黑曲霉菌株及其孢子粉的制备方法
【专利摘要】本发明属于微生物制品领域，具体涉及一种黑曲霉菌株及其孢子粉的制备方法。该菌株是曲霉属(Aspergillus)中的黑曲霉SDKYSW-2#，其保藏号为CGMCC?No.8327。黑曲霉菌株孢子粉的制备方法是菌种活化、种子液的培养、发酵、后处理即得。本发明生产工艺成熟，技术先进，尤其在菌种筛选和制剂化方面具有先进性，而生产所需要原料价廉易得，产品附加值很高，而且生态和社会效益显著，具备了效益高、成本低、不污染环境、对人畜无害的微生物肥料显著特征。
【专利说明】黑曲霉菌株及其孢子粉的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物制品领域，具体涉及一种黑曲霉菌株及其孢子粉的制备方法。【背景技术】 [0002]人类生存与农业可持续性发展己成为各国农业发展的主题。现代农业(增施水肥、改良品种、集约化栽培、化学化、机械化)的高投入高产出的掠夺式运作方式已经说明是极其有害的。实践证明，将传统农业与现代化农业紧密结合才有利于人类生存和发展。自80年代美国人提出根际促生菌以来，某些根际微生物对作物的促进作用是可以肯定的，具体作用主要有4个方面:①影响作物根细胞的渗透性；②影响根际代谢活动；③微生物对根分泌物的吸收作用；④改变营养物质对植物的有效性。
[0003]无论是微生物间的相互作用，还是微生物对植物的作用都是通过各种酶类及代谢产物作为介质而起作用的。虽然各国科学工作者对根际促生菌的生物学和生态学已做了大量研究，但对促生菌通过何种介质对作物及病原菌发生作用，尚无确切研究。因此，深入研究根际促生菌代谢产物对作物的生物活性及其分子结构特点有着十分重要的意义。一方面可以明确根际促生菌的作用机制，另一方面对仿生合成及微生物基因工程改造都有着十分重要的意义。特别是正向调控菌剂的研制成功，在理论与实际上都将有重大突破。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种黑曲霉菌株，该菌种能够促进作物的生长发育；本发明同时提供了黑曲霉菌株孢子粉的制备方法，简单易行，适合工业化生产。
[0005]本发明所述的黑曲霉菌株是曲霉属(Aspergillus)中的黑曲霉SDKYSW-2#，黑曲霉菌株已于2013年10月12日，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为黑曲霉(AspergiIIusniger)，保藏号为 CGMCC N0.8327。
[0006]黑曲霉菌株是从大棚(沂源)苗圃土壤中采用土壤稀释分离法分离获得。
[0007]本发明所述的黑曲霉菌株的筛选方法，包括以下步骤:
[0008]一、土样采集:从土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，混合过粗筛，取25g作分离用；
[0009]二、黑曲霉的分离:
[0010]1、仪器:
[0011]高压蒸汽灭菌锅、烘干箱、培养箱、电子天平、搪瓷杯、烧杯、分装漏斗、试管、吸管(10ml)、吸尔球、玻璃棒、棉花、线绳、报纸、培养皿、三角瓶(100ml)、玻璃珠、移液器(lml)、吸头、药勺、接种针、酒精灯。
[0012]2、药品:
[0013]可溶性淀粉，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸亚铁，琼脂，蔗糖，黑曲霉。
[0014]3、黑曲霉分离培养基的制备:[0015]可溶性淀粉10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.lg，硫酸亚铁0.lg，琼脂10g，蔗糖10g，水500ml ;将试剂称好，加水放入搪瓷杯中，电炉上加热溶解，用吸管(IOml)吸培养基IOml分装试管中，塞好棉塞，用纸包好灭菌，备用。
[0016]培养基制作:试剂一溶解一校正PH值一分装一加棉塞、包扎一灭菌(0.1P保温30分钟)一备用。
[0017]4、操作方法:
[0018](I)准备工作:
[0019]将使用仪器培养皿、三角瓶、吸头(若干)、药勺、培养基、IOml试管等，用高压灭菌锅0.1p保压30分钟，灭菌备用。
[0020]三角瓶:装入100ml水加入玻璃珠(若干)。
[0021]IOml试管:装入9ml水，做好编号，塞好棉塞，8支，备用。
[0022]培养皿5个为一组，用报纸包好，6包30个。
[0023]Iml吸头，每个单独用报纸包好(若干)。
[0024](2)菌样稀释分离:
[0025]将待分离的菌样在无菌条件下，用接种针取1-2环，放入三角瓶中，瓶内菌液约含孢子50-100万个/ml，充分振摇5分钟左右，使孢子个个分离混匀，备用。
[0026]在接种箱内按无菌`操作要求，用移液器吸取Iml三角瓶内菌液放入I号管，再从I号管吸Iml放入2号管，以此类推，直至稀释至6号或7号试管内，要求每往试管吸一次换一次吸头，每毫升稀释液中约含孢子数5-10个之间。
[0027]取5号6号7号试管内菌液0.5毫升，放入培养皿中，每个稀释度做10个平板，将培养基(温度50°C)倒入培养皿中与菌液充分混匀，放平、冷却。
[0028]大约20分钟左右待培养皿内培养基凝固后取出，倒置放入培养箱内(30°C)，培养4天后，即可在平皿培养基上观察到以每个孢子为同心圆而生长的菌落，菌落大且孢子密度厚来筛选优良的菌株。
[0029]注意事项:
[0030]本操作一定要在灭过菌的无菌接种箱内进行，并严格按无菌操作要求进行。
[0031]使用的培养皿规格及加入的培养基的数量一定要相同，以便于对不同培养皿中的菌落进行比较。
[0032]加入培养基的温度不宜过热或过冷，一般控制在45_50°C之间(用手触摸不烫手)否则会使孢子烫死或出现培养基表面不平现象。
[0033]每稀释一次试管，换一次吸头。
[0034](3)复筛三角瓶产酶培养基:将无机盐溶液加入到干料中，直至配料的含水量为53-55wt.%时，停止加入无机盐溶液；所述干料的质量百分比组成为:麸皮50%、豆饼粉30%和花生秸杆粉20% ;所述无机盐溶液是每升水中含2.0gKH2PO4U.4g(NH4)2SCV0.3g尿素、0.3gMgS04.7Η20、0.3g CaCl2,5.0mg FeSO4.7Η20、1.56mg MnSO4.H2OU.4mg ZnSO4.7H20、2.0mgCoCl2。装入三角瓶，500ml三角瓶装入水分85%的湿料40g，灭菌，接入上述分离的黑曲霉菌株，30°C培养三天后低温干燥，分析所产生的酶系，见表1。
[0035]表1各种酶的活力分析
[0036]
【权利要求】
1.一种黑曲霉菌株，其特征在于:该菌株是曲霉属(Aspergillus)中的黑曲霉SDKYSW-2#，其保藏号为 CGMCC N0.8327。
2.—种权利要求1所述的黑曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤如下: (1)菌种活化:将黑曲霉菌株接种在斜面培养基上培养， (2)种子液的培养:将活化好的菌种加入到种子培养基中培养得到种子液， (3)发酵:种子液与灭菌后的配料搅拌，保温发酵，调温发孢； (4)后处理:将步骤(3)得到的物料低温干燥得到半成品，加入防腐防紫外线物质后干燥，粉碎至标准筛目，孢子收集，复检、分装即得。
3.根据权利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的斜面培养基是麸皮汁斜面培养基，培养温度是28-30°C，培养时间是70-74小时。
4.根据权利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的活化好的菌种和种子培养基的体积比是1:8_12。
5.根据权利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的培养温度是33-36°C，培养时间是45-48小时。
6.根据权利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的种子培养基的制备方法如下: 将麦胚、麸皮按质量比1:9-`11的比例混匀，用45-50°C温水反复冲洗，将得到的清洗液在125-130°C、0.15-0.2Mpa下灭菌40_50min，降温至33_36°C，制成种子培养基。
7.根据权利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的种子液和配料的质量比是1:10-12。
8.根据权利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的保温发酵温度是32-36°C，保温发酵时间是12-15h ;调温发孢温度是32_38°C，调温发孢时间是48-50h。
9.根据权利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的配料的制备方法如下: 将无机盐溶液加入到干料中，直至配料的含水量为53-55wt.%时，停止加入无机盐溶液； 所述干料的质量百分比组成为:麸皮40-50%、豆饼粉30-40%和花生秸杆粉20-30% ； 所述无机盐溶液是每升水中含2.0gKH2PO4U.4g(NH4)2SCV0.3g尿素、0.3gMgS04.7Η20、0.3g CaCl2、5.0mg FeSO4.7Η20、1.56mg MnSO4.H20、1.4mg ZnSO4.7H20、2.0mgCoCl2。
10.根据权利要求2所述的黑曲霉菌株孢子粉的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述的防腐防紫外线物质是氧化锌，防腐防紫外线物质和半成品的质量比是1-1.2:10000。
【文档编号】C12N1/14GK103555593SQ201310548819
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】周长春, 张旭, 葛英, 刘金凤 申请人:沂源康源生物科技有限公司