一种纳豆激酶生产方法
【专利摘要】本发明公开了属于微生物【技术领域】的一种纳豆激酶的生产方法。以大豆粉及玉米淀粉为原料，采用液体发酵技术，发酵罐发酵：发酵温度35-42℃，pH控制在6.8-7.2，纳豆芽孢杆菌接种量为2%-5%，通气量为10-25L/min，发酵时间不超过24h，得到的浓缩液经真空冷冻干燥后得到纳豆激酶粉末。本发明使用的大豆粉和玉米淀粉，原料来源广泛，二者搭配使用保证了菌种的营养需求，而且发酵周期短，不超过24h，发酵液纳豆激酶酶活高，达到30-40万U/mL，能有效的降低生产成本，同时采用的提纯和干燥技术也有利于该生产方法的工业化生产。
【专利说明】一种纳豆激酶生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，特别涉及一种纳豆激酶的生产方法。具体说，利用纳豆芽孢杆菌及液体发酵工艺生产纳豆激酶。
【背景技术】
[0002]纳豆作为一种具有两千年历史的传统食品，具有防止骨质疏松和促凝血、抗致病菌、延缓衰老、防癌抗癌、调整肠功能等多种医疗保健功效。其中的主要的活性成分一纳豆激酶更是以其良好的溶栓特性和安全性引起了广泛重视。纳豆激酶溶栓效果好；来源于食品，无毒副作用；分子量小，易被人体消化吸收，作为一种微生物代谢产物有实现大规模生产的可能性，具有广阔的开发应用前景。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种纳豆激酶生产方法，该生产方法是将大豆粉和玉米淀粉经纳豆芽孢杆菌液体发酵，发酵液经微滤和超滤进行澄清和浓缩，最后经真空冷冻干燥得到成品纳豆激酶粉末，其特征在于:包括如下步骤:
[0004]I)液体发酵使用的菌种为纳豆芽孢杆菌，名称为YJND01，分类命名枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，保藏编号为=CGMCC N0.7516，保藏日期为2013年4月25日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
[0005]2)以大豆粉及玉米淀粉为原料，采用液体发酵技术，在50L发酵罐发酵:料水比1:10-15，发酵温度35-42°C，pH控制在6.8-7.2，纳豆芽孢杆菌接种量为2%_5%，通气量为10-25L/min，发酵时间不超过24h，发酵液的纳豆激酶酶活(蚓激酶标准)为30-40万U/mL ；
[0006]3)将步骤2)得到的发酵液先经过0.2 μ m的中空纤维膜进行澄清，再用孔径IOKda的中空纤维膜超滤浓缩，浓缩倍数5-10倍；
[0007]4)将步骤3)得到的浓缩液经真空冷冻干燥后得到纳豆激酶粉末，该纳豆激酶粉末的酶活力为300-500万U/g。
[0008]所述大豆粉和玉米淀粉均为食品级。
[0009]所述大豆粉及玉米淀粉按重量份数配比为1:1-3
[0010]本发明的有益效果是使用的大豆粉和玉米淀粉，原料来源广泛，二者搭配使用保证了菌种的营养需求，而且发酵周期短，不超过24h，发酵液纳豆激酶酶活高，达到30-40万U/mL (蚓激酶标准)，能有效的降低生产成本，同时采用的提纯和干燥技术也有利于该生产方法的工业化生产。
【具体实施方式】
[0011]本发明提供一种纳豆激酶生产方法，该生产方法是将大豆粉和玉米淀粉经纳豆芽孢杆菌液体发酵，发酵液经微滤和超滤进行澄清和浓缩，最后经真空冷冻干燥得到成品纳豆激酶粉末，[0012]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0013]实施例1:以大豆粉和玉米淀粉为原料，生产纳豆激酶
[0014]1.种子液的制备:将斜面菌种接种到种子培养基中，种子培养基配方为:营养肉汤，1.5L，经121°C灭菌15min，冷却至37°C后，接种。种子培养基的发酵条件为:摇床温度35°C、转速150rpm、培养18小时。
[0015]2.发酵:将大豆粉lkg，玉米淀粉Ikg加入50L发酵罐内，并加水溶解后，添加水至25kg，经115°C灭菌20min，冷却至37°C后，pH控制在7，纳豆芽孢杆菌接种量为2%，通气量为20L/min，搅拌控制在500rpm，发酵20h后，检测发酵液酶活为37.5万U/mL。
[0016]3.发酵液浓缩:发酵液首先经过0.2μπι的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为5-20ps1、流速180ml/min，滤出液再用孔径IOKda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20-30ps1、流速140ml/min，最终控制浓缩倍数在5倍；激酶回收率在80%，激酶活力为150 万 U/mL ；[0017]4.浓缩液真空冷冻干燥:对浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚8mm，设定预冻温度为-40°C，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5°C，解析温度为350C，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2.3%，样品疏松，复水性好，纳豆激酶活力为375万U/g。
[0018]实施例2:以大豆粉和玉米淀粉为原料，生产纳豆激酶
[0019]1.种子液的制备:将斜面菌种接种到种子培养基中，种子培养基配方为:营养肉汤，1.5L，经121°C灭菌15min，冷却至37°C后，接种，种子培养基的发酵条件为:摇床温度37°C、转速150rpm、培养15小时；
[0020]2.发酵:将大豆粉lkg，玉米淀粉2kg加入50L发酵罐内，并加水溶解后，添加水至40kg，经115°C灭菌20min，冷却至39°C后，pH控制在6.9，纳豆芽孢杆菌接种量为4%，通气量为24L/min，搅拌控制在500rpm，发酵23h后，检测发酵液酶活为39.5万U/mL。
[0021]3.发酵液浓缩:发酵液首先经过0.2μπι的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为5-20ps1、流速180ml/min，滤出液再用孔径IOKda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20-30ps1、流速140ml/min，最终控制浓缩倍数在5倍；激酶回收率在80%，激酶活力为150 万 U/mL ；
[0022]4.浓缩液真空冷冻干燥:对浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚8mm，设定预冻温度为-40°C，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5°C，解析温度为360C，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2.3%，样品疏松，复水性好，纳豆激酶活力为375万U/g。
[0023]实施例3:以大豆粉和玉米淀粉为原料，生产纳豆激酶
[0024]1.种子液的制备:将斜面菌种接种到种子培养基中，种子培养基配方为:营养肉汤，1.5L，经121°C灭菌15min，冷却至37°C后，接种。种子培养基的发酵条件为:摇床温度40°C、转速150rpm、培养10小时。
[0025]2.发酵:将大豆粉1kg，玉米淀粉2.5kg加入50L发酵罐内，并加水溶解后，添加水至35kg，经115°C灭菌20min，冷却至37°C后，pH控制在7.2，纳豆芽孢杆菌接种量为3.5%，通气量为20L/min，搅拌控制在500rpm，发酵22h后，检测发酵液酶活为38.5万U/mL。
[0026]3.发酵液浓缩:发酵液首先经过0.2μπι的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为5-20ps1、流速180ml/min，滤出液再用孔径IOKda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20-30ps1、流速140ml/min，最终控制浓缩倍数在5倍；激酶回收率在80%，激酶活力为150 万 U/mL ；
[0027]4.浓缩液真空冷冻干燥:对浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚8mm，设定预冻温度为-40°C，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5°C，解析温度为350C，真空度10pa，干燥时间为20小时，最终含水量2.3%，样品疏松，复水性好，纳豆激酶活力为375万U/g。
[0028]实施例4:以大豆粉和玉米淀粉为原料，生产纳豆激酶
[0029]1.种子液的制备:将斜面菌种接种到种子培养基中，种子培养基配方为:营养肉汤，1.5L，经121°C灭菌15min，冷却至37°C后，接种，种子培养基的发酵条件为:摇床温度38°C、转速150rpm、培养13小时;
[0030]2.发酵:将大豆粉2kg，玉米淀粉1.5kg加入50L发酵罐内，并加水溶解后，添加水至48kg，经115°C灭菌20min，冷却至39°C后，pH控制在6.8，纳豆芽孢杆菌接种量为4%，通气量为24L/min，搅拌控制在500rpm，发酵24h后，检测发酵液酶活为39.5万U/mL。
[0031]3.发酵液浓缩:发酵液首先经过0.2μπι的中空纤维膜进行除菌澄清，控制跨膜压力为5-20ps1、流速180ml/min，滤出液再用孔径IOKda的中空纤维膜超滤浓缩，控制跨膜压力20-30ps1、流速140ml/min，最终控制浓缩倍数在5倍；激酶回收率在80%，激酶活力为150 万 U/mL ；
[0032]4.浓缩液真空冷冻干燥:对浓缩液进行真空冷冻干燥，控制料厚8mm，设定预冻温度为-40°C，当样品温度降到设定温度后保持2小时，设定升华温度为5°C，解析温度为360C，真空度10pa， 干燥时间为20小时，最终含水量2.3%，样品疏松，复水性好，纳豆激酶活力为375万U/g。
【权利要求】
1.一种纳豆激酶生产方法，该生产方法是将大豆粉和玉米淀粉经纳豆芽孢杆菌液体发酵，发酵液经微滤和超滤进行澄清和浓缩，最后经真空冷冻干燥得到成品纳豆激酶粉末，其特征在于:包括如下步骤: O液体发酵使用的菌种为纳豆芽孢杆菌，名称为YJND01，分类命名枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，保藏编号为=CGMCC N0.7516，保藏日期为2013年4月25日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； 2)以大豆粉及玉米淀粉为原料，采用液体发酵技术，在50L发酵罐发酵:料水比I: 10-15，发酵温度35-42°C，pH控制在6.8-7.2，纳豆芽孢杆菌接种量为2%_5%，通气量为10-25L/min,发酵时间不超过24h，发酵液的纳豆激酶酶活(蚓激酶标准)为30-40万U/mL ； 3)将步骤2)得到的发酵液先经过0.2 μ m的中空纤维膜进行澄清，再用孔径IOKda的中空纤维膜超滤浓缩，浓缩倍数5-10倍； 4)将步骤3)得到的浓缩液经真空冷冻干燥后得到纳豆激酶粉末，该纳豆激酶粉末的酶活力为300-500万U/g。
2.根据权利要求1所述一种纳豆激酶生产方法，其特征在于:所述大豆粉和玉米淀粉均为食品级。
3.根据权利要求1所述一种纳豆激酶生产方法，其特征在于:所述大豆粉及玉米淀粉按重量份数配比为1:1- 3。
【文档编号】C12R1/125GK103602651SQ201310547971
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】沈建国, 邓启华, 陆英, 王艳艳, 林智平, 贾凤超 申请人:北京燕京啤酒股份有限公司, 北京燕京中发生物技术有限公司