与膀胱癌相关的piRNA生物标志物及其应用的制作方法
【专利摘要】与膀胱癌相关的piRNA生物标志物及其应用。所述生物标志物：piRNA共197个，其中，上调的106个，如SEQIDNo.1~106所示;下调的91个，如SEQIDNo.107~197所示。本发明首次发现piRNA在膀胱癌临床早期鉴别诊断中，可作为一种重要的生物学检测指标，为今后膀胱癌piRNA的研究提供了理论依据，并为分子水平诊断膀胱癌提供了新的思路，具有重大的理论意义和潜在的使用价值。
【专利说明】与膀胱癌相关的P i RNA生物标志物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和肿瘤学领域，尤其是涉及膀胱癌组织中PiRNA生物标志物及其表达量的检测方法。
【背景技术】:
[0002]膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，全球，膀胱癌在男性肿瘤中位列第七，在女性中位列第十七。在我国泌尿系统肿瘤中，膀胱癌无论是发病率还是死亡率均居首位并且发病率呈逐年升高趋势，大部分患者年龄介于50-60岁之间。膀胱癌90%以上为移行上皮细胞癌，按病理分期可分为浅表性膀胱癌(早期)和肌层浸润性膀胱癌(进展期)。膀胱癌的发生发展，可严重影响患者的生存及生活质量，因此寻找敏感特异的可用于早期诊断的生物学标志物，以期达到利用其开展预防、筛检及诊断，从而改善膀胱癌患者的生存及生活质量。
[0003]RNA的研究近年来备受科学界的广泛关注，尤其是一些非编码的小RNA(non-coding RNA, ncRNA)分子,这些ncRNA分子可以调节细胞生长和发育的重要生理过程。ncRNA调控细胞的生命过程包括转录水平和转录后水平的基因沉默。一般小ncRNA可以分为三类:siRNAs, microRNAs (miRNAs)和 PlW1-1nteracting RNAs (PIWI 蛋白相关非编码RNAs，简称piRNAs) [2]。其中piRNA的研究比较少，piRNA潜在的功能和生物起源与miRNA和siRNA存在明显不同。piRNA长度约26nt - 31nt，可与PIWI蛋白结合形成piRNA复合物(PiRC)而发挥其生物学功能。不同于miRNA，piRNA不是由含茎环结构的前体剪切产生。piRNA序列的基因组分布表明，piRNA通常成簇出现，并且有很强的正义链或反义链专一I"生。
[0004]对于piRNA的产生机制，目前尚无直接的生物化学证据。但是一个基于生物信息学分析提出了“乒乓模型”假说。该模型认为:反义链的PiRNA前体经过某些未知核酸酶的加工，生成了 5’端具有U (尿嘧啶)偏爱性的初级piRNA，这些piRNA与Aub或Piwi蛋白结合形成piRC, piRC在piRNA的引导下,通过碱基互补配对的方式识别并结合正义链的piRNA前体，然后将正义链PiRNA前体进行剪切切割，产生次级piRNA的5’端，而后该次级piRNA被某种核酸酶切割形成3’端，最后生成成熟的正义链piRNA。正义链piRNA与Ago3(PIWI)结合形成P iRC,通过类似的方式识别并切割反义链的P iRNA前体。这样就形成了一个p iRNA生物发生循环，正义链与反义链的相互识别，通过PiRC的剪切切割，循环产生piRNA。目前该“乒乓模型”假说，得到了许多学者的广泛认同。
[0005]值得注意的是，在2006年7月的Nature杂志上面，两个独立的课题组同期发表了关于piRNA的文章，Aravin等运用Northern blot的方法证实只有生殖细胞中才存在piRNA,同时Girard等也证明了这种存在形式。近来,也有不少研究报道了 piRNA与人类肿瘤之间的相关性，但是机制方面的研究较少。如Lu等采用Solexa测序的方法，发现piRNA在人宫颈癌HeLa细胞中存在，Chen等也发现piRNA存在于人的多种肿瘤细胞中。另外Chen等在PiRNA的研究中发现，piRNA-651与胃癌的临床分期显著相关，同时观察到其在胃癌、结肠癌、肺癌以及乳腺癌组织中的表达水平显著高于其对应的癌旁组织，提示该PiRNA可以作为肿瘤诊断潜在的生物标志物。
[0006]目前对于膀胱组织中piRNA的提取及检测尚缺乏，另现有技术中均没有涉及到膀胱癌组织及其对应癌旁正常组织中与哪些PiRNA相关。
【发明内容】
[0007]解决的技术问题:本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种用于诊断膀胱癌的PiRNA生物标志物及其应用，建立膀胱癌患者组织piRNA的表达谱，揭示组织中PiRNA对膀胱癌诊断的价值，为临床上膀胱癌早期发现提供基础。
[0008]技术方案:一种与膀胱癌相关的piRNA生物标志物，所述生物标志物:piRNA共197个，其中:
[0009]上调的106 个，如 SEQ ID N0.1 ~106 所示:piR_52681、piR-48765、piR-36984、piR-52373、piR-31112、piR-36360、piR-61291、piR-54826、piR-51747、piR-43148、piR-45726、piR-48368、piR-58119、piR-57089、piR-39017、piR-43887、piR-37525、piR-39614、piR-39018、piR-35831、piR-39592、piR-33050、piR-34998、piR-38355、piR-56914、piR-34920、piR-37523、piR-45582、piR-51256、piR-37524、piR-52680、piR-31111、piR-56252、piR-58255、piR-31101、piR-30597、piR-32079、piR-54098、piR-34984、piR-31108、piR-34000、piR-31961、piR-33650、piR-57293、piR-33470、piR-36475、piR-47132、piR-45029、piR-58050、piR-36707、piR-60668、piR-34756、piR-47161、piR-55637、piR-44190、piR-31013、piR-50437、piR-33543、piR-43217、piR-38376、piR-50657、piR-61404、piR-51364、piR-48118、piR-30327、piR-54136、piR-45459、piR-44 085、piR-52697、piR-49813、piR-57447、piR-39232、piR-57132、piR-39763、piR-45051、piR-33043、piR-53177、piR-43105、piR-57140、piR-40110、piR-37972、piR-40982、piR-42947、piR-43876、piR-38354、piR-57141、piR-57567、piR-44956、piR-33368、piR-56037、piR-57143、piR-43107、piR-33733、piR-57142、piR-57139、piR-34534、piR-56276、piR-32683、piR-55475、piR-34532、piR-33730、piR-59160、piR-61324、piR-49600、piR-52323、piR-38240 ；
[0010]下调的91 个，如 SEQ ID N0.107 ~197 所示，:piR-60152、piR-34373、piR_30504、piR-34374、piR-55023、piR-34375、piR-43452、piR-52155、piR-34380、piR-34379、piR-44265、piR-40154、piR-34420、piR-48578、piR-35688、piR-56066、piR-37243、piR-47995、piR-49208、piR-34377、piR-56061、piR-34376、piR-38145、piR-58986、piR-30506、piR-37988、piR-33851、piR-39786、piR-56470、piR-43801、piR-45852、piR-58572、piR-49842、piR-49039、piR-51517、piR-35536、piR-35924、piR-33814、piR-47258、piR-32538、piR-30436、piR-52398、piR-36439、piR-34177、piR-52399、piR-35359、piR-31167、piR-56951、piR-42797、piR-40163、piR-31440、piR-32499、piR-34422、piR-31133、piR-36614、piR-45571、piR-32406、piR-46447、piR-34348、piR-31252、piR-45112、piR-54110、piR-58451、piR-49939、piR-49552、piR-39004、piR-30769、piR-40571、piR-50830、piR-45655、piR-42221、piR-35166、piR-35167、piR-39572、piR-39516、piR-38856、piR-35717、piR-33417、piR-38060、piR-55800、piR-33401、piR-39593、piR-35762、piR-53013、piR-35899、piR-34726、piR-33466、piR-34194、piR-54213、piR-58463、piR-34366。
[0011]一种与膀胱癌相关的piRNA生物标志物，所述生物标志物为上调的piR-52681和下调的 PiR-60152。
[0012]所述的PiRNA生物标志物在制备膀胱癌检测试剂盒中的应用。
[0013]与膀胱癌相关的piRNA生物标志物的检测及表达谱建立方法，包括以下步骤:
[0014](I)使用Trizol试剂(Invitrogen)从膀胱癌患者的癌组织及其对应的癌旁组织中提取总RNA，通过Array Star的piRNA芯片筛选出候选差异表达的piRNA ；
[0015](2) RNA逆转,采用miScript逆转录试剂盒(Qiagen)对RNA提取液进行逆转录反应，获得cDNA溶液；
[0016](3)PCR检测，运用miScript SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤(2)中的cDNA溶液进行PCR扩增反应，进而完成对候选piRNA的验证，建立膀胱癌piRNA表达谱。
[0017]与膀胱癌相关的PiRNA生物标志物表达量的检测方法，采用SYBR qRT-PCR的方法检测膀胱组织中PiRNA的表达量:
[0018](I)逆转录:采用miScript逆转录试剂盒(Qiagen)对提取出的总RNA进行逆转录反应，具体操作依据该试剂盒的说明书进行，首先在0.5mL离心管中加入5 μ L DEPC双蒸水、继而加入I μ L逆转录混合试剂和4 μ L RT缓冲液,最后加入10 μ L0.1 μ g/ μ L的总RNA,总反应体系20 μ L，该方法的反应条件为:37°C反应I小时，95°C反应5分钟，得到cDNA溶液；
[0019](2)piR-52681实时荧光定量PC`R检测:采用miScript SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤(1)中获得的cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增引物为piR-52681扩增上游引物和PCR检测的小RNA通用的下游引物，再用ABI7900HT Real-Time PCR仪检测，具体操作依据该试剂盒与荧光定量PCR仪说明书进行，反应体系包括:1 μ L piR-52681扩增上游引物和IyLPCR检测的小RNA通用的下游引物，5 μ L SYBR Green PCR反应缓冲液，2 μ L DEPC双蒸水以及I μ L0.1 μ g/μ L cDNA稀释液，该方法的反应条件:95°C预变性15分钟，94°C变性15秒，60°C退火30秒，70°C延伸30秒，94°C _70°C的阶段共40个循环；
[0020](3) piR-60152实时荧光定量PCR检测:与步骤(2)中的方法相同，所不同的只是扩增的上游引物由piR-52681特异性扩增上游引物代替piR-60152，检测得到膀胱癌组织及癌旁组织中piR-60152的表达水平；
[0021](4)U6实时荧光定量PCR检测:与步骤(2)中的方法相同，所不同的只是扩增的上游引物有PiR-52681特异性扩增上游引物代替U6，检测得到膀胱癌组织及癌旁组织中U6的表达水平；在本方案中U6作为piR-52681与piR-60152的内参。
[0022]有益效果:本发明首次发现PiRNA在膀胱癌临床早期鉴别诊断中，可作为一种重要的生物学检测指标，为今后膀胱癌PiRNA的研究提供了理论依据，并为分子水平诊断膀胱癌提供了新的思路，具有重大的理论意义和潜在的使用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为实时荧光定量PCR检测piR-52681在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达；
[0024]图2为实时荧光定量PCR检测piR-60152在膀胱癌组织及癌旁组织中的表达。【具体实施方式】
[0025]以下结合实施例对本发明进行详细的说明:本实施例在以本发明技术方案的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的包含范围不限于下述实施例。下面的实施例中未注明的条件和方法等均按照常规进行。
[0026]实施例1:样本的收集及组织中RNA的提取
[0027]收集到19对新发的膀胱癌及其对应癌旁正常组织。组织来源于2010年I月至2012年6月，且经过医院病理诊断确认，所有研究对象均签署知情同意书。
[0028]使用Trizol法提取组织中的总RNA:称取IOOmg的膀胱癌组织或者癌旁正常组织放于玻璃研磨器中，继而加入液氮研磨至组织变成干粉状，而后将干粉用刮子转移至1.5mL去RNA酶的离心管中(管中提前加好ImL Trizol溶液)，颠倒混匀10下，室温静置5分钟；每ImL Trizol中加入0.2mL氯仿,盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒,使其充分混匀，室温静置5分钟后12000g离心15分钟；将上层水相转入新的1.5mL去RNA酶的离心管中(上清量约0.4-0.5mL)，加入0.5mL异丙醇，混匀后放于_20°C中I小时，然后12000g离心10分钟；小心倒掉上清液，留取离心管底部的沉淀，加ImL现配的75%wt的乙醇(预冷)振荡洗涤RNA沉淀一次，最后7500g离心5分钟；小心倒掉上清，而后将带有沉淀的离心管置于超净工作台开风机吹干(约30分钟，此时RNA沉淀变透明)；在离心管中加20 μ L的DEPC水溶解，可在55-60°C下孵育10分钟助溶。提取好的总RNA保存于_70°C的超低温冰箱中，或立即用于逆转录。总RNA质量分析:通过对RNA A230、A260及A280的检测(A260/A280=l.8-2.1, A260/A230>1.80;),以及对总RNA采用琼脂糖凝胶电泳，根据28S rRNA与18S rRNA的比值分析总RNA的质量。
[0029]样本流行病学及临床资料的调查
[0030]所有患者的膀胱组织都经过两名病理医生的病理诊断，纳入本研究前未患其它肿瘤，且未经放射或化学药物治疗。调查内容包括一般人口学特征、临床资料、吸烟史、饮酒史、饮食、个人史和家族史等。吸烟者定义为每天吸烟超过I支并持续一年以上，累计吸烟量“包年”按(每日吸烟量/20) X吸烟年数来计算。饮酒者定义为每周至少3次，持续一年以上。
[0031] piRNA表达谱用于筛选膀胱癌及其对应癌旁正常组织中差异表达的候选piRNA
[0032]随机抽取3对癌及癌旁正常组织，采用人piRNA芯片检测了 23677个piRNAs。统计学分析结果显示:差异表达2倍以上且P值小于0.05的piRNA基因数为197个，其中上调的106个，下调的91个(表1)。我们列出了差异表达上调、下调最显著的前十个piRNAs(表 2)。
[0033]膀胱癌组织及其癌旁正常组织中piRNA表达量的检测方法
[0034]采用SYBR qRT-PCR的方法检测膀胱组织中piRNA的表达量
[0035](1)逆转录:采用miScript逆转录试剂盒(Qiagen)对提取出的总RNA进行逆转录反应，具体操作依据该试剂盒的说明书进行。首先在0.5mL离心管中加入5yL DEPC双蒸水、继而加入1 μ L逆转录混合试剂和4 μ L RT缓冲液,最后加入10 μ L0.1 μ g/ μ L的总RNA,总反应体系20 μ L。该方法的反应条件为:37°C反应1小时，95°C反应5分钟，得到cDNA溶液。[0036](2) piR-52681 实时荧光定量 PCR 检测:采用 miScript SYBR Green PCR 检测试剂盒对(I)中获得的cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增引物为piR-52681扩增上游引物和PCR检测的小RNA通用的下游引物，再用ABI7900HT Real-Time PCR仪检测，具体操作依据该试剂盒与荧光定量PCR仪说明书进行。反应体系包括:1 μ L piR-52681扩增上游引物和I μ LPCR检测的小RNA通用的下游引物，5 μ L SYBR Green PCR反应缓冲液，2μ L DEPC双蒸水以及I μ L cDNA稀释液(0.1 μ g/μ L)。该方法的反应条件:95°C预变性15分钟，94°C变性15秒，60°C退火30秒，70°C延伸30秒，94°C -70 V的阶段共40个循环。[0037](3) piR-60152实时荧光定量PCR检测:与(2)中的方法基本相同，所不同的只是扩增的上游引物由piR-52681特异性扩增上游引物代替piR-60152，检测得到膀胱癌组织及癌旁组织中piR-60152的表达水平。
[0038](4)U6实时荧光定量PCR检测:与(2)中的方法基本相同，所不同的只是扩增的上游引物有PiR-52681特异性扩增上游引物代替U6，检测得到膀胱癌组织及癌旁组织中U6的表达水平。在本实验中U6作为piR-52681与piR-60152的内参。
[0039]分析piR-52681 (DQ585569)和 piR-60152 (DQ594040)对膀胱癌的诊断价值
[0040]实例中piRNA的表达是以CT值来表示。CT值代表一种目的piRNA分子达到实验设计阈值所需要的PCR循环的次数。在目的piR-52681、piR-60152和内参U6扩增效率相同的情况下，可以直接得到目的piR-52681、piR-60152相当于内参的定量Λ CT=CTgw-CT内#。采用f表示目的piRNA表达相对于内参U6表达变化的倍数。所有的统计检验均为双侧概率检验，P〈0.05为差异有统计学意义。采用SPSS13.0软件做进一步的统计分析。
[0041]统计分析结果发现，piR-52681在膀胱癌组织中的表达显著高于其对应的癌旁正常组织(癌组织与癌旁正常组织相比:7.58±7.49versus2.91±1.33，P=0.026)(图1)。piR-60152在膀胱癌组织中的表达显著低于其对应的癌旁正常组织(癌组织与癌旁正常组织相比:3.95±2.05versus8.82±7.81, P=0.027)(图 2)。
[0042]表1.膀胱癌及癌旁正常组织中差异piRNA表达谱
[0043]
【权利要求】
1.一种与膀胱癌相关的PiRNA生物标志物，其特征在于，所述生物标志物:piRNA共197个，其中， 上调的 106 个，如 SEQ ID N0.1~106 所示:piR_52681、piR-48765、piR-36984、piR-52373、piR-31112、piR-36360、piR-61291、piR-54826、piR-51747、piR-43148、piR-45726、piR-48368、piR-58119、piR-57089、piR-39017、piR-43887、piR-37525、piR-39614、piR-39018、piR-35831、piR-39592、piR-33050、piR-34998、piR-38355、piR-56914、piR-34920、piR-37523、piR-45582、piR-51256、piR-37524、piR-52680、piR-3111 1、piR-56252、piR-58255、piR-31101、piR-30597、piR-32079、piR-54098、piR-34984、piR-31108、piR-34000、piR-31961、piR-33650、piR-57293、piR-33470、piR-36475、piR-47132、piR-45029、piR-58050、piR-36707、piR-60668、piR-34756、piR-47161、piR-55637、piR-44190、piR-31013、piR-50437、piR-33543、piR-43217、piR-38376、piR-50657、piR-61404、piR-51364、piR-48118、piR-30327、piR-54136、piR-45459、piR-44085、piR-52697、piR-49813、piR-57447、piR-3923 2、piR-57132、piR-39763、piR-45051、piR-33043、piR-53177、piR-43105、piR-57140、piR-40110、piR-37972、piR-40982、piR-42947、piR-43876、piR-38354、piR-57141、piR-57567、piR-44956、piR-33368、piR-56037、piR-57143、piR-43107、piR-33733、piR-57142、piR-57139、piR-34534、piR-56276、piR-32683、piR-55475、piR-34532、piR-33730、piR-59160、piR-61324、piR-49600、piR-52323、piR-38240 ； 下调的 91 个，如 SEQ ID N0.107~197 所示:piR_60152、piR-34373、piR-30504、piR-34374、piR-55023、piR-34375、piR-43452、piR-52155、piR-34380、piR-34379、piR-44265、piR-40154、piR-34420、piR-48578、piR-35688、piR-56066、piR-37243、piR-47995、piR-49208、piR-34377、piR-56061、piR-34376、piR-38145、piR-58986、piR-30506、piR-37988、piR-33851、piR-39786、piR-56470、piR-43801、piR-45852、piR-58572、piR-49842、piR-49039、piR-51517、piR-35536、piR-35924、piR-33814、piR-47258、piR-32538、piR`-30436、piR-52398、piR-36439、piR-34177、piR-52399、piR-35359、piR-31167、piR-56951、piR-42797、piR-40163、piR-31440、piR-32499、piR-34422、piR-31133、piR-36614、piR-45571、piR-32406、piR-46447、piR-34348、piR-31252、piR-45112、piR-54110、piR-58451、piR-49939、piR-49552、piR-39004、piR-30769、piR-40571、piR-50830、piR-45655、piR-42221、piR-35166、piR-35167、piR-39572、piR-39516、piR-38856、piR-35717、piR-33417、piR-38060、piR-55800、piR-33401、piR-39593、piR-35762、piR-53013、piR-35899、piR-34726、piR-33466、piR-34194、piR-54213、piR-58463、piR-34366。
2.一种与膀胱癌相关的piRNA生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为上调的piR-52681 和下调的 piR-60152。
3.权利要求1或2中所述的piRNA生物标志物在制备膀胱癌检测试剂盒中的应用。
4.一种如权利要求1或2所述的与膀胱癌相关的piRNA生物标志物的检测及表达谱建立方法，其特征在于包括以下步骤: (O使用Trizol试剂(Invitrogen)从膀胱癌患者的癌组织及其对应的癌旁组织中提取总RNA，通过Array Star的piRNA芯片筛选出候选差异表达的piRNA ；(2)RNA逆转,采用miScript逆转录试剂盒(Qiagen)对RNA提取液进行逆转录反应，获得cDNA溶液； (3)PCR检测，运用miScript SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤(2)中的cDNA溶液进行PCR扩增反应，进而完成对候选piRNA的验证，建立膀胱癌piRNA表达谱。
5.如权利要求2所述的与膀胱癌相关的piRNA生物标志物表达量的检测方法，其特征在于采用SYBR qRT-PCR的方法检测膀胱组织中piRNA的表达量: (1)逆转录:采用miScript逆转录试剂盒(Qiagen)对提取出的总RNA进行逆转录反应，具体操作依据该试剂盒的说明书进行，首先在0.5mL离心管中加入5 μ L DEPC双蒸水、继而加入I μ L逆转录混合试剂和4 μ L RT缓冲液，最后加入10 μ L 0.1 μ g/ μ L的总RNA，总反应体系20yL，该方法的反应条件为:37°C反应I小时，95°C反应5分钟，得到cDNA溶液； (2)piR-52681实时荧光定量PCR检测:采用miScript SYBR Green PCR检测试剂盒对步骤(1)中获得的cDNA溶液进行PCR扩增反应，扩增引物为piR-52681扩增上游引物和PCR检测的小RNA通用的下游引物，再用ABI 7900HT Real-Time PCR仪检测，具体操作依据该试剂盒与荧光定量PCR仪说明书进行，反应体系包括:1 μ L piR-52681扩增上游引物和I μ L PCR检测的小RNA通用的下游引物，5 μ L SYBR Green PCR反应缓冲液，2 μ L DEPC双蒸水以及IuL 0.1 μ g/ μ L cDNA稀释液，该方法的反应条件:95°C预变性15分钟，94°C变性15秒，60°C退火30秒，70°C延伸30秒，94°C _70°C的阶段共40个循环； (3)piR-60152实时荧光定量PCR检测:与步骤(2)中的方法相同，所不同的只是扩增的上游引物由PiR-52681特异性扩增上游引物代替piR-60152，检测得到膀胱癌组织及癌旁组织中piR-60152的表达水平； (4)U6实时荧光定量PCR检测:与步骤(2)中的方法相同，所不同的只是扩增的上游引物有PiR-52681特异性扩增上游引物代替U6，检测得到膀胱癌组织及癌旁组织中U6的表达水平；在本方案中U6作为piR-5268`1与piR-60152的内参。
【文档编号】C12Q1/68GK103627705SQ201310516529
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】张正东, 王美林, 储海燕, 殷长军, 仝娜, 袁琳 申请人:南京医科大学