双基因缺失的副猪嗜血杆菌及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌，其是菌株的aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258-181643位核苷酸的双基因缺失株，菌株保藏号为：CCTCC?NO:M2013460。本发明主要是利用现代基因工程原理和分子生物学手段对Hps潜在的毒力因子aroA基因和omp2基因进行缺失，构建Hps不含抗性标记的双基因缺失菌株，并对其生物学特性及致病力等进行探讨，为进一步研制新型高效可提供高交叉保护效力的基因工程活疫苗打下基础。
【专利说明】双基因缺失的副猪嗜血杆菌及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌及其构建方法。
【背景技术】
[0002]副猪嗜血杆菌病是近年来严重危害养猪业的新发细菌性传染病，引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜脑炎等，发病率一般为10-15%，死亡率可达50%以上，引起了人们的日益重视。该病的致病菌副猪嗜血杆菌(Hps)的血清型复杂多样，按Kieleetin.Rapp-Gbarideosn (KRG)琼脂扩散血清分型方法，至少可将Hps分为15个血清型，另有20%以上的分离株血清型不可定。己有的资料表明，Hps具有明显的地方性特征，基于某个或某些特定血清型菌株的全菌体制备的灭活疫苗在不同血清型之间所产生的交叉保护率很低，急待研制具有高效交叉保护力的疫苗。因此弱毒活疫苗的研制是当前多数传染病的研究热点。
[0003]目前关于Hps的致病机理尚不清楚，aroA基因和omp2基因被认为是Hps的潜在毒力基因，在其它细菌中有较深的研究报道。aroA基因是细菌芳香族氨基酸代谢通路中一个非常重要的酶，该酶活性的缺失会导致细菌毒力降低等生物学变化，已被应用于多种细菌的缺失弱毒疫苗的构建。omp2在流感嗜血杆菌定殖中发挥重要作用，且已被证实与人的粘蛋白的特定成分结合，是细菌侵入机体过程中一个重要的因子。
【发明内容】
[0004]本发明主要是利用现代基因工程原理和分子生物学手段对Hps潜在的毒力因子aroA基因和omp2基因进行缺失，构建Hps不含抗性标记的双基因缺失菌株，并对其生物学特性及致病力等进行探讨，为进一步研制新型高效可提供高交叉保护效力的基因工程活疫苗打下基础。
[0005]本发明的目的在于提供一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌，构建一种副猪嗜血杆菌的变异株，用于制备预防副猪嗜血杆菌病灭活疫苗。
[0006]本发明的另一目的在于双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法。
[0007]本发明的又一目的在于双基因缺失的副猪嗜血杆菌在制备预防副猪嗜血杆菌病灭活疫苗中的应用。
[0008]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下:
[0009]一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌，其是菌株的aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258-181643位核苷酸的双基因缺失株，菌株保藏号为=CCTCCN0:M2013460。该菌株于2013年9月29日由中国典型培养物保藏中心接受保藏，并于2013年10月9日检测存活，该菌株保藏名称为副猪嗜血杆菌⑶-1;保藏中心地址为中国武汉，武汉大学，邮编为430072。
[0010]一种双基因缺失的副猪 嗜血杆菌的构建方法，其步骤如下:[0011]A)基因的克隆与重组自杀性质粒的构建:参照GenBank中aroA、omp2基因的序列，从HlO中扩增了 aroA和omp2基因的上下游片段。将得到的上下游片段，连接到携带蔗糖敏感基因(SacB)的自杀性质粒pEM0C2上，构建缺失了第394131-394631位核苷酸的aroA基因的重组自杀性质粒ρΕΜ Δ aroA和第181258-181643位核苷酸的omp2基因的重组自杀性质粒ρΕΜ Δ omP2 ；
[0012]B)接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建:以转化了上述重组自杀性质粒pEM AaroA的大肠杆菌β 2155为供体菌，血清5型菌株HlO为受体菌进行接合转移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上，筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中，鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生，涂布含10%蔗糖的平皿，并转印到Cm平皿上，筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并进行第二次PCR鉴定，确定发重组自杀性质粒已经丢失，从而构建出aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸的单基因缺失株HS02 ；
[0013]C)副猪嗜血杆菌双基因缺失株的构建:用转化了上述重组自杀性质粒pEMAomP2的大肠杆菌β 2155为供体菌，上述单基因缺失株HS02为受体菌进行接合转移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上，筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中，鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生，涂布含10%蔗糖的平皿，并转印到Cm平皿上，筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并进行第二次PCR鉴定，确定发重组自杀性质粒已经丢失，从而构建构建aroA基因缺失第394131-394631位基因和omp2基因缺失181258-181643双基因缺失的菌株。
[0014]上述构建方法中，步骤B)接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建过程中，第一次PCR鉴定时，所用的上游引物为SEQ ID N0:5，下游引物为SEQ ID N0:6;第二次PCR鉴定上游引物为SEQ ID N0:7，下游引物为SEQ ID N0:8。
[0015]上述构建方法中，步骤C)副猪嗜血杆菌双基因缺失株的构建中，第一次PCR鉴定时，上游引物为SEQ ID N0:9，下游引物为SEQ ID NO: 10，第二次PCR鉴定上游引物为SEQID N0:7，下游引物为 SEQ ID N0:8。
[0016]上述构建方法中，所述基因的克隆与重组自杀性质粒的构建具体步骤如下:
[0017]DHps的增殖及其基因组的提取:取冻干保存的副猪嗜血杆菌接种于TSB振摇培养过夜；再取菌液划线于含有NAD的TSA平板和不含NAD的TSA平板，于37 °C培养箱倒置培养过夜；取上述菌液至EP管中，离心后弃上清，倒置EP管于吸水纸上吸干管中残余水分；沉淀重悬于TE中，加入溶菌酶置于35-42°C水浴中作用1-2小时；加入NaCl溶液、10% SDS溶液、20mg/mL蛋白酶K，48_52°C水浴中作用2_4h ;用枪头将混合液均分到两个新的EP管中，加入与菌液等体积的酚、氯仿以及异戊醇的混合液抽提两次；抽提后用异丙醇于_15°C以下的冰箱中沉淀，离心后弃上清，用预冷的乙醇洗涤两次；室温干燥后，用含20yg/mLRNAase的TE溶解DNA，用于PCR反应中作模板；
[0018]2)核酸物质的胶回收纯化:上述DNA注入琼脂糖凝胶的梳空内，放入电泳槽中电泳15-20min ;在紫外灯下切下所需的目的片段，然后放入离心管中，加入等倍凝胶体积的Binding Buffer,把混合物置于55°C~65°C水浴中温浴凝胶完全融化；将DNA-琼脂糖溶液转移到HiBindDNA柱子中，并把HiBindDNA柱子装入收集管内，室温下离心处理，弃去滤液；将空柱子重新套回收集管中，离心甩干柱子中残余的液体；把柱子装在离心管上，加入洗脱液或灭菌水到柱子的膜中央上，离心后得到的溶液即纯化的DNA产物；
[0019]3)大肠杆菌感受态细胞的制备:采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞；
[0020]4)连接产物的转化:将上述大肠杆菌感受态细胞加入纯化的DNA产物，轻轻旋转以混匀内溶物，冰浴后于37-45°C的水浴中热激后；快速转移到冰浴中，使细胞冷却；加入SOC培养基，于摇床上摇动细胞使细菌复壮；取复壮的菌液平铺到含有相应抗生素的LB琼脂培养基上，待液体被完全吸干之后于35-42°C倒置培养；
[0021]5)质粒的制备:将步骤4)中导致培养后的肠杆菌接种于含有抗生素的液体培养基中，摇床中振摇培养；将菌液分装到EP管中，室温下离心后弃掉上清，收集菌体；加入Sollution I /RNase混合液,充分重悬管底的细胞沉淀；往细胞悬液中加入Sollution II,颠倒EP管3-6次，往混合液中加入Sollution III，颠倒数次至混匀，直到形成白色絮状沉淀；室温下连续离心处理，弃去滤液，将HiBind DNA结合柱装回收集管，室温下离心以甩干柱子；将HiBind DNA结合柱装回收集管，往DNA结合膜中央加入Elution Buffer或无菌双蒸水，室温下静置，离心，管底的洗脱液即所需的质粒溶液；
[0022]6)重组质粒的鉴定:采用PCR快速鉴定法或常规常规鉴定法多上述质粒溶液进行鉴定，挑选鉴定结果为阳性的克隆子接种于含抗生素的液体培养基中，培养，然后用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，抽提出来的质粒溶液用限制性核酸内切酶酶切消化，消化后于
0.8%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察酶切产生的条带；
[0023]7)菌株H10aroA 、omP2基因前后壁的克隆:参照Hps SHO165中aroA基因及上游和下游序列分别设计aroA前臂的上游引物SEQ ID N0:1、下游引物SEQ ID N0:2和aroA后臂的上游引物SEQ ID N0:3、下游引物SEQ ID NO:4，分别扩增aroA基因的前臂和后臂，其中前臂的上游引物SEQ ID NO:1上加入酶切位点Not I，下游引物SEQ ID N0:2上加入酶切位点Bgl II ;后臂的上游引物SEQ ID N0:3加入酶切位点Bgl II，下游引物SEQ ID N0:4加入酶切位点Sal I。前臂的上游引物SEQ ID NO:1位于aroA的上游基因ppc上，下游引物SEQ ID N0:2位于aroA基因的上游，PCR扩增出的片段Λ aroA_UP大小为710bp，横跨ppc基因和aroA基因；后臂的上游引物Δ aroA-3位于aroA基因的下游,下游引物AaroA-^i于aroA基因的下游基因cspD上，扩增出的片段AaroA-DN大小为1281bp ;PCR扩增出来的产物经胶回收试剂盒回收纯化之后，与PMD18-T连接，并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，构建质粒pMD18-T- Δ aroA-UP和pMD18_T- Δ aroA-DN ;平板上长出来的菌落经PCR鉴定，质粒pMD18-T-AaroA-UP用引物SEQ ID NO:1/SEQ ID NO: 2反应，pMD18-T-AaroA-DN用SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4反应，PCR结果为阳性的克隆子抽提质粒进行酶切鉴定，PMD18-T-Λ aroA-UP先用Not I和Bgl II双酶切鉴定，再用Not I和Sal I双酶切鉴定；PMD18-T-AaroA-DN用Bgl II和Sal I双酶切鉴定；酶切产生正确片段的克隆子测序；
[0024]8)中间转移质粒pMD18-T- Δ aroA、pMD18_T_ Δ ompP2的构建及鉴定:步骤7)中测序正确的克隆子抽提质粒，质粒pMD18-T-AaroA-UP经Bgl II和Sal I双酶切回收线性 pMD18-T- Δ aroA-UP,质粒 pMD18_T_ Δ aroA-DN 经 Bgl II 和 Sal I 双酶切之后回收Δ aroA-DN,再将有着相同黏性末端的线性pMD18_T_ Δ aroA-UP与Λ aroA-DN用T4连接酶连接起来，连接产物转化大肠杆菌DH5a，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，构建成中间质粒pMD18-T-AaroA ;平板上长出来的菌落经PCR鉴定，用引物SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:4反应，结果为阳性的克隆子抽提质粒用Not I和Sal I双酶切鉴定；酶切产生正确片段的克隆子测序；
[0025]9)重组自杀性质粒ρΕΜΔ aroA、ρΕΜ Δ omP2的构建:测序正确的克隆子抽提质粒，并用Not I和Sal I双酶切，回收片段Λ aroA-UP-DN，自杀性pEM0C2同样用Not I和Sal I双酶切，回收大片段，再将Λ aroA-UP-DN与pEM0C2用T4连接酶连接过夜，构建自杀性质粒ρΕΜ Δ aroA,转化大肠杆菌β 2155，涂布含有Cm和DAP的LB平板，挑取长出来的单菌落进行PCR鉴定，用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID Ν0:4反应，结果为阳性的菌落抽提质粒Not I和Sal I双酶切鉴定。
[0026]步骤5)中，室温下连续离心处理具体步骤为:室温下离心Imin ;将滤液重新过一次HiBind DNA结合柱；弃掉滤液，将HiBind DNA结合柱装回收集管，加入HB Buffer，室温下离心Imin,弃去滤液；将HiBind DNA结合柱装回收集管,加入DNA Wash Buffer,室温下离心lmin，弃去滤液；重复上述步骤一次，弃去滤液，将HiBind DNA结合柱装回收集管。[0027]一种利用上述双基因缺失的副猪嗜血杆菌制备的预防副猪嗜血杆菌病的疫苗。
[0028]所述疫苗含有a含有aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258-181643位核苷酸的双基因缺失副猪嗜血杆菌。
[0029]相比现有技术，本发明的有益效果在于:本发明利用现代基因工程原理和分子生物学手段对Hps潜在的毒力因子aroA基因和omp2基因进行缺失，构建Hps不含抗性标记的双基因缺失菌株，并对其生物学特性及致病力等进行探讨，为进一步研制新型高效可提供高交叉保护效力的基因工程活疫苗打下基础；本发明通过双基因缺失株对豚鼠的免疫试验及攻毒保护试验，双基因缺失的弱毒菌株HS03在豚鼠中的免疫效力优于传统灭活疫苗。
[0030]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1位副猪嗜血杆菌SH0165aroA基因及其上下游基因相对位置示意图；
[0032]图2为中间质粒18T-Λ aroA-UP-DN的构建示意图；
[0033]图3为自杀性质粒ρΕΜ- Δ aroA_UP-DN的构建示意图；
[0034]图4为自杀性质粒ρΕΜ- Δ omp2-UP-DN的构建示意图；
[0035]图5为单基因缺失株HS02的构建路线图；
[0036]图6为aroA基因前后臂片段的扩增结果图，其中A为aroA前臂扩增结果，B为aroA gene后臂扩增结果；
[0037]图7为aroA基因前后臂片段的克隆酶切鉴定结果图，A为pMD18-T-AaroA-UP鉴定结果，B为pMD18_T_ Δ aroA-DN鉴定结果
[0038]图8为质粒18T-AaroA_UP酶切鉴定结图果，A为pMD18-T_AaroA PCR鉴定结果，BI 为 pMD18-T-AaroA (Not I +Sal I )鉴定结果，B2 为 pMD18_T_ Λ aroA (Not I +Bgl II)R 鉴定结果，B3 为 pMD18-T- Δ aroA (Bgl II +Sal I ) R 鉴定结果；
[0039]图9为质粒pEM0C2- Δ aroA-UP酶切鉴定结果图，Al_2为pEM0C2双酶切(Not I +Sal I)结果，A3-4:为 pMD18_T_ Λ aroA 双酶切(Not I +Sal I )结果，B1-3 为pEM0C2-AaroA 双酶切(Not I +Sal I )结果;
[0040]图10为omp2基因前臂片段的扩增结果图；
[0041]图11为omp2基因后臂片段的扩增结果图；
[0042]图12 为质粒 pl8T-Aomp2 酶切鉴定结果图，I 为 pMD18-T-Aomp2(Not I +Sal I)结果，2 为 pMD18-T-Aomp2 (Not I +Bgl II )结果，3 为 pMD18_T_ Λ 0mp2 (Bgl II +Sal I)结果;
[0043]图13为质粒pEM0C2-Aomp2酶切鉴定结果，1-3:pEM0C2-Δ omp2双酶切(Not I+Sal I )结果；
[0044]图14为质粒pEM0C2- Δ omp2PCR鉴定结果；
[0045]图15为扩增Cm基因鉴定接合子电泳结果图；
[0046]图16为引物paroA-Ι和paroA_2PCR鉴定AaroA单交换接合子电泳结果图；
[0047]图17为引物paroA-Ι和paroA_2PCR鉴定Δ aroA缺失株电泳结果图；
[0048]图18为引物paroA-Ι和paroA_2PCR鉴定Δ aroA缺失株HS02的稳定性电泳结果图；
[0049]图19为引物P omp2-l和p omp2_lPCR鉴定Aomp2单交换接合子电泳结果图；
[0050]图20为引物P omp2-l和p omp2_2PCR鉴定Aomp2缺失株电泳图；
[0051]图21为引物P omp2-l和p om p2_2PCR鉴定Δ omp2缺失株HS03的稳定性电泳图；
[0052]图22为突变株和亲本株的生长曲线图；
[0053]图23为用HPS引物扩增鉴定接种豚鼠回收的HPS后的电泳图。
【具体实施方式】
[0054]在本发明中，大肠杆菌DH5a由本试验室保存；PCR产物克隆载体pMD18_T购自大连宝生物公司；本发明中所釆用的所有引物见表1。
[0055]表1:本发明所用引物
[0056]
【权利要求】
1.一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌，其特征在于:其是菌株的aroA基因缺失第394131- 394631核苷酸和omp2基因缺失181258- 181643位核苷酸的双基因缺失株，菌株保藏号为:CCTCC NO: M2013460。
2.一种如权利要求1所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法，其特征在于，其步骤如下: A)基因的克隆与重组自杀性质粒的构建:参照GenBank中aroA、omp2基因的序列，从HlO中扩增了 aroA和omp2基因的上下游片段；将得到的上下游片段，连接到携带蔗糖敏感基因(SacB)的自杀性质粒pEM0C2上，构建缺失第394131- 394631位核苷酸的aroA基因的重组自杀性质粒pEM AaroA和缺失第181258- 181643位核苷酸的omp2基因的重组自杀性质粒ρΕΜ Δ omp2 ； B)接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建:以转化了上述重组自杀性质粒ρΕΜ Δ aroA的大肠杆菌β 2155为供体菌，血清5型菌株HlO为受体菌进行接合转移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上，筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中，鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生，涂布含10%蔗糖的平皿，并转印到Cm平皿上，筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并进行第二次PCR鉴定，确定发重组自杀性质粒已经丢失，从而构建出aroA基因缺失第394131- 394631位核苷酸的单基因缺失株HS02 ； C)副猪嗜血杆菌双基因缺失株的构建:用转化了上述重组自杀性质粒ρΕΜΔοπιρ2的大肠杆菌β 2155为供体菌，上述单基因缺失株HS02为受体菌进行接合转移后，涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上，筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子，进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中，鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使`第二次同源重组的发生，涂布含10%蔗糖的平皿，并转印到Cm平皿上，筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆，并进行第二次PCR鉴定，确定发重组自杀性质粒已经丢失，从而构建构建aroA基因缺失第394131- 394631位基因和omp2基因缺失181258- 181643双基因缺失的菌株。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于:步骤B)接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建过程中，第一次PCR鉴定时，所用的上游引物为SEQ ID N0:5，下游引物为SEQ ID N0:6 ;第二次PCR鉴定上游引物为SEQ ID NO: 7，下游引物为SEQ ID N0:8。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤C)副猪嗜血杆菌双基因缺失株的构建中，第一次PCR鉴定时，上游引物为SEQ ID N0:9，下游引物为SEQ ID NO: 10，第二次PCR鉴定上游引物为SEQ ID N0:7，下游引物为SEQ ID N0:8。
5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，所述基因的克隆与重组自杀性质粒的构建具体步骤如下: DHps的增殖及其基因组的提取:取冻干保存的副猪嗜血杆菌接种于TSB振摇培养过夜；再取菌液划线于含有NAD的TSA平板和不含NAD的TSA平板，于37°C培养箱倒置培养过夜；取上述菌液至EP管中，离心后弃上清，倒置EP管于吸水纸上吸干管中残余水分；沉淀重悬于TE中，加入溶菌酶置于35-42°C水浴中作用1-2小时；加入NaCl溶液、10% SDS溶液、20mg/mL蛋白酶K，48-52°C水浴中作用2_4h ;用枪头将混合液均分到两个新的EP管中，加入与菌液等体积的酚、氯仿以及异戊醇的混合液抽提两次；抽提后用异丙醇于-15°C以下的冰箱中沉淀，离心后弃上清，用预冷的乙醇洗涤两次；室温干燥后，用含20mg/mLRNAase的TE溶解DNA，用于PCR反应中作模板； ，2 )核酸物质的胶回收纯化:上述D NA注入琼脂糖凝胶的梳空内，放入电泳槽中电泳15-20min ;在紫外灯下切下所需的目的片段，然后放入离心管中，加入等倍凝胶体积的Binding Buffer，把混合物置于55°C~65°C水浴中温浴凝胶完全融化；将DNA-琼脂糖溶液转移到HiBindDNA柱子中，并把HiBindDNA柱子装入收集管内，室温下离心处理，弃去滤液；将空柱子重新套回收集管中，离心甩干柱子中残余的液体；把柱子装在离心管上，加入洗脱液或灭菌水到柱子的膜中央上，离心后得到的溶液即纯化的DNA产物； ，3)大肠杆菌感受态细胞的制备:采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞； ，4)连接产物的转化:将上述大肠杆菌感受态细胞加入纯化的DNA产物，轻轻旋转以混匀内溶物，冰浴后于37-45°C的水浴中热激后；快速转移到冰浴中，使细胞冷却；加入SOC培养基，于摇床上摇动细胞使细菌复壮；取复壮的菌液平铺到含有相应抗生素的LB琼脂培养基上，待液体被完全吸干之后于35-42°C倒置培养； ，5)质粒的制备:将步骤4)中导致培养后的肠杆菌接种于含有抗生素的液体培养基中，摇床中振摇培养；将菌液分装到EP管中，室温下离心后弃掉上清，收集菌体；加入Sollution I /RNase混合液,充分重悬管底的细胞沉淀；往细胞悬液中加入Sollution II,颠倒EP管3-6次，往混合液中加入Sollution III，颠倒数次至混匀，直到形成白色絮状沉淀；室温下连续离心处理，弃去滤液，将HiBind DNA结合柱装回收集管，室温下离心以甩干柱子；将HiBind DNA结合柱装回收集管，往DNA结合膜中央加入Elution Buffer或无菌双蒸水，室温下静置，离心，管底的洗脱液即所需的质粒溶液； ，6)重组质粒的鉴定:采用PCR快速鉴定法或常规常规鉴定法多上述质粒溶液进行鉴定，挑选鉴定结果为阳性的克隆子接种于含抗生素的液体培养基中，培养，然后用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，抽提出来的质粒溶液用限制性核酸内切酶酶切消化，消化后于0.8%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯 下观察酶切产生的条带； ，7)菌株HlOaroA、omP2基因前后壁的克隆:参照Hps SHO165中aroA基因及上游和下游序列分别设计aroA前臂的上游引物SEQ ID N0:1、下游引物SEQ ID N0:2和aroA后臂的上游引物SEQ ID N0:3、下游引物SEQ ID NO:4，分别扩增aroA基因的前臂和后臂，其中前臂的上游引物SEQ ID NO:1上加入酶切位点Not I，下游引物SEQ ID N0:2上加入酶切位点Bgl II ;后臂的上游引物SEQ ID N0:3加入酶切位点Bgl II，下游引物SEQ ID N0:4加入酶切位点Sal I ;前臂的上游引物SEQ ID NO:1位于aroA的上游基因ppc上，下游引物SEQID NO: 2位于aroA基因的上游，PCR扩增出的片段Λ aroA_UP大小为710bp，横跨ppc基因和aroA基因；后臂的上游引物Δ aroA-3位于aroA基因的下游,下游引物AaroA_4位于aroA基因的下游基因cspD上，扩增出的片段AaroA-DN大小为1281bp ;PCR扩增出来的产物经胶回收试剂盒回收纯化之后，与PMD18-T连接，并转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，构建质粒pMD18-T- Δ aroA-UP和pMD18_T- Δ aroA-DN ;平板上长出来的菌落经PCR鉴定，质粒pMD18-T-AaroA-UP用引物SEQ ID NO:1/ SEQ ID NO:2反应，pMD18-T-AaroA-DN用SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4反应，PCR结果为阳性的克隆子抽提质粒进行酶切鉴定，PMD18-T-Λ aroA-UP先用Not I和Bgl II双酶切鉴定，再用Not I和Sal I双酶切鉴定；PMD18-T-AaroA-DN用Bgl II和Sal I双酶切鉴定；酶切产生正确片段的克隆子测序； 8)中间转移质粒pMD18-T-AaroA、pMD18_T_ΛompP2的构建及鉴定:步骤7)中测序正确的克隆子抽提质粒，质粒pMD18-T-AaroA-UP经Bgl II和Sal I双酶切回收线性 pMD18-T- Δ aroA-UP,质粒 pMD18_T_ Δ aroA-DN 经 Bgl II 和 Sal I 双酶切之后回收Δ aroA-DN,再将有着相同黏性末端的线性pMD18_T_ Δ aroA-UP与Λ aroA-DN用T4连接酶连接起来，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，构建成中间质粒pMD18-T-AaroA ;平板上长出来的菌落经PCR鉴定，用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:4反应，结果为阳性的克隆子抽提质粒用Not I和Sal I双酶切鉴定；酶切产生正确片段的克隆子测序； 9)重组自杀性质粒ρΕΜΛaroA、ρΕΜΛ omP2的构建:测序正确的克隆子抽提质粒，并用Not I和Sal I双酶切，回收片段AaroA-UP-DN，自杀性pEM0C2同样用Not I和Sal I双酶切，回收大片段，再将Λ aroA-UP-DN与pEM0C2用T4连接酶连接过夜，构建自杀性质粒ρΕΜ Δ aroA,转化大肠杆菌β 2155，涂布含有Cm和DAP的LB平板，挑取长出来的单菌落进行PCR鉴定，用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID Ν0:4反应，结果为阳性的菌落抽提质粒Not I和Sal I双酶切鉴定。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤5)中，室温下连续离心处理具体步骤为:室温下离心Imin ;将滤液重新过一次HiBind DNA结合柱；弃掉滤液，将HiBind DNA结合柱装回收集管，加入HB Buffer,室温下离心Imin,弃去滤液；将HiBind DNA结合柱装回收集管，加入DNA Wash Buffer,室温下离心lmin,弃去滤液；重复上述步骤一次,弃去滤液，将HiBind DNA结合柱装回收集管。
7.一种利用权利要求1所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌制备的预防副猪嗜血杆菌病的疫苗。`
8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于:其含有aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258- 181643位核苷酸的双基因缺失副猪嗜血杆菌。
【文档编号】C12N15/74GK103865834SQ201310518321
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】贾爱卿, 王贵平 申请人:广东海大畜牧兽医研究院有限公司