可在鉴别不同鱼类的方法中进行应用的特异引物序列及鉴别不同鱼类的dna分子标记方法
【专利摘要】本发明公开了可在鉴别不同鱼类的DNA分子标记方法中进行应用的特异引物序列，包括上游引物和下游引物，用该特异引物序列鉴别不同鱼类的DNA分子标记方法包括：先根据已知鱼类的5SrDNA基因保守的编码区序列设计特异引物；再提取待鉴别鱼类材料的基因组；以该基因组DNA为模板，设计PCR反应体系扩增其5SrDNA基因，利用5SrDNA基因非转录间隔区的多态性通过PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳及DNA凝胶回收试剂盒纯化后，获得样本5SrDNA基因的DNA片段模式；最后根据凝胶成像中的DNA片段模式与已知鱼类进行比对，判断出待鉴别鱼类材料的种类。本发明的方法具有快速、准确、操作简便等优点。
【专利说明】可在鉴别不同鱼类的方法中进行应用的特异引物序列及鉴别不同鱼类的DNA分子标记方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用分子遗传标记来分析鱼类的遗传特性以及分子遗传关系的方法，具体涉及用基于5S rDNA基因DNA条带模式的DNA分子标记结合DNA测序来鉴定和分析不同鱼类的方法。
【背景技术】
[0002]与形态生物学和细胞生物学方法相比，分子生物学技术在鉴定和分析个体或群体遗传特性方面具有优势。生物学家长久以来不断寻找一种更快、更准确、更稳定的标记和鉴定不同动物的分子生物学方法。虽然全基因组测序可以提供有价值的遗传信息，但对生物界所有物种测序是不现实的。所以，分子遗传标记仍然是在个体水平或群体水平上研究遗传多样性及其变化规律的主要手段，并被广泛应用于群体遗传学、系统学、进化生物学等理论研究及保护生物学、动植物遗传育种、疾病诊断等实践领域。
[0003]目前，DNA分子标记主要有以下五种:(I)线粒体DNA (mtDNA)分子标记；(2)基于Southern杂交分子标记，如限制性片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism, RFLP),突光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)和单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism, SSCP) ; (3)基于 PCR 的分子标记技术，如随机扩增多态性 DNA (Random Amplification Polymorphic DNA, RAPD),扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)和单链构象多态-DNA聚合酶链式反应(Single-Strand Conformation Polymorphism-PoIymerase ChainReaction, SSCP-PCR) ； (4)基于重复序列的分子标记，如微卫星DNA和小卫星DNA ; (5)基于mRNA的分子标记，如逆转录PCR (Reverse Transcription-PCR, RT-PCR)和差异显示逆转录 PCR (Differential Display Reverse Transcription-PCR, DDRT-PCR)。现有的分子标记方法普遍存在费用昂贵、稳定性差、重复性差、或者需要放射性标记等不足。
[0004]5S rDNA基因作为一个独立的转录单位，在染色体上的位置较分散。5S rDNA编码细胞质中5S rRNA，属于真核生物中一类高度保守的串联重复序列，重复单位长度为200bp~900bp，单倍体基因组中的拷贝数为1000~50000。在高等真核生物中，5S rDNA多基因家族是一类高度保守的串联重复序列，重复单位长度为200bp~900bp，每个重复单位都是由一个编码区(120bp)和之间的非转录间隔区(nontranscribed spacer, NTS)组成。由于5S rDNA基因编码细胞质中的5S rRNA对生命活动很重要，其基因区的序列通常是高度保守的，因为其碱基的微小改变都可能带来二级结构的变化，改变与核糖体蛋白的结合能力，从而进一步影响蛋白质的合成，并带来致死突变。而NTS则由于不转录的原因，没有明显的生存筛选压力，因此很容易通过遗传的方式将逐代的变异累计下去，进而形成物种间的明显差异。因此，5S rDNA基因的NTS多态性成为物种进化、种群分化和遗传多样性的一个合适标记。
[0005]目前，利用5SrDNA基因转录间隔区的遗传多样性进行分子进化和系统发育研究在植物研究中已有很多应用，但还一直没有利用5S rDNA基因转录间隔区的遗传多样性进行不同鱼类快速鉴别的报道。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可在鉴别不同鱼类的DNA分子标记方法中进行应用的特异引物序列，还相应提供一种快速、准确、操作简便的用前述特异引物序列鉴别不同鱼类的DNA分子标记方法。
[0007]为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为可在鉴别不同鱼类的DNA分子标记方法中进行应用的特异引物序列，包括以下的上游引物和下游引物:
上游引物:5’ -GCCCGATCTCGTCTGATCTCG-3’ ；
下游引物:5’ -GCGCTCAGGTTGGTATGGCCG-3，。
[0008]作为一个总的技术构思，本发明还提供一种用上述特异引物序列鉴别不同鱼类的DNA分子标记方法，包括以下步骤:
(1)根据已知鱼类的5SrDNA基因保守的编码区序列设计所述特异引物；
(2)提取待鉴别鱼类材料样本的基因组；
(3)以上述步骤(2)提取的基因组DNA为模板，设计PCR反应体系扩增其5SrDNA基因，利用5S rDNA基因非转录间隔区(nontranscribed spacer, NTS)的多态性通过PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳及DNA凝胶回收试剂盒纯化后，获得不同鱼类待检测样本5S rDNA基因的DNA片段模式；
(4)根据凝胶成像中的DNA片段模式，并与已知鱼类的DNA片段模式进行比对，分析判断出待鉴别鱼类材料的种类。
[0009]上述的DNA分子标记方法中，优选的，在上述步骤(4)后继续通过对DNA片段模式进行克隆测序，获得不同鱼类待检测样本的特异5S rDNA基因序列；再根据扩增片段在数目和种类上的共同性和差异性，以及不同已知鱼类特异的5S rDNA基因序列，鉴定出不同鱼类待检测样本所属的种类以及不同鱼类之间的遗传关系。
[0010]上述的DNA分子标记方法中，优选的，所述步骤(2)的具体操作方法包括:用注射器从各待鉴别鱼类材料样本的静脉中取血或取部分鳍条；利用DNA提取试剂盒进行各待鉴别鱼类材料样本的基因组DNA的提取。
[0011]上述的DNA分子标记方法中，优选的，所述步骤(3)中PCR反应体系的总体积为25μ1,其中含 5 ~10 ng DNA, 1.5 ~2.0 mmol MgCl2,0.2 mmol dNTPs, 0.2 ~0.4 Mmol 正负引物，I Xbuffer 和 1.25unit TaqTMDNA 聚合酶。
[0012]上述的DNA分子标记方法中，优选的，所述步骤(3)中PCR扩增反应的程序为94°C预变性5min，94°C变性30 s，55°C~58°C退火30s，72°C延伸lmin，25~30个循环后接着720C IOmin。
[0013]与现有技术相比，本发明的优点在于:由于5S rDNA基因的编码区具有保守性，转录间隔区具有变异性，本发明选择5S rDNA基因为分子克隆的目标，根据其保守的编码区设计特异引物，应用PCR、琼脂糖凝胶电泳等方法在大量不同鱼类样本中获得了在数目和大小上有差异的DNA片段。各样本中特定数量和大小的5S rDNA基因DNA片段构成了该种鱼类特定的DNA条带模式，揭示了不同鱼类的遗传特性和遗传关系。进一步优选结合DNA测序，本发明方法可以广泛应用于快速准确地鉴定和分析不同鱼类的遗传特性和遗传关系。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为第一组鱼类材料样品的5S rDNA基因扩增图；其中M.1OObp分子梯度标记；1表示红鲫；2表示团头鲂；3表示三倍体鲫鲂；4表示四倍体鲫鲂。
[0015]图2为第二组鱼类材料样品的5S rDNA基因扩增图；其中M.1OObp分子梯度标记；1表示大口鲶；2表示菱鲆；3表示乌鳢；4表示黄颡鱼。
[0016]图3为第三组鱼类材料样品的5S rDNA基因扩增图；其中M.1OObp分子梯度标记；1表示海鳗；2表示泥鳅；3表示黄鳝；4表示长吻鮑。
[0017]图4为第四组鱼类材料样品的5S rDNA基因扩增图；其中M.1OObp分子梯度标记；1表示石斑鱼；2表示鲢鱼；3表示鳙鱼；4表示鲑鱼；5表示鳗鲡。
[0018]图5为第五组鱼类材料样品的5S rDNA基因扩增图；其中M.1OObp分子梯度标记；1表示神仙鱼；2表示金鱼；3表示鳜鱼；4表示S卢鱼。
[0019]图6为第六组鱼类材料样品的5S rDNA基因扩增图；其中M.1OObp分子梯度标记；1表示翘嘴舶；2表示草鱼；3表示黄尾鲴；4表示鲤鱼。
[0020]图7为第七组鱼类材料样品的5S rDNA基因扩增图；其中M.1OObp分子梯度标
记；1表示团头鮮；2表示草鱼；3表示二倍体草鮮；4表示三倍体草鮮。
【具体实施方式】
[0021]以下结合说明书附·图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
[0022]实施例:
参照已知其它鱼类的5S rDNA基因的编码区序列，用Primer Premier 5.0软件和Jellyfish 1.4软件设计一种可在鉴别不同鱼类的DNA分子标记方法中进行应用的特异引物序列，由上海生工公司(简称上海Sangon)合成，所述特异引物序列如下:
上游引物:5 ’ -GCCCGATCTCGTCTGATCTCG-3，；
下游引物:5’ -GCGCTCAGGTTGGTATGGCCG-3，。
[0023]一种本发明的用上述特异引物序列鉴别不同鱼类的DNA分子标记方法，包括以下步骤:
1.准备实验材料。
[0024]神仙jtXPterophyllum\ 鲤 jtXCyprinuscarpio Ζ.)、黄尾鲴(JeflociFArisda vidi Bleeker )、翅嘴舍白(Erythrocul ter iIishaeformis Bleeker)、海 {Muraenesoxcinereus)> 日本獲 ii (.Anguilla japonica)、績 jtXsinipoorca chuatsi)、长吻脆ileiocassis longirostris) >MSf {Paralichthys olivaceus)>{Epinephelussp)>IA jt.1Lateolabrax japonicus.、、jhiOncorhynchus keta )、乌 Siichanna argus)>草 H.1Ctenopharyngodon idellus')、链 H.(Hypoph thalmi ch thys molitrix)、鋪鱼{Hypoph thalmi ch thys nobi/is )、大口 It (5? lurus so I da to vi meri di onali s CXe/?)、黄颜鱼{Pel teobagrus ful vi draco )、泥嫩(#i sgurnus Angui Ili cauda tus )、黄鳝(Monop terusalba )、金鱼(Carassius aura tus aura tus )、团头鱼方(Megalobrama amblycephala )、会I 顧PiCarassius aura tus var ret/)、二倍体草鮮、三倍体草鮮(草鱼(早)X团头鮮(t ))，三倍体鲫鲂和四倍体鲫鲂(红鲫(早)X团头鲂(色))，其中前面的23种为自然界鱼类，后4种为人工制备的杂交鱼。
[0025]2.基因组DNA的提取。
[0026]对于上述准备的不同种类的鱼类材料，用一次性注射器从各鱼类材料样品的静脉中取血(或部分鳍条);按照UNIQ-10柱式基因组DNA提取试剂盒(上海Sangon公司)进行各鱼类材料样品基因组DNA提取。提取的DNA用紫外分光光度计检测其浓度，_20°C保存。
[0027]3.PCR扩增和克隆。
[0028]以上述步骤2提取的各鱼类材料样品的基因组DNA为模板，设计PCR体系扩增其5S rDNA基因，再利用5S rDNA基因非转录间隔区的多态性通过PCR、琼脂糖凝胶电泳获得各鱼类材料样品5S rDNA基因的DNA片段模式。PCR反应在GeneAmp? PCR System 2700热循环仪(美国Applied Biosystems公司生产)上进行,每个扩增反应总体积为25μ1,其中I ~10 ng DNA, 1.5 ~2.0 mmol MgCl2,0.2 mmol dNTPs, 0.4MmoI 正负引物，I Xbuffer 和
1.25unit TaqTMDNA聚合酶(TaKaRa公司)。PCR反应程序为:94°C预变性5min，94°C变性30 s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环后接着72°C lOmin，最后在4°C保存。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶成像扫描仪拍照，目的产物片段使用UNIQ-1O柱式胶回收试剂盒(上海Sangon公司)纯化，纯化方法参照产品手册进行。将回收的DNA片段克隆于载体PMD18-T (TakaRa公司)，连接反应及细菌转化按pMD18_T载体试剂盒说明书进行操作。
[0029]4.测序和序列分析。
[0030]选取阳性克隆菌落，提取重组质粒PMD18-T，经过菌落PCR和酶切鉴定后，由上海Sangon公司对阳性克隆进行测序，采用Blast软件进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较，根据其与查询序列的最高相似性而`命名所得克隆。
[0031]本实施例中各鱼类材料样品的5S rDNA基因扩增图如图1~图7所示。图1~图7展示了多种不同鱼类样品扩增出的不同数量和大小的5S rDNA基因DNA片段，而每种鱼类材料样品的条带模式都体现了其遗传特征以及与其他鱼类之间的遗传关系。
[0032]图1展示了第一组鱼类材料样品的5S rDNA基因条带模式，包括鲤形目鲤科鲤亚科的红鲫(I号样品)、鲤形目鲤科舶亚科的团头鲂(2号样品)、以及它们的杂交后代三倍体鲫鮮(3号样品)和四倍体鲫鮮(4号样品)。红鲫(I号样品)具有200bp、340bp和500bp左右的条带，团头鲂(2号样品)具有200bp和400bp左右条带。因此，通过5S rDNA基因的DNA条带分布模式就能将这两种鱼进行区分。三倍体鲫鲂(3号样品)具有200bp、340bp和500bp左右的条带，四倍体鲫鲂(4号样品)具有200bp、340bp、400bp和500bp左右的条带。因此，通过5S rDNA基因的DNA条带分布模式就能将这两种不同倍性的杂交鱼进行区分。
[0033]图2展示了第二组四种自然界鱼类的5S rDNA基因条带模式，包括鲶形目鲶科的大口鲶(I号样品)、鲽形目鲆科菱鲆(2号样品)、鲈形目鳢科乌鳢(3号样品)和鲶形目鮑科黄颡鱼(4号样品)。南方大口 It (I号样品)具有250bp和450bp左右的条带,菱鲆(2号样品)具有350bp的条带，乌鳢(3号样品)200pb、400bp和1000bp左右的条带，黄颡鱼(4号样品)具有300bp和600bp左右的条带。因此，通过5S rDNA基因的DNA条带分布模式就能将这四种鱼类进行区分。[0034]图3展示了第三组四种自然界鱼类的5S rDNA基因条带模式，包括鳗鲡目海鳗科海鳗(I号样品)、鲤形目鳅科泥鳅(2号样品)、合鳃目合鳃科黄鳝(3号样品)和鲶形目鳇科长吻鮑(4号样品)。海鳗(I号样品)具有400bp、800bp和1200bp左右的条带，泥鳅(2号样品)具有250bp和600bp左右的条带，黄鳝(3号样品)具有550bp左右的条带，长吻鮑(4号样品)具有400bp、450bp和800bp左右的条带。因此，通过5S rDNA基因的DNA条带分布模式就能将这四种鱼类进行区分。
[0035]图4展示了第四组五种自然界鱼类的5S rDNA基因条带模式，包括鲈形目鳍科石斑鱼(I号样品)、鲤形目鲤科鲢鱼(2号样品)、鲤形目鲤科鳙鱼(3号样品)、鲑形目鲑科鲑鱼(4号样品)、鳗鲡目鳗鲡科日本鳗鲡(5号样品)。石斑鱼(I号样品)具有220bp、400bp和850bp左右的条带，鲢鱼(2号样品)具有200bp和400bp左右的条带，鳙鱼(3号样品)具有200bp和400bp左右的条带，鲑鱼(4号样品)具有250bp、600bp和800bp左右的条带，鳗鲡(5号样品)具有200bp和600bp左右的条带。通过5S rDNA基因条带分布模式可以将四种不同科的鱼类进行区分。鲢鱼和鳙鱼同属鲤科，5S rDNA基因条带模式很相似，但是通过对200bp的片段进行测序，发现鲢鱼为180bp、鳙鱼为184bp，因此通过测序能进一步区分这两种不同鱼类。
[0036]图5展示了第五组四种自然界鱼类的5S rDNA基因条带模式，包括鲈形目丽鱼科神仙鱼(I号样品)、鲤形目鲤科金鱼(2号样品)、鲈形目真鲈科鳜鱼(3号样品)、鲈形目河鲈科鱼卢鱼(4号样品)。神仙鱼(I号样品)具有200bp和600bp左右的条带,金鱼(2号样品)具有200bp、340bp和600bp左右的条带，鳜鱼(3号样品)具有400bp和500bp左右的条带，鲈鱼(4号样品)200bp、550bp和700bp左右的条带。因此，通过5S rDNA基因的DNA条模式就能将这四种鱼类进行区分。
[0037]图6展示了第六组四种自然界鱼类的5S rDNA基因条带模式，包括鲤形目鲤科舶亚科翘嘴舶(I号样品)、鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼(2号样品)、鲤形目鲤科鲴亚科黄尾鲴(3号样品)和鲤形目鲤科 亚科鲤鱼(4号样品)。它们同属鲤科鱼类，除了翘嘴舶具有3条带以外，其它鱼类都只有200bp和400bp左右的条带。通过对200bp的条带测序发现,草鱼为180bp,黄尾鲴为188,鲤鱼为203。因此,通过测序能进行区分。
[0038]图7展示了第七组两种亲本及其杂交后代的5S rDNA基因条带模式，包括团头鲂(I号样品)、草鱼(2号样品)、二倍体草鲂(3号样品)和三倍体草鲂(4号样品)。两种亲本及其杂交后代均只有200bp和400bp左右的条带。通过对200bp左右的条带测序发现，团头鲂为188bp，草鱼为180bp，二倍体草鲂和三倍体草鲂具有188bp和180bp两条DNA序列。因此，通过序列比对我们能对杂交鱼的亲本来源进行鉴定。
[0039]由上可见，本实施例中根据已知鱼类的5S rDNA基因保守的编码区设计特异引物，并利用其非转录间隔区(nontranscribed spacer, NTS)的多态性,通过应用PCR、琼脂糖凝胶电泳获得动物样本的5S rDNA基因DNA片段并进行了测序。结果表明，不同鱼类的5SrDNA基因扩增产物在数目、大小以及DNA序列方面存在共同性和差异性，通过这些差异性和共同性可以对它们进行准确地区分并确定它们各自的遗传特性，分析它们的遗传关系。本发明基于5S rDNA基因DNA片段的数目、大小和种类的分子标记技术可以快速、准确、特异、敏感地确定不同鱼类的分子遗传特性并分析它们的分子遗传关系。
【权利要求】
1.可在鉴别不同鱼类的DNA分子标记方法中进行应用的特异引物序列，包括以下的上游引物和下游引物: 上游引物:5 ’ -GCCCGATCTCGTCTGATCTCG-3，； 下游引物:5’ -GCGCTCAGGTTGGTATGGCCG-3，。
2.一种用权利要求1所述特异引物序列鉴别不同鱼类的DNA分子标记方法，包括以下步骤: (1)根据已知鱼类的5SrDNA基因保守的编码区序列设计所述特异引物； (2)提取待鉴别鱼类材料样本的基因组； (3)以上述步骤(2)提取的基因组DNA为模板，设计PCR反应体系扩增其5SrDNA基因，利用5S rDNA基因非转录间隔区的多态性通过PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳及DNA凝胶回收试剂盒纯化后，获得不同鱼类待检测样本5S rDNA基因的DNA片段模式； (4)根据凝胶成像中的DNA片段模式，并与已知鱼类的DNA片段模式进行比对，分析判断出待鉴别鱼类材料的种类。
3.根据权利要求2所述的DNA分子标记方法，其特征在于，在上述步骤(4)后继续通过对DNA片段模式进行克隆测序，获得不同鱼类待检测样本的特异5S rDNA基因序列；再根据扩增片段在数目和种类上的共同性和差异性，以及不同已知鱼类特异的5S rDNA基因序列，鉴定出不同鱼类待检测样本所属的种类以及不同鱼类之间的遗传关系。
4.根据权利 要求2或3所述的DNA分子标记方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作方法包括:用注射器从各待鉴别鱼类材料样本的静脉中取血或取部分鳍条；利用DNA提取试剂盒进行各待鉴别鱼类材料样本的基因组DNA的提取。
5.根据权利要求2或3所述的DNA分子标记方法，其特征在于，所述步骤(3)中，PCR反应体系的总体积为 25μ1，其中含 5 ~10 ng DNA, 1.5 ~2.0 mmol MgCl2,0.2 mmol dNTPs,0.2 ~0.4 Mmol 正负引物，IXbuffer 和 1.25unit TaqTMDNA 聚合酶。
6.根据权利要求2或3所述的DNA分子标记方法，其特征在于，所述步骤(3)中，PCR扩增反应的程序为:941:预变性51^11，941:变性30 s，55°C~58°C退火30s，72°C延伸lmin，25~30个循环后接着72°C IOmin0
【文档编号】C12N15/11GK103589801SQ201310583949
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】刘少军, 覃钦博, 刘筠, 王余德, 王娟 申请人:湖南师范大学