一种测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量pcr引物对、探针及方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR引物对、探针及方法。所述绝对荧光定量PCR引物对的序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示，所述绝对荧光定量PCR探针的序列如SEQ?ID?NO.3所示。所述测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR方法，包括以下步骤：（1）猪肺炎支原体DNA的提取；（2）普通PCR扩增出目的片段，在目的片段的中间设计绝对荧光定量PCR引物对和探针；（3）目的片段连接PMD-18-T载体制备质粒，转染感受态细胞，提取阳性菌液的质粒；（4）将步骤（3）提取的质粒作为标准品，测算出起始质粒拷贝数；（5）进行荧光定量PCR反应。本发明测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR方法可以快速精确的测定目的基因的拷贝数，即猪肺炎支原体的生长滴度。
【专利说明】一种测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR引物对、探针及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR引物对、探针及方法。
【背景技术】
[0002]猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS),又称猪地方流行性肺炎(Swine enzootic pneumonia),俗称“猪喘气病”。该病存在于世界各地,感染率高死亡率低，主要表现为:猪日增重下降、饲料报酬降低、上市时间延迟、猪群均匀度差、继发感染和药物成本的增加，是造成养猪业经济损失的最重要的疾病之一(李彦明，张映.猪肺炎支原体生物学研究进展[J].动物医学进展，2003，24(3):25-27)。据初步统计，该病每年给我国养猪业造成的直接经济损失高达40亿元(沈青春，宁宜宝，覃青松.猪肺炎支原体的研究进展[J].中国兽药杂志，2003，37 (6):26-30.)
[0003]猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Μ.hyo)引起的。针对猪肺炎支原体的防治方法主要为药物预防和疫苗免疫。由于人们对食品安全问题的重视，药物防止会有兽药残留的风险，疫苗免疫便成为了主要的防治手段。在猪支原体肺炎疫苗制备前，必须测定其生长滴度。
[0004]目前常用的猪肺炎支原体生长滴度测定方法主要有两种:颜色变化单位(CCU)测定法和倍比稀释普通PCR法。颜色变化单位(CCU)测定法，该法通过对猪肺炎支原体发酵液倍比稀释后接种于加有液体培养基的试管中，观察最后一管能生长消耗培养基使得培养基颜色变黄的稀释倍数，从而测定出CCU。其变色原理是猪肺炎支原体分解培养基后使pH下降，培养基中的酚红变黄。倍比稀释普通PCR法，该法通过对猪肺炎支原体发酵液进行倍比稀释，然后抽提各稀释倍数的DNA，采用PCR的方法进行检测，其原理是PCR检测的最低限度约为3X10_3yg，相当于1000个菌体左右，通过能检出的最低稀释倍数便可推算出猪肺炎支原体生长滴度(沈青春，覃青松，王琴，宁宜宝，赵耘，宋立，张广川，吴惠明.PCR方法测定猪肺炎支原体培养物菌数.[J]中国预防兽医学，2006, 28(1):55-57)。
[0005]现有的猪肺炎支原体滴度测定方法存在以下缺点:(I)颜色变化单位(CCU)测定法:该法检测效果良好，但由于猪肺炎支原体生长缓慢，CCU测定法费时太长(约10天左右)，无法满足现实需要。(2)倍比稀释普通PCR法:该法检测速度快，但精确度差。
【发明内容】
[0006]为克服现有技术存在的缺陷，提供一种测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR引物对、探针及方法。
[0007]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0008]一种测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR引物对，所述绝对荧光定量PCR引物对的序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。[0009]一种测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR探针，所述绝对荧光定量PCR探针的序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010]优选地，所述探针的3’端结合有荧光淬灭基团，探针的5’端结合有荧光报告基团。
[0011]更优选地，所述荧光淬灭基团为BHQ1，所述荧光报告基团为FAM。
[0012]一种测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR方法，包括以下步骤:
[0013](I)猪肺炎支原体DNA的提取；
[0014](2)根据猪肺炎支原体16S rRNA保守序列设计普通PCR引物对，以步骤(1)中提取的DNA为模板，进行普通PCR，扩增出目的片段；在目的片段的中间设计绝对荧光定量PCR引物对和探针；所述绝对荧光定量PCR引物对的序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，所述绝对荧光定量PCR探针的序列如SEQ ID N0.3所示；
[0015](3)目的片段经胶回收后连接PMD-18-T载体制备质粒，转染感受态细胞，提取阳性菌液的质粒；
[0016](4)将步骤(3)提取的质粒作为标准品，并经核酸蛋白测定仪测算出起始质粒拷贝数;
[0017](5)以待测样品及各梯度稀释的标准品分别作为反应模板进行荧光定量PCR反应，根据标准品荧光定量PCR标准曲线计算待测样品的起始拷贝数，即为猪肺炎支原体的生长滴度。
[0018]优选地，绝对荧光定量PCR的反应体系为:q-pcr Mix酶10 μ L，荧光定量PCR引物对0.4 μ L，探针0.1 μ L，无RNA酶水7.46 μ L，Rox参比染料0.04 μ L，质粒模板2 μ L。
[0019]优选地，绝对荧光定量PCR的反应程序为:
[0020]
【权利要求】
1.一种测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR引物对，其特征在于，所述绝对荧光定量PCR引物对的序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
2.一种测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR探针，其特征在于，所述绝对荧光定量PCR探针的序列如SEQ ID N0.3所示。
3.根据权利要求2所述的测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR探针，其特征在于，所述探针的3’端结合有荧光淬灭基团，探针的5’端结合有荧光报告基团。
4.根据权利要求3所述的测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR探针，其特征在于，所述突光淬灭基团为BHQ1,所述突光报告基团为FAM。
5.一种测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)猪肺炎支原体DNA的提取；(2)根据猪肺炎支原体16SrRNA保守序列设计普通PCR引物对，以步骤(1)中提取的DNA为模板，进行普通PCR，扩增出目的片段；在目的片段的中间设计绝对荧光定量PCR引物对和探针；所述绝对荧光定量PCR引物对的序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，所述绝对荧光定量PCR探针的序列如SEQ ID N0.3所示；(3)目的片段经胶回收后连接PMD-18-T载体制备质粒，转染感受态细胞，提取阳性菌液的质粒；(4)将步骤(3)提取的质粒作为标准品，并经核酸蛋白测定仪测算出起始质粒拷贝数； (5)以待测样品及各梯度稀释的标准品分别作为反应模板进行荧光定量PCR反应，根据标准品荧光定量PCR标准曲线计算待测样品的起始拷贝数，即为猪肺炎支原体的生长滴度。
6.根据权利要求5所述的测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，绝对荧光定量PCR的反应体系为:q-pcr Mix酶10 μ L，荧光定量PCR引物对0.4 μ L，探针0.1 μ L，无RNA酶水7.46 μ L，Rox参比染料0.04 μ L，质粒模板2 μ L。
7.根据权利要求5所述的测定猪 肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，绝对荧光定量PCR的反应程序为:
8.根据权利要求4所述的测定猪肺炎支原体生长滴度的绝对荧光定量PCR方法，其特征在于，标准品和样品在同一扩增体系和反应中进行荧光定量PCR扩增。
【文档编号】C12Q1/68GK103571960SQ201310552203
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】卢围, 周庆丰, 宋延华, 王东东, 孔意端, 宋志军, 廖承球, 李薇 申请人:广东温氏食品集团股份有限公司