一种bhk-21细胞全悬浮培养的无血清培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，所述BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基中，包含有氨基酸部分，维生素部分，无机盐部分和其他添加物部分。本发明的有益效果为：本发明提供的一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，该培养基培养细胞密度高，成分明确，不含动物血清，有利于下游产品的纯化，提高产品品质，且配制和使用方便，适用于生物制品的规模化生产。
【专利说明】—种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种无血清培养基，具体涉及一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基。
【背景技术】
[0002]BHK-21细胞即叙利亚仓鼠肾细胞,英文名称:Baby Hamster Kidney cell简称BHK-21或BHK21，该细胞系于1961年由Macpherson IA,Stoker MGP建系，源自5只未辨性别的I天龄仓鼠肾，1963年进行了单细胞克隆。原始的细胞株是成纤维细胞，贴壁依赖性生长，但后来经无数次传代驯化后可悬浮生长并用于病毒性疫苗的生产，如口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、乙脑疫苗等。采用无血清培养工艺将提高疫苗的品质，主要表现在以下几个方面:I)工艺中不再使用动物血清(传统工艺生产疫苗时培养基中要添加牛血清)，降低了疫苗注射时引起动物的副反应，提高疫苗的安全性；2)基质细胞的无血清全悬浮培养工艺，生产规模可线性放大,细胞单罐培养体积的增加,可提高疫苗产品的稳定性；3)基质细胞的无血清全悬浮培养工艺将采用成套的生物反应器及培养技术，实现了程序化可控的工艺操作流程，降低了人为因素对产品的影响。然而无血清培养基是该工艺的实现产业化的技术难点，采用成分明确、细胞能高细胞的培养密度，而且还有较高的病毒表达量，将起到事半功倍的效果。现有技术中，国外细胞无血清培养基配方保密且价格高，同时市场上已有培养基(国内、国外)成分均不明确。
【发明内容】
[0003]本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种低成本、成分明确的适用于BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基。
[0004]为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，所述BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基中，各原料物质的终浓度为:
氨基酸部分:
L-丙氨酸200-300 mg/L,
L-精氨酸盐酸盐350-500 mg/L,
L-天冬酰胺200-300 mg/L,
L-天冬氨酸50-85 mg/L,
L-半胱氨酸一水合物 10-45 mg/L,
L-胱氨酸盐酸盐25-50 mg/L,
L-谷氨酸100-155 mg/L,
L-谷氨酰胺300-405 mg/L,
甘氨酸150-200 mg/L,
L-组氨酸盐酸盐155-200 mg/L,
L-异亮氨酸100-150 mg/L,L-亮氨酸150-180 mg/L,
L-赖氨酸盐酸盐150-250 mg/L,
L-蛋氨酸45-80 mg/L,
L-苯丙氨酸20-50 mg/L,
L-脯氨酸100-125 mg/L,
L-丝氨酸200-250 mg/L,
L-苏氨酸100-150 mg/L,
L-色氨酸150-190 mg/L,
L-酪氨酸二钠盐50-90 mg/L,
L-缴氨酸100-135 mg/L,维生素部分:
生物素0.001-0.005 mg/L,``氯化胆碱5-15 mg/L,
D-泛酸?丐2-5 mg/L,
叶酸2-5 mg/L,
烟酰胺2-5 mg/L,
盐酸批B多醇2-5 mg/L,
核黄素0.1-0.5 mg/L,
盐酸硫胺素0.1-0.5 mg/L,
肌醇10-15 mg/L,
无机盐部分:
无水氯化1丐100-125 mg/L,
氯化钾300-350 mg/L,
氯化镁25-35 mg/L,
无水硫酸镁30-40 mg/L,
氯化钠5000-7200 mg/L,
磷酸二氢钠50-70 mg/L,
磷酸氢二钠60-70 mg/L,
七水硫酸亚铁0.1-0.5 mg/L,
七水硫酸锌0.1-0.5 mg/L,
其余添加物部分:
D-葡萄糖3000-5000 mg/L,
丙酮酸钠100-150 mg/L,
亚油酸0.01-0.1 mg/L,
大豆卵磷脂5-10 mg/L,
胆固醇2-5 mg/L,
硫辛酸0.1-0.5 mg/L,
胸苷0.1-0.5 mg/L,
腺嘌呤1-5 mg/L,胸腺嘧啶0.01-0.1 mg/L,
重组胰岛素5-20 mg/L,
转铁蛋白5-20 mg/L,
酵母粉100-500 mg/L,
酚红钠盐8-10 mg/L ο
[0005]PF-68100_500mg/L,
Ant1-Clumping100-500 mg/L。
[0006]进一步的，上述的一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，所述BHK-21细胞
全悬浮培养的无血清培养基中，各原料物质的终浓度为:
氨基酸部分:
L-丙氨酸213.1 mg/L，
L-精氨酸盐酸盐372.75 mg/L,
L-天冬酰胺153.5 mg/L,
L-天冬氨酸75.6`5 mg/L,
L-半胱氨酸一水合物 22.71 mg/L,
L-胱氨酸盐酸盐31.29 mg/L,
L-谷氨酸109.4 mg/L,
L-谷氨酰胺365 mg/L,
甘氨酸178.75 mg/L,
L-组氨酸盐酸盐177.64 mg/L,
L-异亮氨酸134 mg/L,
L-亮氨酸159.05 mg/L,
L-赖氨酸盐酸盐169.87 mg/L,
L-蛋氨酸63.37 mg/L,
L-苯丙氨酸35.48 mg/L,
L-脯氨酸103.75 mg/L,
L-丝氨酸200 mg/L,
L-苏氨酸113.45 mg/L,
L-色氨酸171.02 mg/L,
L-酪氨酸二钠盐55.79 mg/L,
L-缴氨酸117.23 mg/L,
维生素部分:
生物素0.0042 mg/L (国药试剂，67000260)，
氯化胆碱8.98 mg/L,
D-泛酸钙2.73 mg/L,
叶酸2.65 mg/L,
烟酰胺2.02 mg/L,
盐酸吡哆醇2.03 mg/L,
核黄素0.22 mg/L,盐酸硫胺素0.2 mg/L,
肌醇12.6 mg/L,
无机盐部分:
无水氯化1丐116.69 mg/L,
氯化钾311.8 mg/L,
氯化镁28.64 mg/L,
无水硫酸镁30-80 mg/L,
氯化钠6995.5 mg/L,
磷酸二氢钠62.5 mg/L,
磷酸氢二钠60-100 mg/L,
七水硫酸亚铁0.42 mg/L,
七水硫酸锌0.432 mg/L,
其余添加物部分:
D-葡萄糖4500 mg/L,
丙酮酸钠115 mg/L,`
亚油酸0.036 mg/L,
大豆卵磷脂6.1 mg/L,
胆固醇3.2 mg/L,
硫辛酸0.26 mg/L,
胸苷0.27 mg/L,
腺嘌呤3.1 mg/L,
胸腺嘧啶0.065 mg/L,
重组胰岛素5.6 mg/L,
转铁蛋白11.4 mg/L,
酵母粉300 mg/L,
酹红钠盐9.3 mg/L,
PF-68301 mg/L,
Ant1-Clumping328 mg/L。
[0007]进一步的，上述的一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，将所述原料物质根据其各自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于10°C -30°C蒸馏水中混合，使各原料物质终浓度如上所述，调节所得混合液的PH值至7.1-7.4，定容后即得BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基。
[0008]进一步的，上述的一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，将所述原料物质混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10°c -30°c蒸馏水中溶解，使各原料物质终浓度如上所述，调节所得混合液的PH值至7.1-7.4，定容后即得BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基。
[0009]本发明的有益效果为:本发明提供的一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，该培养基培养细胞密度高，成分明确，不含动物血清，有利于下游产品的纯化，提高产品品质，且配制和使用方便，适用于生物制品的规模化生产。【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为本发明提供的BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基与现有市售的市售的BHK-21细胞无血清培养基在细胞活力和细胞密度方面的对比结果示意图。
【具体实施方式】
[0011]实施例1:
一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，原料物质根据其各自溶解特性分类溶
解，然后将所得溶液于23.1°C混合，使各原料物质终浓度如上所述，调节所得混合液的pH值至7.15，定容后即得BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，其中，各原料物质的终浓度为:
氨基酸部分:
L-丙氨酸200 mg/L,
L-精氨酸盐酸盐350 mg/L,
L-天冬酰胺200 mg/L,
L-天冬氨酸50 mg/L,
L-半胱氨酸一水合物10 mg/L,
L-胱氨酸盐酸盐25 mg/L,
L-谷氨酸100 mg/L,
L-谷氨酰胺300 mg/L,
甘氨酸150 mg/L,
L-组氨酸盐酸盐155 mg/L,
L-异亮氨酸100 mg/L,
L-亮氨酸150 mg/L,
L-赖氨酸盐酸盐150 mg/L,
L-蛋氨酸45 mg/L,
L-苯丙氨酸20 mg/L,
L-脯氨酸100 mg/L,
L-丝氨酸200 mg/L,
L-苏氨酸100 mg/L,
L-色氨酸150 mg/L,
L-酪氨酸二钠盐50 mg/L,
L-缴氨酸100 mg/L,
维生素部分:
生物素0.001 mg/L,
氯化胆碱5 mg/L,
D-泛酸|丐2 mg/L,
叶酸2 mg/L,
烟酰胺2 mg/L,盐酸吡哆醇2 mg/L,
核黄素0.1 mg/L,
盐酸硫胺素0.1 mg/L,
肌醇10 mg/L,
无机盐部分:
无水氯化1丐100 mg/L,
氯化钾300 mg/L,
氯化镁25 mg/L,
无水硫酸镁30 mg/L,
氯化钠5000 mg/L,
磷酸二氢钠50 mg/L,
磷酸氢二钠60 mg/L,
七水硫酸亚铁0.1 mg/L,
七水硫酸锌0.1 mg/L,
其余添加物部分:`
D-葡萄糖3000 mg/L,
丙酮酸钠100 mg/L,
亚油酸0.01 mg/L,
大豆卵磷脂5 mg/L,
胆固醇2 mg/L,
硫辛酸0.1 mg/L,
胸苷0.1 mg/L,
腺嘌呤I mg/L，
胸腺嘧啶0.01 mg/L,
重组胰岛素5 mg/L,
转铁蛋白5 mg/L,
酵母粉100 mg/L,
酹红钠盐8 mg/L,
PF-68265 mg/L,
Ant1-Clumping170 mg/L。
[0012] 实施例2:
一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，原料物质根据其各自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于25.9°C混合，使各原料物质终浓度如上所述，调节所得混合液的pH值至7.21，定容后即得BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，其中，各原料物质的终浓度为:
氨基酸部分:
L-丙氨酸300 mg/L,
L-精氨酸盐酸盐500 mg/L,
L-天冬酰胺300 mg/L,L-天冬氨酸85 mg/L,
L-半胱氨酸一水合物 45 mg/L,
L-胱氨酸盐酸盐50 mg/L,
L-谷氨酸155 mg/L,
L-谷氨酰胺405 mg/L,
甘氨酸200 mg/L,
L-组氨酸盐酸盐200 mg/L,
L-异亮氨酸150 mg/L,
L-亮氨酸180 mg/L,
L-赖氨酸盐酸盐250 mg/L,
L-蛋氨酸80 mg/L,
L-苯丙氨酸50 mg/L,
L-脯氨酸125 mg/L,
L-丝氨酸250 mg/L,`
L-苏氨酸150 mg/L,
L-色氨酸190 mg/L,
L-酪氨酸二钠盐90 mg/L,
L-缴氨酸135 mg/L,维生素部分:
生物素0.005 mg/L,
氯化胆碱15 mg/L,
D-泛酸|丐5 mg/L,
叶酸5 mg/L,
烟酰胺5 mg/L,
盐酸批B多醇5 mg/L,
核黄素0.5 mg/L,
盐酸硫胺素0.5 mg/L,
肌醇15 mg/L,无机盐部分:
无水氯化125 mg/L,
氯化钾350 mg/L,
氯化镁35 mg/L,
无水硫酸镁40 mg/L,
氯化钠7200 mg/L,
磷酸二氢钠70 mg/L,
磷酸氢二钠70 mg/L,
七水硫酸亚铁0.5 mg/L,
七水硫酸锌0.5 mg/L,
其余添加物部分:D-葡萄糖5000 mg/L,
丙酮酸钠150 mg/L,
亚油酸0.1 mg/L,
大豆卵磷脂10 mg/L,
胆固醇5 mg/L,
硫辛酸0.5 mg/L,
胸苷0.5 mg/L,
腺嘌呤5 mg/L,
胸腺嘧啶0.1 mg/L,
重组胰岛素20 mg/L,
转铁蛋白20 mg/L,
酵母粉500 mg/L,
酹红钠盐10 mg/L,
PF-68155 mg/L,` Ant1-Clumping190 mg/L。
[0013] 实施例3:
一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，将原料物质混合后磨成细粉，然后将所得细粉于25.3°C蒸馏水中溶解，使各原料物质终浓度如上所述，调节所得混合液的pH值至7.23，定容后即得BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，其中，各原料物质的终浓度为:氨基酸部分:
L-丙氨酸213.1 mg/L，
L-精氨酸盐酸盐372.75 mg/L,
L-天冬酰胺153.5mg/L，
L-天冬氨酸75.65 mg/L,
L-半胱氨酸一水合物 22.71mg/L，
L-胱氨酸盐酸盐31.29mg/L，
L-谷氨酸109.4 mg/L,
L-谷氨酰胺365 mg/L,
甘氨酸178.75 mg/L,
L-组氨酸盐酸盐177.64 mg/L,
L-异亮氨酸134 mg/L,
L-亮氨酸159.05 mg/L,
L-赖氨酸盐酸盐169.87 mg/L,
L-蛋氨酸63.37 mg/L,
L-苯丙氨酸35.48 mg/L,
L-脯氨酸103.75 mg/L,
L-丝氨酸200 mg/L,
L-苏氨酸113.45 mg/L,
L-色氨酸171.02 mg/L,L-酪氨酸二钠盐55.79 mg/L,
L-缴氨酸117.23 mg/L, 维生素部分:
生物素0.0042 mg/L,
氯化胆碱8.98 mg/L,
D-泛酸钙2.73 mg/L,
叶酸2.65 mg/L,
烟酰胺2.02 mg/L,
盐酸吡哆醇2.03 mg/L,
核黄素0.22 mg/L,
盐酸硫胺素0.2 mg/L,
肌醇12.6 mg/L, 无机盐部分:
无水氯化1丐116.69 mg/L,
氯化钾311.8 mg/L,
`氯化镁28.64 mg/L,
无水硫酸镁48.84mg/L,
氯化钠6995.5 mg/L,
磷酸二氢钠62.5 mg/L,
磷酸氢二钠71.02 mg/L,
七水硫酸亚铁0.42 mg/L,
七水硫酸锌0.432 mg/L, 其余添加物部分:
D-葡萄糖4500 mg/L,
丙酮酸钠115 mg/L,
亚油酸0.036 mg/L,
大豆卵磷脂6.1 mg/L,
胆固醇3.2 mg/L,
硫辛酸0.26 mg/L,
胸苷0.27 mg/L,
腺嘌呤3.1 mg/L,
胸腺嘧啶0.065 mg/L,
重组胰岛素5.6 mg/L,
转铁蛋白11.4 mg/L,
酵母粉300 mg/L,
酹红钠盐9.3 mg/L,
PF-68301 mg/L,
Ant1-Clumping328 mg/L。
[0014]培养验证过程:1、仪器设备:
生物反应器，型号:BIOSTATEOR B plus (德国Sartorius)，培养罐体积5L
2、细胞:
全悬浮培养型BHK-21细胞，由甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供。
[0015]3、培养方法:
将全悬浮培养型BHK-21细胞以5.0X IO5 cells/ml接种到生物反应器中，反应器参数设置为:温度37°C，转速90rpm/min，溶氧60%，pH值7.25。每24h取样计数和检查细胞活力。
[0016]4、培养结果如表1所不。
【权利要求】
1.一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基中，各原料物质的终浓度为: 氨基酸部分: L-丙氨酸200-300 mg/L, L-精氨酸盐酸盐350-500 mg/L, L-天冬酰胺200-300 mg/L, L-天冬氨酸50-85 mg/L, L-半胱氨酸一水合物 10-45 mg/L, L-胱氨酸盐酸盐25-50 mg/L, L-谷氨酸100-155 mg/L, L-谷氨酰胺300-405 mg/L, 甘氨酸150-200 mg /L, L-组氨酸盐酸盐155-200 mg/L, L-异亮氨酸100-150 mg/L, L-亮氨酸150-180 mg/L, L-赖氨酸盐酸盐150-250 mg/L, L-蛋氨酸45-80 mg/L, L-苯丙氨酸20-50 mg/L, L-脯氨酸100-125 mg/L, L-丝氨酸200-250 mg/L, L-苏氨酸100-150 mg/L, L-色氨酸150-190 mg/L, L-酪氨酸二钠盐50-90 mg/L, L-缴氨酸100-135 mg/L, 维生素部分: 生物素0.001-0.005 mg/L, 氯化胆碱5-15 mg/L, D-泛酸?丐2-5 mg/L, 叶酸2-5 mg/L, 烟酰胺2-5 mg/L, 盐酸批B多醇2-5 mg/L, 核黄素0.1-0.5 mg/L, 盐酸硫胺素0.1-0.5 mg/L, 肌醇10-15 mg/L, 无机盐部分: 无水氯化钙100-125 mg/L, 氯化钾300-350 mg/L, 氯化镁25-35 mg/L, 无水硫酸镁30-40 mg/L,氯化钠5000-7200 mg/L, 磷酸二氢钠50-70 mg/L, 磷酸氢二钠60-70 mg/L, 七水硫酸亚铁0.1-0.5 mg/L, 七水硫酸锌0.1-0.5 mg/L, 其余添加物部分: D-葡萄糖3000-5000 mg/L, 丙酮酸钠100-150 mg/L, 亚油酸0.01-0.1 mg/L, 大豆卵磷脂5-10 mg/L, 胆固醇2-5 mg/L, 硫辛酸0.1-0.5 mg/L, 胸苷0.1-0.5 mg/L, 腺嘌呤1-5 mg/L, 胸腺嘧啶0.01-0.1 mg/L, 重组胰岛素5-20 mg/L, 转铁蛋白5-20 mg/L, 酵母粉100-500 mg/L, 酚红钠盐8-10 mg/L, PF-68100-500mg/L, Ant1-Clumping100-500 mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，所述BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基中，各原料物质的终浓度为: 氨基酸部分: L-丙氨酸213.1 mg/L， L-精氨酸盐酸盐372.75 mg/L, L-天冬酰胺153.5 mg/L, L-天冬氨酸75.65 mg/L, L-半胱氨酸一水合物 22.71 mg/L, L-胱氨酸盐酸盐31.29 mg/L, L-谷氨酸109.4 mg/L, L-谷氨酰胺365 mg/L, 甘氨酸178.75 mg/L, L-组氨酸盐酸盐177.64 mg/L, L-异亮氨酸134 mg/L, L-亮氨酸159.05 mg/L, L-赖氨酸盐酸盐169.87 mg/L, L-蛋氨酸63.37 mg/L, L-苯丙氨酸35.48 mg/L,L-脯氨酸103.75 mg/L,L-丝氨酸200 mg/L,L-苏氨酸113.45 mg/L,L-色氨酸171.02 mg/L,L-酪氨酸二钠盐55.79 mg/L,L-缴氨酸117.23 mg/L,维生素部分:生物素0.0042 mg/L,氯化胆碱8.98 mg/L,D-泛酸钙2.73 mg/L,叶酸2.65 mg/L,烟酰胺2.02 mg/L,盐酸吡哆醇2.03 mg/L,核黄素0.22 mg/L,盐酸硫胺素0.2 mg/L,肌醇 12.6 mg/L,无机盐部分:无水氯化1丐116.69 mg/L,氯化钾311.8 mg/L,氯化镁28.64 mg/L,无水硫酸镁30-80 mg/L,氯化钠6995.5 mg/L,磷酸二氢钠62.5 mg/L,磷酸氢二钠60-100 mg/L,七水硫酸亚铁0.42 mg/L,七水硫酸锌0.432 mg/L,其余添加物部分:D-葡萄糖4500 mg/L,丙酮酸钠115 mg/L,亚油酸0.036 mg/L,大豆卵磷脂6.1 mg/L,胆固醇3.2 mg/L,硫辛酸0.26 mg/L,胸苷0.27 mg/L,腺嘌呤3.1 mg/L,胸腺嘧啶0.065 mg/L,重组胰岛素5.6 mg/L,转铁蛋白11.4 mg/L,酵母粉300 mg/L,酹红钠盐9.3 mg/L, PF-68301 mg/L, Ant1-Clumping328 mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，将所述原料物质根据其各自溶解特性分类溶解，然后将所得溶液于10°c -30°c蒸馏水中混合，使各原料物质终浓度如权利要求1或2所述，调节所得混合液的pH值至7.1-7.4，定容后即得BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基。
4.根据权利要求1或2所述的一种BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基，其特征在于，将所述原料物质混合后磨成细粉，然后将所得细粉于10°C _30°C蒸馏水中溶解，使各原料物质终浓度如权利要求1或2所述，调节所得混合液的pH值至7.1-7.4，定容后即得BHK-21细胞全悬浮培养的无血清培养基。
【文档编号】C12N5/02GK103555658SQ201310546756
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】令世鑫, 马忠仁, 李明生, 冯若飞, 王家敏, 马祺, 冯玉萍, 乔自林 申请人:令世鑫, 马忠仁, 李明生, 冯若飞, 王家敏, 马祺, 冯玉萍, 乔自林