一种兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种新发现的DNA序列，它可以作为启动子以光诱导的形式调控目的基因特异性地表达在植物地上部分的组织器官中。本发明从模式植物拟南芥中克隆了AtcpSecY2基因的启动子序列，随后在转基因拟南芥中证实，该启动子能够驱动GUS报告基因以光诱导的形式在植物地上部分的组织器官中特异性表达。应用本发明的启动子，构建获得“启动子-待表达的目的基因”融合基因，将其转化植物可获得兼具植物地上组织器官和光诱导特异性表达目的基因的转基因植物。这不仅有助于研究植物基因在光照条件下的转录调控表达模式，并应用于植物基因工程中使外源基因在光照条件下伴随着植物生理状态适度表达，同时准确有效地改变植物地上部分的光合特性和农艺性状，实现农作物的品系改良，具有广泛的应用价值。
【专利说明】一种兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体说是利用分子生物学技术获得一种兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子及其在转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002]启动子是位于结构基因上游、对RNA聚合酶进行识别、结合和开始转录的一段DNA序列，启动子就像“开关”一样，能够控制其下游结构基因转录的起始时间和强度。高等植物基因的表达调控是植物基因工程研究的中心内容之一，作为转录水平上一种重要的分子调控元件，对启动子的研究成为分子生物学的热点(王颖等，2003 ;李杰等，2006)。
[0003]根据植物中启动子启动转录的模式和功能可将其分为三类:组成型启动子、组织器官特异性启动子和诱导型启动子(王颖等，2003)。组成型启动子在所有组织中都能启动基因的表达，具有持续性，不表现时空特异性；组织器官特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中；诱导型启动子是在某些物理或化学信号的诱导下，可以促进目的基因强烈表达(王颖等，2003 ;路静等，2004)。
[0004]在组成型启动子中，目前使用最广泛的是花椰菜花叶病毒的dK 启动子、来自根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱合成酶基因Mxs启动子和章鱼碱合成酶基因6^5.启动子等(王颖等,2003 ;李杰等，2006)。如在单子叶植物中，Tsuchiya等(1996)发现CaMV 启动子和水稻启动子在百合的基因转化中都有高效的转录调控活性。在双子叶植物中，Sunilkumar等(2002)以CMfV 启动子驱动绿色荧光蛋白(GFP)基因在转基因棉花中表达。虽然利用组成型启动子驱动目的基因的表达对于基因的功能研究取得了一定的进展，但是由于组成型启动子会导致目的基因在植物所有组织中大量表达，过度消耗细胞内的物质和能量，因此在应用中存在很多的弊端(Gittins et al.，2000)。如使用组成型启动子会导致目的基因在整体植株中表达，产生大量的代谢产物，阻碍了植物的正常生长发育，不利于产量和品质的提高；有些表达产物甚至有毒，导致植株的死亡(Robinson, 1996; Gilmour et al., 2004; Qin et al., 2004; Savitch et al., 2005;Thomashow, 2010)。另外，重复使用组成型启动子驱动多个外源基因的表达可能引起基因沉默(Kumpatla et al.，1998)。因此，亟待需要寻找更为有效的组织器官特异性或诱导型启动子代替组成型启动子，以更好地调控植物基因的表达。
[0005]组织器官特异性或诱导型启动子由于其驱动目的基因的表达发生在某些特定的器官组织部位或其表达受外界刺激信号的诱导，所以在很大程度上可以克服组成型启动子在理论和应用研究中突显的种种缺陷。目前在许多植物中已经发现了这两类特异性启动子。如毛自朝等(2002)将番茄果实特异性启动子和目的基因构成的融合基因转入番茄，获得了无籽番茄果实。Mariani等(1990; 1992)将烟草花药绒毡层特异表达基因的启动子TA29与Barnase基因融合后转化植物核酸酶基因在花药中特异表达，获得了烟草和油菜的雄性不育材料，并进行了商业化应用。根据外源刺激或诱导物的不同，诱导型启动子又分为光、热、伤害、激素和病原菌等诱导型启动子。目前在植物中已发现了多种诱导型启动子，如向日葵热激蛋白基因启动子、马铃薯激素诱导型启动子和P69B、P69C假单胞菌诱导型启动子等(Xu et al., 1993; Coca et al., 1996; Jorda and Vera,2000)。
[0006]拟南芥属于十字花科，由于其个体形态小、生长周期短、繁殖能力强、基因组小和生物信息资源丰富等特点，成为植物遗传学、发育生物学和分子生物学研究的模式植物(张振桢等，2006)。植物的地上部分和地下部分处于不同的环境中，两者之间由维管束连接，存在着营养物质和信息的大量交换。地下部分根组织的活动依赖于地上部分所提供的光合产物、激素和维生素等；而地上部分叶片、枝条和花果等的生长活动则需要根系提供水分、矿质、氮素、激素和氨基酸等。光是影响植物生长发育最重要的环境因子之一，尤其对植物地上部分组织器官的生理特性和功能状态影响最大。植物的种子在土壤中萌发生长，伴随着幼苗出土的过程，地上部分逐渐适应光照，并且在光的诱导下，参与植物地上组织器官的生长发育，特别是参与绿色组织光合作用的基因强烈表达，通过光合作用为后续植物的生长、开花和结实提供最主要的物质和能量来源。因此，植物地上部分组织器官的生命活动与光照存在着紧密的联系。
[0007]目前还没有一种兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子，因此本领域迫切需要筛选和开发在光的诱导下植物地上组织器官特异性的启动子。获得并有效利用兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子不仅有助于研究植物基因在光照条件下的转录调控表达模式和调控机制，并应用于植物基因工程中使外源基因在光照条件下伴随着植物生理状态适度表达，同时准确有效地改变植物地上部分的光合特性和农艺性状，实现农作物的品系改良，以更好地调控植物的生长发育，具有广泛的应用价值。
【发明内容】
[0008]本发明目的是解决现有植物基因工程技术技术中，因使用组成型启动子，使外源基因在转基因植物中过量表达异源蛋白或代谢产物，使植物原有的代谢失衡，阻碍了植物的正常生长发育，甚至导致死亡，以及重复使用同一种组成型启动子驱动多个外源基因的表达可能引起基因沉默的问题。同时为深入研究植物基因在光照条件下的转录调控表达模式，并应用于植物基因工程中使外源基因在光照条件下伴随着植物生理状态适度表达，同时准确有效地改变植物地上部分的光合特性和农艺性状，实现农作物的品系改良，以更好地调控植物的生长发育，提供一种兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子及其在转基因植物中的应用。
[0009]本发明提供了一种新的、1851bp的兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子，该启动子核酸序列选自:
(a)如序列表1所示的核酸序列；
(b)在(a)限定的核酸序列中至少具有80%以上的同源性的核酸序列。
[0010]作为具体应用的实例，本发明提供了一种兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子的克隆方法，具体操作步骤如下:
第一、以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR方法扩增兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子；第二、回收PCR扩增产物；
第三、将上述第二步回收的扩增产物，与pMD-18载体(购自TaKaRa公司)在连接酶催化下进行连接反应；
第四、将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞；
第五、通过氨苄霉素抗性筛选，获得该启动子的阳性TA克隆。
[0011]本发明同时提供了兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子的应用，即:利用获得的兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子，构建“启动子-目的基因”的融合基因，进行植物转化，从而获得基因组中含有以上所述启动子核酸序列的、可以光诱导的形式在植物地上组织器官特异表达目的基因的转基因植物。其中所述的融合基因中的目的基因可以是任何针对基础研究、转化技术、植物地上部分的光合特性和农艺性状改良需要的目的基因。
[0012]作为具体应用的实例，本发明提供了一种“启动子-GUS报告基因”融合基因的构建及其在转基因拟南芥中以光诱导的形式在地上部分特异性表达。具体操作过程如下:
第一、用Z如I /Nco I双酶切含有兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子的TA克隆质粒，回收该特异性启动子片段；
第二、用I /Nco I双酶切pCAMBIA 1301 (购自CAMBIA公司)质粒，回收大的载体片段(其中含有报告基因的编码序列)；
第三、混合上述第一步得到的兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子片段和第二步得到的pCAMBIA 1301载体大片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA1301载体上的“兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子-GUS,,融合基因的构建。
[0013]其中所设计的兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入了油a I酶切位点，下游引物引入了 Afc0 I酶切位点:
上游引物:5 ’ -TCTAGACTTGTCGACAACTACTGATCCG-3，
下游引物:5’ -CCATGGCGAGAGGATGAGGAGAGAAA-3，
所述应用中的“启动子_^浴报告基因”在转基因拟南芥中以光诱导的形式在地上部分特异表达，操作过程如下:
拟南芥转化的具体方法，采用农杆菌介导的Floral dip的方法(Clough and Bent,1998)，获得的种子经过50 mg .L-1潮霉素抗性筛选，生长正常的抗性植株转土培养，利用组织化学染色的方法(Blume and Grierson, 1997),检测转基因拟南芥光诱导条件下和整个生长发育过程中各个组织器官中报告基因表达的特异性。
[0014]本发明的优点和积极效果: 本发明利用有效的兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子代替组成型启动子，可以用于构建在植物的地上组织器官中以光诱导的形式特异性表达目的基因的融合基因。利用遗传转化技术将其转入植物的基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得兼具植物地上组织器官和光诱导特异性表达目的基因的转基因植物。这不仅有助于研究植物基因在光照条件下的转录调控表达模式和调控机制，并应用于植物基因工程中使外源基因在光照条件下伴随着植物生理状态适度表达，同时准确有效地改变植物地上部分的光合特性和农艺性状，实现农作物的品系改良，以更好地调控植物的生长发育，具有广泛的应用价值。【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子克隆的电泳检测图。
[0016]图2是拟南芥“兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子”转基因拟南芥植株的PCR鉴定。
[0017]图3是“兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子”转基因拟南芥植株在光诱导条件下的GUS染色结果。
[0018]图4是“兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子”转基因拟南芥植株的各个器官个发育过程中GUS染色结果。
【具体实施方式】
[0019]实施例1:兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子的克隆
第一、以拟南芥基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增1851bp的兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子，回收扩增产物并进行TA克隆。
[0020](I)PCR扩增目的片段:
①根据已知的拟南芥基因启动子区的序列设计特异引物，在上游引物中引KXba I酶切位点，在下游引物中引入Afco I酶切位点。
[0021]上游引物:5’-TC TAGACTTGTCGACAACTACTGATCCG-3> (引入油a I 酶切位点)
下游引物:5’ -CCATGGCGAGAGGATGAGGAGAGAAA-3，(引入AfcoI 酶切位点)
②按常规方法提取拟南芥基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子片段。
[0022]PCR反应程序:
94 0C 3分钟；
940C 30 秒，560C 30 秒，72°C 2 分，32 个循环；
72 V 10分钟；
4 C保温。
[0023]PCR反应体系:
【权利要求】
1.一种兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子，其核酸序列选自: (a)如序列表1所示的核酸序列； (b)在(a)限定的核酸序列中至少具有80%以上的同源性的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子，其特征在于，所设计的拟南芥兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子的PCR扩增引物如下，其中上游引物中引入了油a I酶切位点，下游引物中引入了 Afc0 I酶切位点:
上游引物:5 ’ -TCTAGACTTGTCGACAACTACTGATCCG-3，
下游引物:5’ -CCATGGCGAGAGGATGAGGAGAGAAA-3，。
3.根据权利要求1所述的兼具植物地上组织器官和光诱导特异性的启动子，其特征在于，从拟南芥基因组DNA中克隆获得兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子，具体操作步骤如下: (1)以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR方法扩增兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子； (2)回收PCR扩增产物； (3)将上述⑵步回收的扩增产物，与PMD-18T在连接酶催化下进行连接反应； (4)将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞； (5)通过抗性筛选，获 得该启动子的阳性TA克隆。
4.一种权利要求1所述的兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子的应用，其特征在于，利用该启动子构建获得启动子-目的基因的融合基因，将其转化拟南芥或其他植物，从而获得基因组中含有权利要求1所述启动子核酸序列的、可在植物的地上部分组织器官中以光诱导的形式特异性表达相应目的基因的转基因植物。
5.一种权利要求1所述的兼具植物地上组织器官和光诱导特异性启动子的应用，其特征在于，利用该启动子构建获得启动子融合基因，在植物地上组织器官中驱动报告基因以光诱导的形式特异性地表达相应的目的基因。
【文档编号】C12N15/10GK103589725SQ201310540693
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】刘栋, 李卫春, 马利霞, 程建峰, 候玲 申请人:江西农业大学