一种用于检测鸡pmel17基因显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法，属于生物【技术领域】。本发明针对PMEL17基因第10外显子9bp插入（-CTGGGCACC-）设计等位基因I特异性引物P1-R；针对PMEL17基因第10外显子无9bp插入设计等位基因i特异性引物P2-F；以I等位基因特异性引物对P1扩增鸡PMEL17基因I等位基因，以i等位基因特异性引物对P2扩增鸡PMEL17基因i等位基因，PCR反应后进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果准确、快速、方便的检测PMEL17基因显性白羽位点基因型。与现有技术相比，本发明建立的分子生物学方法大大提高了基因型的判定效率和准确性，方法简单、易操作，且成本低。
【专利说明】—种用于检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及一种用于检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的引物，以及包含该引物的试剂盒及检测方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]白羽鸡从基因型上可以分为纯合显性白羽、杂合显性白羽和隐性白羽三种类型。我们在显性白羽鸡的育种中需要选育出纯合显性白羽基因型，来满足的育种需求。因此利用分子生物手段来诊断某个体在显性白羽位点的基因型，这对我们育种来说是非常重要和必要的。
[0003]显性白羽基因座是影响鸡羽色形成的最重要基因座位之一，其上的显性等位基因I会阻碍羽毛黑色素合成，从而使携带此基因型的个体全身羽毛呈现白色。目前已确认鸡显性白羽基因基因座编码PMEL17蛋白(Premelanosome proteinl7, PMEL17):PMEL17基因编码前黑色素小体蛋白17，它是黑色素细胞特异蛋白，在黑素细胞的分化与成熟过程中扮演着重要的角色。显性白等位基因是由于PMEL17基因第10外显子9bp插入造成的。即显性等位基因I是PMEL17基因第10外显子9bp插入基因型，隐性等位基因i是PMEL17基因第10外显子无9bp插入基因型。对于只差9bp的基因片段来说，常规PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳很难分型。近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；普通的PCR-RFLP方法要求待测多态性位点是某一特定酶切位点，应用范围局限；而直接测序技术成本较高。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种用于检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的引物。
[0005]同时，本发明还提供一种用于检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的试剂盒。
[0006]最后，本发明还提供一种检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的方法。
[0007]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:
[0008] 一种用于检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的引物，包括引物对P1、P2，
[0009]所述的引物对Pl为:
[0010]上游引物，Pl-F:5’ -CCGGCCTCTACTGCCTCAACGTCTCGT-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)；
[0011]下游引物，Pl-R:5’-GTGCCCAGAGCTTCGGCGATGAGCGGTG-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)；
[0012]所述的引物对P2为:
[0013]上游引物，P2-F:5’-CCACGCTCACCGTGGGGCTGCTGCTCAT-3’(如 SEQ ID N0.3 所示)；
[0014]下游引物，P2-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’(如 SEQ ID N0.4 所示)。
[0015]一种用于检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的试剂盒，主要包括引物对P1、P2，[0016]所述的引物对Pl为:
[0017]上游引物，Pl-F:5’ -CCGGCCTCTACTGCCTCAACGTCTCGT-3’ ；
[0018]下游引物，Pl-R:5’ -GTGCCCAGAGCTTCGGCGATGAGCGGTG-3’ ；
[0019]所述的引物对P2为:
[0020]上游引物，P2-F:5，-CCACGCTCACCGTGGGGCTGCTGCTCAT-3，；
[0021]下游引物，P2-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’。
[0022]优选的，一种用于检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的试剂盒，还包括2XTaqPCR MasterMix、灭菌超纯水，以及包含 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp的 DNA Marker。
[0023]所述的2XTaq PCR MasterMix含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、氯化镁和PCR反应缓冲液，为市售商品，可购自上海生工、大连宝生物、北京百泰克、北京康为等公司。
[0024]一种检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的方法，包括以下步骤: [0025](I)以包含PMEL17基因的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对Pl为引物PCR扩增鸡PMEL17基因I等位基因，以引物对P2为引物PCR扩增鸡PMEL17基因i等位基因；
[0026]( 2 )对步骤(1)的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡PMEL17基因显性白羽位点的基因型。
[0027]所述步骤(1)中PCR 扩增反应体系为:2XTaq PCR MasterMixl2.5 U L, ddH209.5u L, Pl-F 0.4u L, Pl-R 0.6 u L, P2-F 0.6 u L, P2-R 0.4u L, DNA 模板 1.0u L0
[0028]所述步骤(1)中PCR扩增反应程序为:94°C预变性4min ;94°C变性30s，64°C退火30s，72。。延伸 15s, 35 个循环；72°C延伸 IOmin0
[0029]所述步骤(2)中琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5%。
[0030]所述步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳的电压为120V，电泳时间为40min。
[0031]所述步骤(2)中鉴定鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的方法为:11基因型表现为322bp和224bp条带；Ii基因型表现为322bp、224bp和144bp条带；ii基因型表现为322bp 和 144bp 条带。
[0032]本发明的有益效果:
[0033]本发明中用于检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的引物，是针对PMEL17基因第10外显子9bp插入(-CTGGGCACC-)设计等位基因I特异性引物Pl-R ;针对PMEL17基因第10外显子无9bp插入设计等位基因i特异性引物P2-F。这样引物Pl-R与Pl-F只能扩增I等位基因，扩增的片段大小为224bp ;引物P2-R与P2-F只能扩增i等位基因，扩增的片段大小为144bp。此外，由于上游引物Pl-F与下游引物P2-R的组合也可以扩增，扩增的片段大小为322bp，这个扩增不受9bp插入的影响，即每个个体均可以扩增。
[0034]本发明以I等位基因特异性引物对Pl为引物，PCR扩增鸡PMEL17基因I等位基因，以i等位基因特异性引物对P2为引物，PCR扩增鸡PMEL17基因i等位基因，然后把引物对Pl和P2放在一个PCR反应里，一次PCR反应后再对PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果可以准确、快速、方便的检测PMEL17基因显性白羽位点基因型:II基因型表现为322bp和224bp条带；Ii基因型表现为322bp、224bp和144bp条带；ii基因型表现为322bp和144bp条带。
[0035]本发明采用琼脂糖凝胶电泳直接检测PCR产物，与现有技术相比:本发明建立的分子生物学方法大大提高了基因型的判定效率和准确性，而且方法简便，分型时间短，不需要测序和限制性内切酶，不需要特殊的仪器，成本低，易推广普及。
[0036]本发明通过对其他鸡群体进行判型并测序验证了其准确性。研究表明该方法能有效地诊断显性白羽位点的基因型，可以用于鸡的显性白羽位点的分子标记辅助选择，进而建立纯合显性白羽鸡种群。本发明建立了一种鸡显性白羽位点分子标记的鉴定方法，可以快速判定出显性白羽位点的基因型，从而缩短育种时间，加快育种进程。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为本发明实施例1的技术流程示意图；
[0038]图2为实施例1中各样本PMEL17基因显性白羽位点的PCR电泳图，
[0039]注:自左至右泳道分别代表DNA Marker I和基因型i1、i1、I1、I1、I1、i1、I1、ii和Ii的电泳带型；
[0040]图3为实施例1中PMEL17基因的不同基因型测序图，
[0041]注:图3a为PMEL17基因II基因型测序图(方框内为插入的9bp碱基)，图3b为PMEL17基因ii基因型测序图。
【具体实施方式】
[0042]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0043]实施例1
[0044]本实施例的技`术流程示意图如图1所示，主要包括以下步骤:
[0045](I)样品的采集
[0046]采集河南农业大学种鸡场隐性白羽鸡品系400只、淅川乌骨鸡400只、显性白羽鸡品系24只和丝羽乌骨鸡24只，中国家禽基因库扬州隐性白羽鸡30只，郑州试验站白来航鸡24只和罗曼褐壳蛋鸡CD系24只，翅静脉采血，加1/3抗凝剂，保存于4°C冰箱保存备用。
[0047](2)基因组DNA的提取
[0048]参考文献Sambrock et al (2002)方法。
[0049](3)引物设计
[0050]根据NCBI 公布的 PMELl7 基因序列(GenBank Accession N0.AY636129)设计引物。
[0051]引物对Pl为:
[0052]上游引物，Pl-F:5’ -CCGGCCTCTACTGCCTCAACGTCTCGT-3’ ；
[0053]下游引物，P1-R: 5 ’ -GTGCCCAGAGCTTCGGCGATGAGCGGTG-3，；
[0054]引物对P2为:
[0055]上游引物，P2-F:5，-CCACGCTCACCGTGGGGCTGCTGCTCAT-3，；
[0056]下游引物，P2-R: 5，-GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3，。
[0057](4) PCR 扩增
[0058]PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和I次反应所需的PCR反应的个数,算出各种反应组分的总量,加入到I个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后分别加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系见表1。反应程序为:95°C预变性5min ;95°C变性30s，64°C退火 30s，72°C延伸 20s，38 个循环;72°C延伸 5min ;4°C保存。其中，2XTaq PCRMasterMix购自北京百泰克公司。
[0059]表1PCR反应体系
【权利要求】
1.一种用于检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的引物，其特征在于:包括引物对P1、P2, 所述的引物对Pl为:
上游引物，Pl-F:5’ -CCGGCCTCTACTGCCTCAACGTCTCGT-3’ ；
下游引物，Pl-R:5’ -GTGCCCAGAGCTTCGGCGATGAGCGGTG-3’ ； 所述的引物对P2为: 上游引物，P2-F:5’ -CCACGCTCACCGTGGGGCTGCTGCTCAT-3，； 下游引物，P2-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGITCTC-3’。
2.一种用于检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的试剂盒，其特征在于:主要包括引物对P1、P2， 所述的引物对Pl为:
上游引物，Pl-F:5’ -CCGGCCTCTACTGCCTCAACGTCTCGT-3’ ；
下游引物，Pl-R:5’ -GTGCCCAGAGCTTCGGCGATGAGCGGTG-3’ ； 所述的引物对P2为: 上游引物，P2-F:5’ -CCACGCTCACCGTGGGGCTGCTGCTCAT-3，； 下游引物，P2-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGITCTC-3’。
3.根据权利要求2所述的用于检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的试剂盒，其特征在于:还包括2XTaq PCR MasterMix、灭菌超纯水，以及包含600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp 的 DNA Marker。
4.一种检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)以包含PMEL17基因的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对Pl为引物PCR扩增鸡PMEL17基因I等位基因，以权利要求1所述的引物对P2为引物PCR扩增鸡PMEL17基因i等位基因； 所述的引物对Pl为: 上游引物，Pl-F:5’ -CCGGCCTCTACTGCCTCAACGTCTCGT-3’，
下游引物，Pl-R:5’ -GTGCCCAGAGCTTCGGCGATGAGCGGTG-3’ ； 所述的引物对P2为: 上游引物，P2-F:5’ -CCACGCTCACCGTGGGGCTGCTGCTCAT-3，，
下游引物，P2-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGITCTC-3’ ； (2)对步骤(1)的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡PMEL17基因显性白羽位点的基因型。
5.根据权利要求4所述的检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(1)中 PCR 扩增反应体系为:2XTaq PCR MasterMixl2.5 U L, ddH209.5 U L,Pl-F 0.4u L, Pl-R 0.6u L, P2-F 0.6 u L, P2-R 0.4u L, DNA 模板 1.0u L0
6.根据权利要求4所述的检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(1)中PC R扩增反应程序为:94°C预变性4min ;94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸15s，35个循环；72°C延伸IOmin0
7.根据权利要求4所述的检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(2)中琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5%。
8.根据权利要求4所述的检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳的电压为120V，电泳时间为40min。
9.根据权利要求4所述的检测鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(2)中鉴定鸡PMEL17基因显性白羽位点基因型的方法为:11基因型表现为322bp和224bp条带；Ii基因型表现为322bp、224bp和144bp条带；ii基因型表现为322bp和144bp条带。
【文档编号】C12N15/11GK103602745SQ201310589755
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】康相涛, 李转见, 刘小军, 田亚东, 杨朋坤, 闫峰宾, 蒋瑞瑞, 吕世杰, 王丹丹, 孙桂荣, 韩瑞丽, 李国喜, 王彦彬 申请人:河南农业大学