一种蝴蝶兰组培苗快速繁育的方法及真菌诱导子的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于蝴蝶兰组培苗快速繁育的方法及真菌诱导子，其通过保藏编号CGMCC?No.8018的丝核菌制备而成。采用本发明的真菌诱导子处理蝴蝶兰组培苗，无须添加任何人工激素，其鲜重增长量即可达到对照的4倍左右，如果将其按适当的浓度添加到该组培苗的生产中，将大大缩短其生产周期，节约大量的成本，应用前景十分广阔。
【专利说明】一种蝴蝶兰组培苗快速繁育的方法及真菌诱导子
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物和微生物领域，具体的涉及一种能够用于蝴蝶兰组培苗快速繁育的方法及真菌诱导子。
【背景技术】
[0002]组织培养技术已普及，它给生产者带来了最大的生产量和资源集约化，但是在继代培养中往往会由于激素累积过量和继代培养系数过高等原因造成了组培苗变异、玻璃化等现象的发生，这不仅使种苗不能保持克隆体的优良特性还造成了生产的浪费。真菌诱导子(Fungalelicitor)是来源于真菌细胞提取物或分泌物的一种特定的化学信号,在植物与真菌的相互作用中，能快速、高度专一和选择性的诱导植物特定基因的表达，进而活化特定次生代谢途径，积累特定目的的次生代谢产物。因其含有大量的几丁质、多糖、寡糖、多肽、脂肪酸、蛋白质、糖蛋白和糖脂等物质，可提高植物的生物量、次生代谢产物、多糖含量、酶活性等有效成分。迄今为止，已有许多证据表明，真菌对植物次生代谢的诱导属于防御反应的范畴。但并不是所有的真菌诱导子对某一次生代谢产物都会产生促进作用，有的甚至是抑制作用，诱导子种类、诱导子浓度、诱导子加入时间以及诱导的时间长短等多种因素都会密切地影响到诱导子的作用效果。随着兰科共生真菌为人们所认知，将真菌诱导子利用到组织培养中的优势也体现了出来。于是将真菌诱导子应用到兰科植物组织培养和细胞悬浮液培养中，以高效率地获得组培物和次生代谢产物，已成为学者们竟先开展的研究，这方面成功实例也很多。
[0003]蝴蝶兰Pha laenopsis在当今花卉市场中扮演着重要的角色，每年种苗的生产和销售十分乐观。然而，目前生产上常利用添加激素来提高蝴蝶兰组培苗的生长速率，但同时容易出现变异和玻璃化等现象，因此，如何获得一种能够有效促进蝴蝶兰组培苗生长的真菌诱导子是本领域的技术人员亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种丝核菌，其特征在于所述的丝核菌菌株保藏编号CGMCCN0.8018，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
[0005]本发明另一方面还涉及一种用于蝴蝶兰组培苗促生的真菌诱导子，其特征在于所述的真菌诱导子由上述丝核菌制备而成，优选的，所述的真菌诱导子制备方法包括如下步骤:所述丝核菌在PDA平板培养基上培养7d后用打孔器打孔，并将菌饼接种到预先分装、灭菌好的PDA液体培养基中，100-150r/min摇床震荡培养7d,待菌丝体充分生长后收获，用果汁机将菌丝体打碎后与菌液混合，灭菌后得。
[0006]本发明另一方面还涉及一种蝴蝶兰组培苗培养基，其特征在于所述的培养基中含有70-90ml/l上述真菌诱导子以及1/2MS培养基+2-4%蔗糖+0.4-0.8%琼脂。
[0007]采用本发明的真菌诱导子处理蝴蝶兰组培苗，无须添加任何人工激素，其鲜重增长量即可达到对照的4倍左右，如果将其按适当的浓度添加到该组培苗的生产中，将大大缩短其生产周期，节约大量的成本，应用前景十分广阔。
[0008]微生物信息
[0009]本发明所筛选的Y03丝核菌(Rhizoctoniasp.)真菌已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCN0.8018，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年08月12日。
【具体实施方式】
[0010]实施例1
[0011]I材料与方法
[0012]1.1 材料
[0013]选取具有I~2条根、4~5片叶、生长状况一致的蝴蝶兰Phalaenopsis组培苗。
[0014]1.2 方法 [0015]1.2.1真菌诱导子的配制
[0016]将从野生兰分离得到6个菌根真菌YOl~Y06在PDA平板培养基上培养7d后用直径为0.5cm的打孔器打孔，并将菌饼接种到预先分装、灭菌好的PDA液体培养基中，250ml每瓶，每瓶接种I个菌饼，120r/pm摇床震荡培养7d，待菌丝体充分生长后收获。用果汁机将菌丝体打碎后与菌液混合，121°C灭菌20min后备用。
[0017]1.2.2诱导子培养基的配制
[0018]以1/2MS培养基+3%蔗糖+0.6%琼脂为基础培养基，分别将Y01-06号真菌诱导子按40、60、80ml/l三个梯度分别添加到基础培养基中，不加真菌诱导子的基础培养基作为对照。
[0019]1.2.3测定项目和方法
[0020]接种前，在超净工作台上用万分之一电子天平精确称取组培苗的质量，然后接种到含不同浓度诱导子的培养基中，置于30001ux、12h/d的条件下培养，25°C、相对湿度70%-75%，每个处理接种30株，每瓶5株，共6瓶。90d后收获组培物，清水洗净根部的培养基后自然风干，然后用万分之一电子天平称取组培苗的鲜重，随后取样测定叶绿素a、叶绿素b和叶绿素(a+b)含量。
[0021]称取0.5000g左右的健康叶片，切碎，用25ml丙酮一乙醇溶液(V8cw _: V95still =1:1)避光浸提24h，u-2910型紫外可见分光光度计测量上清液在645、663nm波长下的吸光度A645、A663,以下列公式计算出叶绿素a、叶绿素b及叶绿素(a+b)的总含量。
[0022]Ca(mg/g) = (12.7IA663 — 2.59A645) V/1000w ；
[0023]Cb(mg/g) = (22.88A645 — 4.67A663) V/lOOOw ；
[0024]Ca+b (mg/g) = (8.04A663 + 20.29A645) V/lOOOw ;计算出叶绿素 a、叶绿素 b 及叶绿素(a+b)的总含量。
[0025]2结果:真菌诱导子对蝴蝶兰组培苗鲜重以及叶绿素含量的影响
[0026]真菌诱导子处理蝴蝶兰组培苗90d后，称取组培苗的鲜重。处理1、处理2等13个处理均能极显著地促进蝴蝶兰组培苗的生长，其中处理6、处理13、处理16和处理18的处理效果最佳，以处理6增长量最大，其鲜重增长量为0.2379g，接下来依次是处理16的鲜重增长量为0.2369g、处理18的鲜重增长量为0.2241g和处理13的鲜重增长量为0.2123(表I)。三个不同浓度的Y01、05和Y06均有利于组培苗鲜重的积累，并且最佳的处理浓度为40ml/l。处理10的鲜重增长量虽然低于CK，但与CK之间差异不显著。蝴蝶兰组培苗鲜重增长量的大小依次为:处理6>处理16>处理18>处理13>处理2>处理9>处理4>处理15>处理1>处理17>处理3>处理8>处理14>处理7>处理12>处理5>处理11，添加80ml/l的Y02、40ml/1或80ml/lY06、40ml/l的Y05最有利蝴蝶兰组培苗生物量的积累。
[0027]叶绿素含量是植物生长状态的一个反映，叶绿素含量a和叶绿素b含量的测定对植物的光合生理和逆境生理具有重要意义，测量叶绿素含量对了解真菌诱导子对植物体作用十分必要。经方差分析和多重比较(表2)，处理9、处理13的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b的含量极显著高于CK，其中处理13最明显，叶绿素a+b含量为0.2016mg/g,其次是处理9的叶绿素a+b含量为0.1922mg/g,处理10的叶绿素a、叶绿素a+b含量极显著于对照，而对叶绿素b无显著影响。处理16、处理18等的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量CK差异不显著。可见，处理13即添加量为40ml/l的Y05更利于蝴蝶兰组培苗光合能力的提高。光、温度、营养元素、氧、水等都会影响叶绿素的合成，添加真菌诱导子为组培苗提供了营养元素。
[0028]表1真菌 诱导子对蝴蝶兰组培苗鲜重增量影响的显著性分析
【权利要求】
1.一种丝核菌，其特征在于所述的丝核菌菌株保藏编号CGMCCN0.8018，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种用于蝴蝶兰组培苗促生的真菌诱导子，其特征在于所述的真菌诱导子由权利要求I所述丝核菌制备而成，优选的，所述的真菌诱导子制备方法包括如下步骤:所述丝核菌在PDA平板培养基上培养7d后用打孔器打孔，并将菌饼接种到预先分装、灭菌好的PDA液体培养基中，100-150r/min摇床震荡培养7d,待菌丝体充分生长后收获，用果汁机将菌丝体打碎后与菌液混合，灭菌后获得。
3.—种蝴蝶兰组培苗培养基，其特征在于所述的培养基中含有70-90ml/l权利要求2所述的真菌诱导子以及1/2MS培养基 +2-4%蔗糖+0.4-0.8%琼脂。
【文档编号】C12N1/14GK103642696SQ201310525288
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】陈金花, 尹俊梅, 杨光穗, 宋希强 申请人:中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所