一种快速鉴定扇贝品种的多重pcr引物及方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物及方法。属于应用生物【技术领域】。快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物，由栉孔扇贝引物、华贵栉孔扇贝引物、海湾扇贝引物和虾夷扇贝引物组成。鉴定方法包括以下步骤：提取扇贝基因组总DNA，进行多重PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小判定待检测扇贝种类。栉孔扇贝、海湾扇贝、虾夷扇贝和华贵栉孔扇贝的PCR产物条带大小分别为514bp、367bp、205bp和149bp。本发明的鉴定引物及多重PCR方法可以灵敏、快速地确定待检测扇贝样品的种类，较传统检测方法具有操作简单、可重复性强、成本低等优点。
【专利说明】—种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及扇贝的鉴别方法，尤其是涉及一种快速鉴定四种扇贝品种的多重PCR引物及方法。
【背景技术】
[0002]扇贝属软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Lamellibranchia)、翼形亚纲(Pterimorphia)、珍珠贝目(Pterioida)、扇贝科(Pectinidae),是我国沿海主要的经济养殖贝类之一。我国沿海主要养殖扇贝种类包括:柿孔扇贝/krreri)、华贵柿孔扇贝(Mimachlamys /7oAi7i5.)、海湾扇贝(Argopecten irrat/iafls)和虫下夷扇贝{Mizuhopectenyessoensis)0柿孔扇贝主要养殖地为我国北部沿海,华贵柿孔扇贝主要养殖地为我国的东部和南部沿海，海湾扇贝为从美国引进品种，虾夷扇贝为从日本和朝鲜引进品种。近年来，随着现代科技对扇贝养殖技术的不断成熟，扇贝养殖规模在山东、辽宁沿海地区不断扩大，扇贝养殖已成为水产养殖的支柱产业。在扇贝遗传育种以及加工贸易过程中，都需准确、快速地鉴定扇贝的种类。
[0003]传统鉴定扇贝种类的方法主要依靠形态学标准进行，例如:壳色、大小、足丝孔、放射肋、棘等。但是，通常加工后的扇贝只留下闭壳肌，失去了形态学特征，不能利用传统形态学对其进行鉴定。扇贝幼虫还未形成可辨别的形态特征，也不能利用传统形态学对其进行鉴定。因此，在一些情况下传统的方法很难准确鉴定扇贝的种类。所以，亟需一种基于分子生物学技术的能够快速、准确鉴定四种扇贝品种的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种快速鉴定栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝等四种扇贝品种的多重PCR引物及方法，本发明的方法可以灵敏、快速地确定待检测养殖扇贝样品的种类，较传统检测方法具有操作简单、可重复性强、成本低等优点。
[0005]本发明的目的是通过如下技术方案实现的:一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物由栉孔扇贝引物、海湾扇贝引物、虾夷扇贝引物和华贵栉孔扇贝引物组成。
[0006]所述的栉孔扇贝引物的DNA序列为:
上游引物 Pl:5’ - ATACCCTCCGCTGTCGTCTA -3’ ；
下游引物 P2:5’ - CGCGTCTAATCCCACCGTAA -3’。
[0007]所述的海湾扇贝引物的DNA序列为:
上游引物 P3:5’ - TGTTCTGATCTTGCCTGGGT -3’ ；
下游引物 P4:5’ - AGCCACATCAAGACACGCAT -3’。
[0008]所述的虾夷扇贝引物的DNA序列为:
上游引物 P5:5’ - TGTTGATCTTGGACCGGCAT -3’ ；
下游引物 P6:5’ - GCATACATCATTGCCACCGC -3’。
[0009] 所述的华贵栉孔扇贝引物的DNA序列为:上游引物 P7:5’ - CCTCCTTTGTCCAGAACTCCT -3’ ；
下游引物 P8:5’ - TCAGCCTTATACGCCTTGCC -3’。
[0010]上述的多重PCR引物用于鉴定栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝。
[0011]一种利用上述的多重PCR引物快速鉴定扇贝品种的方法，方法如下:
1)提取待检测扇贝样品的基因组总DNA，无菌超纯水溶解DNA，调节DNA浓度为5-12ng/yL，制备样品 DNA;
2)利用上述的多重PCR引物对样品DNA进行多重PCR扩增；
3)PCR反应结束后，取产物做琼脂糖凝胶电泳检测；根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小判定待检测扇贝的种类:如果出现大小为514bp的条带说明样品为栉孔扇贝；如果出现大小为367bp的条带说明样品为海湾扇贝；如果出现大小为205bp的条带说明样品为虾夷扇贝；如果出现大小为149bp的条带说明样品为华贵栉孔扇贝。
[0012]上述步骤2)中多重PCR扩增的反应体系为:5yL 10XPCR buffer,4y L浓度为
2.5mM的dNTP，0.4 μ L浓度为5U/ μ I的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的Pl- P8弓丨物各2 μ L，I μ L样品DNA，无菌超纯水补齐到50 μ L0
[0013]上述步骤2)中多重PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min ;94°C变性45sec，59°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 30 个循环；72°C延伸 7min。
[0014]本发明的有益效果是:本发明利用来自扇贝的线粒体基因组COI基因序列设计合成了四对针对四种不同扇贝品种的特异性PCR引物，并利用此引物建立了一个多重PCR反应，实现了利用分子生物学方法快速鉴定四种扇贝品种的新方法。本方法具有操作简单、重复性好、准确、快速、灵敏等优点。本发明主要应用于扇贝种质资源保护、遗传育种以及产品鉴定等领域。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为实施例1鉴定的四种已知扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNAMarker,泳道I为柿孔扇贝，泳道2为海湾扇贝，泳道3为奸夷扇贝，泳道4为华贵柿孔扇贝。
[0016]图2为实施例2快速鉴定市购扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNAMarker,泳道I为样本扇贝，结果显示待鉴定扇贝品种为柿孔扇贝。
[0017]图3为实施例3快速鉴定市购扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNAMarker，泳道I为样本扇贝，结果显示待鉴定扇贝品种为华贵栉孔扇贝。
[0018]图4为实施例4快速鉴定市购扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNAMarker，泳道I为样本扇贝，结果显示待鉴定扇贝品种为海湾扇贝。
[0019]图5为实施例5快速鉴定市购扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNAMarker,泳道I为样本扇贝，结果显示待鉴定扇贝品种为奸夷扇贝。
【具体实施方式】
[0020]下面的实施例是对本发明进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
[0021]实施例1 一种快速鉴定扇贝品种的方法
I)分别取已知品种为栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝的四种扇贝，分别取扇贝的闭壳肌组织，剪碎，按照常规酚氯仿法提取样品的DNA，用无菌超纯水溶解DNA样品，调节DNA浓度为8ng/ μ L，分别制备样品DNA，即分别得到栉孔扇贝样品DNA、华贵栉孔扇贝样品DNA、海湾扇贝样品DNA和虾夷扇贝样品DNA ；
2)分别对不同品种的样品DNA进行多重PCR扩增:具体步骤如下:PCR反应体系为:5μ L IOXPCR buffer,4y L 浓度为 2.5mM 的 dNTP，0.4 μ L 浓度为 5υ/μ1 的 DNA 聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的引物P1-P8各2 μ L，1 μ L样品DNA，加无菌超纯水补齐到50 μ L;PCR反应条件为:95°C预变性5min ;94°C变性45sec，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸7min ;扩增完成后PCR产物于4°C保存；
3)PCR反应结束后，取5 μ L PCR产物与1 μ L上样缓冲液混匀，上样于3%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker采用DL1000 (宝生物工程(大连)有限公司)，然后进行100V恒压电泳，电泳约30min，EB染色，在紫外灯下观察结果；
4)PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示:栉孔扇贝样品DNA出现大小为514bp的条带；海湾扇贝样品DNA出现大小为367bp的条带；虾夷扇贝样品DNA出现大小为205bp的条带；华贵柿孔扇贝样品DNA出现大小为149bp的条带。
[0022]实施例2 —种快速鉴定扇贝品种的方法
1)取市购扇贝的闭壳肌组织，剪碎，按照常规酚氯仿法提取样品的DNA，用无菌超纯水溶解DNA样品，调节DNA浓度为8ng/ μ L，制备样品DNA ；
2)对样品DNA进行多重PCR扩增:具体步骤如下:PCR反应体系为:5yL10XPCRbuffer, 4 μ L浓度为2.5mM的dNTP，0.4 μ L浓度为5U/ μ I的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的引物P1-P8各2 μ L，1μ L样品DNA，加无菌超纯水补齐到50 μ L ；PCR反应条件为:95°C预变性5min ;94°C变性45sec，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸7min ;扩增完成后PCR产物于4°C保存；
3)PCR反应结束后，取5 μ L PCR产物与1 μ L上样缓冲液混匀，上样于3%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker采用DL1000 (宝生物工程(大连)有限公司)，然后进行100V恒压电泳，电泳约30min，EB染色，在紫外灯下观察结果，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示:出现大小为514bp的条带,说明此扇贝为柿孔扇贝品种。
[0023]实施例3 —种快速鉴定扇贝品种的方法
1)取市购扇贝的闭壳肌组织，剪碎，按照常规酚氯仿法提取样品的DNA，用无菌超纯水溶解DNA样品，调节DNA浓度为8ng/ μ L，制备样品DNA ；
2)对样品DNA进行多重PCR扩增:具体步骤如下:PCR反应体系为:5yL10XPCRbuffer, 4 μ L浓度为2.5mM的dNTP，0.4 μ L浓度为5U/ μ I的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的引物P1-P8各2 μ L，1 μ L样品DNA，加无菌超纯水补齐到50 μ L ；PCR反应条件为:95°C预变性5min ;94°C变性45sec，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸7min ;扩增完成后PCR产物于4°C保存；
3)PCR反应结束后，取5 μ L PCR产物与1 μ L上样缓冲液混匀，上样于3%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker采用DL1000 (宝生物工程(大连)有限公司)，然后进行100V恒压电泳，电泳约30min，EB染色，在紫外灯下观察结果，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示:出现大小为149bp的条带，说明此扇贝为华贵栉孔扇贝品种。
[0024]实施例4 一种快速鉴定扇贝品种的方法
1)取市购扇贝的闭壳肌组织，剪碎，按照常规酚氯仿法提取样品的DNA，用无菌超纯水溶解DNA样品，调节DNA浓度为8ng/ μ L，制备样品DNA ；
2)对样品DNA进行多重PCR扩增:具体步骤如下:PCR反应体系为:5yLIOXPCRbuffer, 4 μ L浓度为2.5mM的dNTP，0.4 μ L浓度为5U/ μ I的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的引物P1-P8各2 μ L，I μ L样品DNA，加无菌超纯水补齐到50 μ L ；PCR反应条件为:95°C预变性5min ;94°C变性45sec，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸7min ;扩增完成后PCR产物于4°C保存；
3)PCR反应结束后，取5 μ L PCR产物与I μ L上样缓冲液混匀，上样于3%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker采用DL1000 (宝生物工程(大连)有限公司)，然后进行100V恒压电泳，电泳约30min，EB染色，在紫外灯下观察结果，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示:出现大小为367bp的条带，说明此扇贝为海湾扇贝品种。
[0025] 实施例5 —种快速鉴定扇贝品种的方法
1)取市购扇贝的闭壳肌组织，剪碎，按照常规酚氯仿法提取样品的DNA，用无菌超纯水溶解DNA样品，调节DNA浓度为8ng/ μ L，制备样品DNA ；
2)对样品DNA进行多重PCR扩增:具体步骤如下:PCR反应体系为:5yL10XPCRbuffer, 4 μ L浓度为2.5mM的dNTP，0.4 μ L浓度为5U/ μ I的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的引物P1-P8各2 μ L，I μ L样品DNA，加无菌超纯水补齐到50 μ L ；PCR反应条件为:95°C预变性5min ;94°C变性45sec，59°C退火30sec，72°C延伸lmin，共30个循环；72°C延伸7min ;扩增完成后PCR产物于4°C保存；
3)PCR反应结束后，取5 μ L PCR产物与I μ L上样缓冲液混匀，上样于3%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker采用DL1 000 (宝生物工程(大连)有限公司)，然后进行100V恒压电泳，电泳约30min，EB染色，在紫外灯下观察结果，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图5所示:出现大小为205bp的条带,说明此扇贝为奸夷扇贝品种。
【权利要求】
1.一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物，其特征在于多重PCR弓丨物由栉孔扇贝引物、海湾扇贝引物、虾夷扇贝引物和华贵栉孔扇贝引物组成； 所述的栉孔扇贝引物的DNA序列为: 上游引物 Pl:5’ - ATACCCTCCGCTGTCGTCTA -3’ ； 下游引物 P2:5’ - CGCGTCTAATCCCACCGTAA -3’ ； 所述的海湾扇贝引物的DNA序列为: 上游引物 P3:5’ - TGTTCTGATCTTGCCTGGGT -3’ ； 下游引物 P4:5’ - AGCCACATCAAGACACGCAT -3，； 所述的虾夷扇贝引物的DNA序列为: 上游引物 P5:5’ - TGTTGATCTTGGACCGGCAT -3’ ； 下游引物 P6:5’ - GCATACATCATTGCCACCGC -3’ ； 所述的华贵栉孔扇贝引物的DNA序列为: 上游引物 P7:5’ - CCTCCTTTGTCCAGAACTCCT -3’ ； 下游引物 P8:5’ - TCAGCCTTATACGCCTTGCC -3’。
2.权利要求1所述的多重PCR引物在鉴定栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的多重PCR引物快速鉴定扇贝品种的方法，其特征在于方法如下: 1)提取待检测扇贝样品的基因组总DNA，无菌超纯水溶解DNA，调节DNA浓度为5_12ng/U L，制备样品DNA ； 2)利用权利要求1所述的多重PCR引物对样品DNA进行多重PCR扩增； 3)PCR反应结束后，取产物做琼脂糖凝胶电泳检测；根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小判定待检测扇贝的种类:如果出现大小为514bp的条带说明样品为栉孔扇贝；如果出现大小为367bp的条带说明样品为海湾扇贝；如果出现大小为205bp的条带说明样品为虾夷扇贝；如果出现大小为149bp的条带说明样品为华贵栉孔扇贝。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于:步骤(2)中所述多重PCR扩增的反应体系为:5yL IOXPCR buffer, 4 μ L 浓度为 2.5mM 的 dNTP，0.4 μ L 浓度为 5U/yL 的 DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的P1-P8引物各2 μ L，I μ L样品DNA，无菌超纯水补齐到50 μ L0
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于:步骤(2)中所述多重PCR扩增的反应条件为:95°C预变性 5min ;94°C变性 45sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 30 个循环；72°C延伸7min。
【文档编号】C12N15/11GK103602738SQ201310566790
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】刘宏生, 艾海新, 张力, 赵健 申请人:辽宁大学