一种下调微小rna-126表达的方法
【专利摘要】本发明公开了一种下调微小RNA-126表达的方法，它明利用分子生物学技术，在含CMV启动子的真核载体基础上，构建含miR-126-sponge的真核表达载体，实现下调miR-126的表达；并通过将该载体体外转染真核细胞后，利用荧光定量PCR仪检测miR-126成熟体的表达，同时通过体外实验观察下调miR-126表达后的生物学效应。这样的方法不仅可以方便、快速、长效地下调miR-126的表达，同时还可快捷地观察miR-126下调表达后的生物学效应。不仅适于细胞的转染，也可用于整体水平转基因动物的制作。
【专利说明】—种下调微小RNA-126表达的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生命科学领域，尤其是一种下调微小RNA-126表达的方法。
【背景技术】
[0002]微小RNA-126 (microRNA-126，miR-126)具有重要的生物学作用。目前，改变miR-126的表达，从而研究其生物学功能的技术主要有慢病毒载体表达的miR-126海绵体(Sponge)、反义核酸(Antisense oligonucleotides, AS0)、抑制剂(Inhibitor)和Antagomir等。然而,这些方法存在作用时间短、稳定性差、构建复杂、仪器条件要求高且技术操作复杂的不足，难以达到方便、简单而有效地下调miR-126表达的效果。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:提供一种下调微小RNA-126表达的方法，它方法设计简单，操作容易，能简单而有效地下调miR-126表达的效果，以克服现有技术的不足。
本发明是这样实现的:下调微小RNA-126表达的方法，在含CMV启动子的真核载体上构建革El向miR-126的真核表达载体pEGFP-C2-miR-126_sponge,以下调miR-126在真核细胞中的表达；并将该载体体外转染真核细胞后，利用荧光定量PCR仪检测miR-126成熟体的表达，同时通过体外实验观察下调miR-126表达后的生物学效应。
所述的pEGFP-C2-miR-126_sponge的构建，具体是,利用软件完成miR-126-sponge的序列设计；再用Hind III/KpnI双酶切骨架载体pEGFP_C2、目的片段miR-126-sponge，回收片段纯化，在16°C的条件下过夜连接；连接后转化，挑取6个菌落，接种到含lOμg/ml卡那霉素的LB培养基中，12小时后提取菌液和质粒小抽法抽提质粒，并通过引物实现目的片段的PCR扩增，扩增目的片的引物序列为:上游，5 ’ -ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3 ’ ；下游，5’ -GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC-3’ ；重组质粒经Hind III和KpnI双酶切后，成功构建重组质粒 pEGFP-C2-miR-126_sponge。
由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明利用分子生物学技术，在含CMV启动子的真核载体基础上，构建含miR-126-sponge的真核表达载体,实现下调miR-126的表达；并通过将该载体体外转染真核细胞后，利用荧光定量PCR仪检测miR-126成熟体的表达，同时通过体外实验观察下调miR-126表达后的生物学效应。这样的方法不仅可以方便、快速、长效地下调miR-126的表达，同时还可快捷地观察miR-126下调表达后的生物学效应。不仅适于细胞的转染，也可用于整体水平转基因动物的制作。
【专利附图】
【附图说明】:
图1为本发明的实施例的miR-126-sponge序列的设计原理图；
图2为本发明的实施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表达载体构建示意图；图中:MCS,多克隆位点(Multiple clone sites) ;SV40，猴空泡病毒 40 (Simianvirus 40) ;EGFP,增强型绿色突光蛋白(Enhanced green fluorescent protein) ；Kanr,卡那霉素抗性(Kanamycin resistance) ;HSV,单纯疱疫病毒(Herpes simplex virus )；Puc Ori,复制起始位点(origin of replicat1n) ; Pcmv,人巨细胞病毒启动子(Humancytomegalovirus promoter)；
图3为本发明的实施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表达载体构建过程中的克隆菌液PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳；
图3中，1-6代表小量抽提的重组质粒，M代表电泳marker ；
图4为本发明的实施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表达载体构建过程中的重组质粒PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳；
图4中，1-6代表小量抽提的重组质粒，M代表电泳marker。
图5为本发明的实施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表达载体构建过程中的重组质粒双酶切；
图5中，I为未酶切重组质粒，2为HindIII和KpnI双酶切重组质粒，M代表电泳marker ；
图6为本发明的实施例的pEGFP-C2-mi R-126-sponge真核表达载体构建过程中的重组质粒测序结果；
图7为本发明的实施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表达载体转染真核细胞后，miR-126表达水平检测；
图8为本发明的实施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表达载体转染真核细胞后，miR-126生物学效应的光镜检测；
图9为本发明的实施例的pEGFP-C2-miR-126-Sp0nge真核表达载体转染真核细胞后，miR-126生物学效应的MTT实验检测。
【具体实施方式】:
本发明的实施例:下调微小RNA-126表达的方法，
1)首先在miRBase数据库中检索出hsaniR-126的序列,miR-126正义序列:5’_CATTATTACTTTTGGTACGCGCTGTGACACTTCAAACTCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3’ ；miR-126 反义序列:5’ -CGCATTATTACTCACGGTACGAGTTTGA AGTGTCACAGCGCGTACCAAAAGTAATAATG-3’，将 miR-126反义序列中 CTCA 转换成 GGT ；GTTT 突变成 CGCG，截取 5，-CGCATTATTAGGTCGGTACGACGCG-3，，把6个这样的相同片段串联起来，最终miR-126-sponge序列为5’-CGCATTATTAGGTCGGTACGACGCGCGCA TTATTAGGTCGGTACGACGCGCGCATTATTAGGTCGGTACGACGCGCGCATTATTAGGTCGGTACGACGCGCGCATTATTAGGTCGGTACGACGCGCGCATTATTAGGTCGGTACGA-3’，最后在 5’端加上 Hind III 酶切位点，3’端加上KpnI酶切位点，miR-126-sponge序列设计完成,如图1所示；
2)用HindIII /KpnI双酶切骨架载体pEGFP_C2、目的片段miR-126-sponge，回收片段纯化，16 0C过夜连接，连接后转化，挑取6个菌落，接种到含10 μ g/ml卡那霉素的LB培养基中；12小时后提取菌液和质粒小抽法抽提质粒，利用PCR实验，通过引物成功扩增目的片段(图3、4)，引物序列:上游，5’ -ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’ ；下游，5’ -GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC-3’ ；
3)重组质粒经HindIII和KpnI双酶切后，电泳鉴定，并测序(图4、5)，测序结果如序列表1所示，成功构建重组质粒pEGFP-C2-miR-126-sponge，命名为p-miR-126-sp (对应的PEGFP-C2命名为p-Cont)，如图2所示；
4)将质粒p-miR-126-sponge大量抽提后，鉴定纯度和浓度，结果显示，0D260/280=!.56，浓度为 128 mg/L, _80°C保存；5)常规培养人肝癌细胞株H印G2细胞，按3X 105/ml的细胞密度接种于6孔板中，将10Ug 质粒 p-miR-126-sponge 和对照质粒 p-Cont (pEGFP_C2)体外分别利用 Lipofectamine2000瞬时转染细胞，继续在5% C02、37°C条件下培养；48小时后，抽取各组细胞总RNAjlJ用Realtime PCR探针法检测miR-126表达水平，结果显示，p-miR-126-sponge转染组中，miR-126表达水平明显下调(图4),提不该载体可以显者下调miR-126的表达；
6)我们进一步检测了各转染组中HepG2细胞生长的变化，如图5、图6所示，培养72小时后，与p-Cont转染组相比，p-miR-126-sponge载体转染组中HepG2细胞的生长明显减弱(p〈0.05)，提示miR-126表达水平下调后，可显著削弱肿瘤细胞体外生长，结果表明，含CMV启动子的miR-126-sponge真核表达载体不仅可以下调miR-126在真核细胞中的表达，同时，我们也可通过体 外转染观察miR-126下调表达后的生物学效应。
【权利要求】
1.一种下调微小RNA-126表达的方法,其特征在于:在含CMV启动子的真核载体上构建革El向miR-126的真核表达载体pEGFP-C2-miR-126_sponge,以下调miR-126在真核细胞中的表达；且将该载体体外转染真核细胞后，利用荧光定量PCR仪检测miR-126成熟体的表达，通过体外实验观察下调miR-126表达后的生物学效应。
2.根据权利要求1所述的下调微小RNA-126表达的方法，其特征在于:所述的pEGFP-C2_mi R-126-sponge的构建，具体是，利用软件完成miR-126-sponge的序列设计；再用Hind III/KpnI双酶切骨架载体pEGFP_C2、目的片段miR-126-sponge，回收片段纯化，在16 °C条件下过夜连接；连接后转化，挑取6个菌落，接种到含lOμg/ml卡那霉素的LB培养基中，12小时后提取菌液和质粒小抽法抽提质粒，并通过引物实现目的片段的PCR扩增，扩增目的片的引物序列为:上游，5 ’ -ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3 ’ ；下游，5’ -GATCTTGAAGTTCACCTTGATGC-3’ ；重组质粒经Hind III和KpnI双酶切后，成功构建重组质粒 pEGFP-C2-mi R-126_sponge。
【文档编号】C12Q1/68GK104031980SQ201310543832
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】徐林, 胡燕, 周涯, 李永菊, 廖珍媛 申请人:遵义医学院