一种单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测人类21号、18号、13号染色体和性染色体STR基因型的试剂盒，是一种采用五色荧光标记单管快速复合扩增QF-PCR试剂盒，用于检测21号、18号、13号染色体和性染色体的数目，主要用于诊断21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征和性染色体非整倍体异常。所述试剂盒包括包含引物混合物、热启动C-Taq酶、扩增反应液、阳性质控品、阴性对照品、荧光内标Siz-500及等位基因分型标准物。本发明较现有的产前诊断方法，可实现高通量、快速、可靠、标准化的检测。
【专利说明】一种单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及荧光定量PCR技术(QF-PCR)，具体涉及一种快速高通量检测人类常染色体21号、18号、13号以及性染色体X、Y的STR基因型的试剂盒，用于上述五条染色体非整倍体的检测。
【背景技术】
[0002]染色体病是导致出生缺陷常见的一类遗传性疾病，约占活产婴儿的0.6%左右，主要表现为智力低下、发育迟缓并伴有多个器官畸形，给社会和家庭带来沉重的精神和经济负担。活产儿染色体异常主要包括21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征，以及性染色体数目异常。
[0003]21三体综合征又称唐氏综合征、先天愚型，在新生儿的发病率为1/800-1/600，是一种严重的先天性智力障碍疾病，易并发心脏病、白血病、免疫功能低下等。18三体又称Edward综合征，在新生儿的发病率为1/8000-1/3500，主要临床表现为智力低下，生长发育迟缓、多发畸形等。13三体又称Patau综合征，在新生儿的发病率为1/7000-1/5000，表现为多发性严重脏器畸形和智力低下，多在婴儿期夭折。这三种是目前新生儿中最常见的常染色体三体综合征，尚无有效治疗方法，只能通过遗传咨询和产前诊断进行预防。
[0004]性染色体数目异常主要有=Klinefelter综合征(473乂￥)，超雄综合征(473丫丫)，超雌综合征(47, XXX), Turner综合征(45, X)。这些疾病患者的共同临床特征是性发育不全或两性畸形，部分表现为原发性闭经、生殖力下降或智力轻度低下等特征，为患者自身和家庭带来了巨大的痛苦，早期诊断和干预可以有效缓解病情。
[0005]我国大规模开展上述染色体病诊断的主要手段是细胞遗传学染色体核型分析，产前进行绒毛、羊水或脐血染色体核型 分析，出生后行外周血染色体检查。进行产前诊断时，一般是取孕中期的羊水20mL，在体外培养羊水中的胎儿细胞，对分裂中期的细胞核进行染色体核型分析和染色体数目异常的诊断。该方法准确、可靠，是目前产前诊断的金标准，但是所需羊水量大且需体外培养，导致诊断时期只能局限在孕16-23周，且存在检测周期长(2-3周时间)、检测通量低下等诸多问题，已难以满足临床日益增长的诊断需求。荧光原位杂交技术(FISH)作为染色体非整倍体异常常见的辅助诊断方法，虽可在48小时内快速诊断，但该方法也建立在繁琐的手工操作基础上，依赖人工分析，存在检测通量低下等问题。因此，发展一种快速、准确、通量高、自动化程度强的诊断方法十分必要。
[0006]QF-PCR是一种快速分子诊断技术，基于荧光标记扩增技术和电泳技术对染色体上的STR (短串联重复序列)进行检测，通过定性、定量分析STR的多态性来诊断目标染色体数目。STR广泛分布于人类整个基因组，以2-6bp的核心单位进行多次重复，核心单位的重复数目的变化构成了 STR基因座在人群中的遗传多态性。STR遵循孟德尔遗传规律，具有高杂合度、易于检测等优点，基于多色荧光标记技术、PCR扩增技术和毛细管电泳，能够达到快速、准确、半自动化、高通量检测的目的。目前用于5种染色体数目检测的QF-PCR商品化试剂盒，如英国的 Aneuploidy、Elucigene QSTR,瑞典的 Chromo Quent> Deryser,美国的 ABI的TrueScience TM Aneuploidy STR Kits等,所选择的STR基因座主要基于白人的群体样本，未必适用于中国人群；国内自主开发的QF-PCR试剂盒(或专利)检测通量相对较低，一般需要多组反应体系才能实现五条染色体的检测，操作繁琐。同时，国内外现有的用于染色体数目诊断的QF-PCR试剂盒或专利均缺乏对STR基因型分析的标准化，检测结果表述难以统一，不利于临床检测的常规开展和质量控制。因此有必要开发一个针对中国人群的能同时检测多种染色体异常的高通量、快速、可靠、标准化的QF-PCR试剂盒。
[0007]本发明试剂盒针对中国人群常染色体21号、18号、13号以及性染色体X、Y非整倍体的临床诊断进行设计，与现有技术相比有以下特点:1)单管复合扩增检测:采用五色荧光标记技术，能够对23个STR基因座在同一组反应体系里进行检测，快速、通量高、使用方便；2)采用中国人群的高多态性STR基因座:所用23个STR基因座是从前期大样本群体遗传学研究中挑选出来的，在中国汉族人群中均具有较高的多态性，能获得较高的诊断效能，达到准确诊断的目的；3)STR检测的标准化:本试剂盒提供了等位基因分型标准品，可以做到STR等位基因的精确分型，使STR检测结果标准化，便于临床诊断工作开展和质量控制。上述特点为该试剂盒的临床应用提供了可靠保障。
[0008]参考文献
[0009]1.许争峰，胡婭莉，张建伟，等.9例18三体综合征胎儿的产前诊断[J].中华围产医学杂志，2006，9 (5): 291-293.[0010]2MISAN0VIC V, JONUZI F, BISCEVIC E, et al.The Patau syndrome [J].MedArh, 2002, 56:42-43.[0011]3.路兴军，俞冬熠，李朔，等.自然流产组织染色体异常的FISH技术检测[J].青岛大学医学院学报，2012，48 (3): 250-252.[0012]4.Wellesley D , Dolk H, Boyd P A , e t a 1.Rare chromosomeabnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from population-basedcongenital anomaly registers in Europe.Eur J Hum Genet.2012, 20(5):521-6.[0013]5.吴勇，徐冰.一种检测五条染色体数目异常的方法.申请号:201210204204.8
[0014]6.曾嵘，熊丽.一种检测导致自然流产的染色体数目异常的试剂盒.申请号:200810219225.0`
[0015]7.廖灿，梁巧仪，杨昕，等.一种快速诊断染色体数目异常的多重QF-PCR STR检测体系.申请号:201010019380.5
[0016]8.尹爱华，杜丽，卢建，等.同时快速检测五种染色体数目的方法及试剂盒与应用.申请号:201110301528.9
[0017]9.李明，陈华云，陈嘉昌.一种无创性产前筛查21-三体综合征的试剂盒.申请号:200910038863.7
[0018]10.陈华云，李明，江帆，等.检测21号染色体和性染色体数目异常的试剂盒.申请号:200710028600.9
【发明内容】
[0019]本发明的目的是提供一种检测人类21号、18号、13号染色体和性染色体STR基因型的试剂盒，是一种采用五色荧光标记单管快速复合扩增QF-PCR试剂盒，用于检测21号、18号、13号染色体和性染色体的数目，主要用于诊断21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征和性染色体非整倍体异常。技术方案是:
[0020]一种单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，其特征在于，包括有扩增如下23个STR基因座所对应的引物=Amelogenin, D21S1432、D21S1270、D21S11、D21S1412、D18S535、D13S305、DXYS218、DXYS267、DXS981、D21S1442、D18S386、D13S634、D18S1002、D21S1435、D13S258、DXS6809、D13S742、DXS1187、DXS22、D18S977、D18S499 和SRY。
[0021]本发明还提供了用于同时扩增上述23个STR基团座所对应的引物，如表1所示。
[0022]表1用于扩增23个STR基因座所对应的引物及其优选浓度
[0023]
【权利要求】
1.一种单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，其特征在于，包括有扩增如下23个STR基因座所对应的引物:Amelogenin、D21S1432、D21S1270、D21S11、D21S1412、D18S535、D13S305、DXYS218、DXYS267、DXS981、D21S1442、D18S386、D13S634、D18S1002、D21S1435、D13S258、DXS6809、D13S742、DXS1187、DXS22、D18S977、D18S499 和SRY。
2.根据权利要求1所述的单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，其特征在于，所述的引物分别是指:Amelogenin: SEQ ID N0.1~2、D21S1432: SEQ ID N0.3~4、D21S1270: SEQ ID N0.5 ~6、D21S11: SEQ ID N0.7 ~8、D21S1412: SEQ ID N0.9 ~10, D18S535: SEQ ID N0.11 ~12、D13S305: SEQ ID N0.13 ~14、DXYS218: SEQ IDN0.15 ~16、DXYS267: SEQ ID N0.17 ~18、DXS981: SEQ ID N0.19 ~20、D21S1442:SEQID N0.21 ~22、D18S386: SEQ ID N0.23 ~24、D13S634: SEQ ID N0.25 ~26、D18S1002:SEQ ID N0.27 ~28、D21S1435: SEQ ID N0.29 ~30、D13S258: SEQ ID N0.31 ~32、DXS6809: SEQ ID N0.33 ~34、D13S742: SEQ ID N0.35 ~36、DXS1187: SEQ ID N0.37 ~38、DXS22: SEQ ID N0.39 ~40、D18S977: SEQ ID N0.41 ~42、D18S499:SEQ ID N0.43 ~44 和 SRY: SEQ ID N0.45 ~46。
3.根据权利要求2所述的单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，其特征在于，各组引物的浓度是SEQ ID N0.1~2:0.02 μ M、SEQ ID N0.3~4:0.06 μ M、SEQID N0.5 ~6:0.05 μ M、SEQ ID N0.7 ~8:0.06 μ M、SEQ ID N0.9 ~10:0.12 μ M、SEQ IDN0.11 ~12:0.09 μ M,SEQ ID N0.13 ~14:0.06 μ M,SEQ ID N0.15 ~16:0.02 μ M,SEQ IDN0.17 ~18:0.04 μ M,SEQ ID N0.19 ~20:0.04 μ M,SEQ ID N0.21 ~22:0.05 μ M,SEQ IDN0.23 ~24:0.12 μ M,SEQ ID N0.25 ~26:0.15 μ M,SEQ ID N0.27 ~28:0.12 μ M,SEQ IDN0.29 ~30:0.08 μ M,SEQ ID N0.31 ~32:0.09 μ M,SEQ ID N0.33 ~34:0.12 μ M,SEQ IDN0.35 ~36:0.18 μ M、SE Q ID N0.37 ~38:0.20 μ M、SEQ ID N0.39 ~40:0.08 μ M、SEQ IDN0.41 ~42:0.16 μ M、SEQ ID N0.43 ~44:0.18 μ M 和 SEQ ID N0.45 ~46:0.18 μ Μ。
4.根据权利要求1所述的单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，其特征在于:各组引物中反对应的正向与反向引物中，至少有一个的5’端是经过标记的。
5.根据权利要求4所述的单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，其特征在于:各组引物是分组标记的，第一组:Amelogenin, D21S1432、D21S1270、D21S11、D21S1412、D18S535 和 D13S305 ;第二组:DXYS218、DXYS267、DXS981、D21S1442、D18S386 和D13S634 ;第三组:D18S1002、D21S1435、D13S258、DXS6809、D13S742 和 DXS1187 ;第四组:DXS22、D18S977、D18S499 和 SRY。
6.根据权利要求5所述的单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，其特征在于:每组分别采用FAM、HEX、TAMRA、ROX中的任一种标记，而且每组之间的标记色都不相同。
7.根据权利要求1所述的单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，其特征在于:还包括质控品9947A。
8.根据权利要求1所述的单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，其特征在于:还包括有等位基因分型标准品。
9.根据权利要求3所述的单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，其特征在于:该试剂盒中反应体系的组成是=IOXPCR扩增反应液10 μ L、引物混合液、热启动C-Taq酶1.0 μ L、SdH2O补足至25.0μ L ;所述的扩增反应液中包括有25 mM Tris-HCl，125mM KCl,6.5 mM Mg2+,0.6 mM dNTPs。
【文档编号】C12Q1/68GK103555849SQ201310555078
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】吕时铭, 朱宇宁, 薛佳, 陈雁, 张民, 郑卫国, 葛海鹏 申请人:无锡中德美联生物技术有限公司, 杭州博圣生物技术有限公司