:1940 - 1949.
【发明内容】
[0014]本发明解决的问题在于利用PCR-RFLP方法检测牛PNPLA3基因的多态性，并与其生长性状的关联性，作为黄牛分子育种中辅助选择的分子标记，从而加快良种选育的速度，为中国黄牛品种的改良提供一定的指导作用。
[0015]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0016]一种快速检测 牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，以包含PNPLA3基因的待测牛全基因组DNA为模板，以人为设计的引物对PU P2、P3、P4、P5为引物，PCR扩增牛PNPLA3基因，发现27个SNP位点；从中挑选错义突变位点4个并分别设计引物对P2-Bgl1、P2-Rsa1、P3-BmgT120I和P3_MspI。用这4对引物进行PCR扩增，并用上述四种限制性内切酶分别酶切该PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，电泳结果显示秦川牛基因PNPLA3基因第2062位、第2078位、第35800位和第35932位的单核苷酸多态性。
[0017]所述的引物对Pl为:
[0018]上游引物:5’-CTTCACAAGCCAGACCCT-3’
[0019]下游引物:5’-GCTGTATGATAGCCCCTA-3’
[0020]所述的引物对P2为:
[0021]上游引物:5’-GACCATTTCTCGTTACCA-3’
[0022]下游引物:5’-AGGATGAAGACCCCACTG-3 ’
[0023]所述的引物对P3为:
[0024]上游引物:5’-GCATGTGGCAGTCCTGAG-3’[0025]下游引物:5’-TGTTGCTGTTGGTCCGTC-3’
[0026]所述的引物对P4为:
[0027]上游引物:5’-TTTGTCACGAGCGGAATG-3’
[0028]下游引物:5’-GGAAAGGAGACAGAGCAA-3 ’
[0029]所述的引物对P5为:
[0030]上游引物:5，-ATTCCTTCCCTGCTGACT-3’
[0031 ]下游引物:5’ -AAACCTGAGGGAGCAATG-3 ’
[0032]所述的引物对P2_BglI为:
[0033]上游引物Fl:5’-CTCCTGGATGACATTTGGGG￡CCGT-3’
[0034]下游引物Rl: 5’ -TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3 ’
[0035]所述的引物对P2_RsaI为:
[0036]上游引物Fl:5’-CTCCTGGATGACATTTGGGG￡CCGT-3’
[0037]下游引物Rl:5’-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’
[0038]所述的引物对P3_BmgT 1201为:
[0039]上游引物F2:5’ -CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3’
`[0040]下游引物R2: 5，-ACCTTGACATCTGGTGGG-3 ’
[0041]所述的引物对P3_MspI为:
[0042]上游引物F2:5’ -CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3’
[0043]下游引物R2:5’ -ACCTTGACATCTGGTGGG-3 ’
[0044]用限制性内切酶Bgl1、Rsa1、BmgT120I和MspI酶切上述PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的片段，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定牛PNPLA3基因第2062位、第2078位、第35800位和第35932位的单核苷酸多态性。
[0045]所述的PCR扩增反应程序为:
[0046]引物对P2_Bgl1:
[0047]95°C预变性 5min ;34 个循环 95°C变性 30s，64°C退火 30s，72°C延伸 20s ;72°C延伸IOmin0
[0048]引物对P2_Rsa1:
[0049]95°C预变性 5min ;34 个循环 95°C变性 30s，64°C退火 30s，72°C延伸 20s ;72°C延伸IOmin0
[0050]引物对P3_BmgT 1201:
[0051]95°C预变性 5min ;34 个循环 95°C变性 30s，59°C退火 30s，72°C延伸 20s ;72°C延伸IOmin0
[0052]引物对P3_Msp1:
[0053]95°C预变性 5min ;34 个循环 95°C变性 30s，59°C退火 30s，72°C延伸 20s ;72°C延伸IOmin0
[0054]所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0%。
[0055]所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定牛PNPLA3基因第2062位的单核苷酸多态性为:AA基因型表现为326bp的条带，GG基因型表现为299bp和27bp的条带，AG基因型表现为326bp、299bp和27bp的条带；第2078位的单核苷酸多态性为:AA基因型表现为326bp的条带，AT基因型表现为326bp、281bp和45bp的条带；第35800位的单核苷酸多态性为:AA基因型表现为298bp的条带，GG基因型表现为158bp和140bp的条带，AG基因型表现为298bp、158bp和140bp的条带；第35932位的单核苷酸多态性为:AA基因型表现为298bp的条带，GG基因型表现为270bp和28bp的条带，AG基因型表现为298bp、270bp和28bp的条带。
[0056]本发明根据PNPLA3基因的序列设计引物，采用DNA池测序技术，共发现27个SNP多态性。
[0057]针对上述SNP多态性，本发明还公开了其筛查和检测方法，通过设计特定的引物PCR扩增，特定的限制性内切酶酶切鉴定，能够简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。
[0058]本发明对秦川牛的SNP基因型进行了检测和基因频率分析，对上述4个SNP位点与秦川牛部分生长性状(如体重等)进行关联分析，结果表明该位点能够作为提高黄牛体重和日增重性状的分子标记。【专利附图】
【附图说明】
[0059]图1为牛PNPLA3基因外显子SNP多态性测序图，其中双峰为SNP位点。
[0060]图2为牛PNPLA3基因内含子SNP多态性测序图，其中双峰为SNP位点。
[0061]图3 为牛 PNPLA3 基因 g.A2062G 位点 Forced PCR-RFLP 分型。DNA 经 3% 琼脂糖凝胶检测电泳后EB染色成像检测。泳道6为Marker I;泳道I为AA基因型；泳道2，3为AG基因型；泳道4，5为GG基因型。
[0062]图4为牛PNPLA3基因g.A2078T位点Forced PCR-RFLP分型。DNA经3%琼脂糖凝胶检测电泳后EB染色成像检测。泳道5为Marker I;泳道1，2为AA基因型；泳道3，4为AT基因型。
[0063]图5 为牛 PNPLA3 基因 g.A35800G 位点 Forced PCR-RFLP 分型。DNA 经 3% 琼脂糖凝胶检测电泳后EB染色成像检测。泳道7为Marker I;泳道1，2为AA基因型；泳道3，4为AG基因型；泳道5，6为GG基因型。
[0064]图6 为牛 PNPLA3 基因 g.G35932A 位点 Forced PCR-RFLP 分型。DNA 经 3% 琼脂糖凝胶检测电泳后EB染色成像检测。泳道7为Marker I;泳道1，2为AA基因型；泳道3，4为AG基因型；泳道5，6为GG基因型。
具体实施方案
[0065]本发明利用PCR-RFLP方法对牛PNPLA3基因第2062位、第2078位、第35800位和第35932位的单核苷酸多态性进行检测，下面结合对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定的。
[0066]一、牛PNPLA3基因⑶S区DNA序列的克隆及其多态性的检测
[0067]1、牛血液样品采集
[0068]本发明具体以秦川牛共计519头牛个体为检测对象，具体采集样本见表1:
[0069]表1样本米集信息表
[0070]
【权利要求】
1.一种快速检测中国牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于:以包含PNPLA3基因的待测牛基因组DNA为模板，以引物对P1、P2、P3、P4、P5为引物，PCR扩增秦川牛PNPLA3基因产物经测序，共发现27个多态位点；从中挑选错义突变位点4个，并针对这4个SNP位点设计引物对？2-汝71、？2-7&<31、？3-奴^77%1和P3-J&/7I，进行PCR扩增，用限制性内切酶AkBgll酶切位点，进行PCR扩增，用限制性内切酶|71、7&al、奴§.77%Ι和##1分别酶切该PCR扩增产物，再用琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定秦川牛基因第2062位、第2078位、第35800位和第35932位的单核苷酸多态性。 所述的引物对Pl为: 上游引物:5’ -CTTCACAAGCCAGACCCT-3’ 下游引物:5’ -GCTGTATGATAGCCCCTA-3， 所述的引物对P2为: 上游引物:5’ -GACCATTTCTCGTTACCA-3’ 下游引物:5’ -AGGATGAAGACCCCACTG-3’ 所述的引物对P3为: 上游引物:5’ -GCATGTGGCAGTCCTGAG-3’ 下游引物:5’ -TGTTGCTGTTGGTCCGTC-3’ 所述的引物对P4为: 上游引物:5’_ TTTGTCACGAGCGGAATG-3’ 下游引物:5’ -GGAAAGGAGACAGAGCAA-3， 所述的引物对P5为: 上游引物:5’ -ATTCCTTCCCTGCTGACT-3， 下游引物:5’ -AAACCTGAGGGAGCAATG-3’ 所述的引物对P2-^7I为: 上游引物 Fl: 5’-CTCCTGGATGACATTTGGGGSCCGT-3’ 下游引物 Rl: 5’-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’ 所述的引物对P2_7&al为: 上游引物 Fl: 5’-CTCCTGGATGACATTTGGGGSCCGT-3’ 下游引物 Rl: 5’-TCTGTGCCTGGAGGCTGACATGAAG-3’ 所述的引物对P3-奴§.77勿I为:
上游引物 F2: 5’ -CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3’
下游引物 R2: 5’ -ACCTTGACATCTGGTGGG-3， 所述的引物对Ρ3-##Ι为:
上游引物 F2: 5’ -CTCTATCCCTAATCTGAAGCA-3’
下游引物 R2: 5’ -ACCTTGACATCTGGTGGG-3 ’。
2.根据权利要求1所述的快速检测牛PNPLA3基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为: 引物对P2-Bgll: 95°C预变性5min ；34个循环95°C变性30s，64°C退火30s，72 °C延伸20s ;72°C延伸IOmin0引物对P2-Rsal: 95°C预变性5min ；34个循环95°C变性30s，64°C退火30s，72 °C延伸20s ;72°C延伸1Omin。 引物对 P3-BmgT120I: 95°C预变性5min ；34个循环95°C变性30s，59 °C退火30s，72 °C延伸20s ;72°C延伸1Omin。 引物对P3-Mspl: 95°C预变性5min ；34个循环95°C变性30s，59 °C退火30s，72 °C延伸20s ;72°C延伸1Omin。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3.0%，以120V电泳1.25个小时。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测牛PNPLA3基因SNP的RFLP方法，其特征在于，第2062位的单核苷酸多态性为:AA基因型表现为326bp的条带，GG基因型表现为299bp和27bp的条带，AG基因型表现为326bp、299bp和27bp的条带；第2078位的单核苷酸多态性为:AA基因型表现为326bp的条带，AT基因型表现为326bp、281bp和45bp的条带；第35800位的单核苷酸多态性为:AA基因型表现为298bp的条带，GG基因型表现为158bp和140bp的条带，AG基因型表现为298bp、158bp和140bp的条带；第35932位的单核苷酸多态性为:AA基因型表现为298bp的条带，GG基因型表现为270bp和28bp的条带，AG基因型表现为298bp、270bp 和 28bp 的条带。
5.权利要求1至4中任意一项权利要求所述的快速检测牛PNPLA3基因单核苷酸多态性方法在鉴定秦川牛群体遗传多态性诊断和分子育种中应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103805692SQ201310504648
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】陈宏 , 王梓年, 蓝贤勇, 雷初超 申请人:西北农林科技大学