高效全血基因组dna提取方法

高效全血基因组dna提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速、高效全血基因组DNA提取方法，属于核酸纯化领域。首先向全血中加入红细胞裂解液，涡旋，直至红细胞完全裂解，弃上清，吸干残留液体。加入白细胞裂解液和蛋白酶K，37oC水浴裂解白细胞，直至沉淀溶解。加入氯化钠和氯仿，离心分离DNA，并将上清液转移至另一洁净的EP管中。加入醋酸铵和冰乙醇沉淀DNA，75％乙醇洗涤后自然干燥，加入TE溶解得到DNA。本发明方法具有快速、高效和无毒的特点。所提取的DNA可用于聚合酶链反应（PCR）、甲基化检测、基因克隆等多种后续分子生物学研究。
【专利说明】高效全血基因组DNA提取方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种快速、高效全血基因组DNA提取方法，属于核酸纯化领域。
【背景技术】
[0003]目前，分子生物学理论和技术发展十分迅速，已经与生物学、医学、遗传学和动物学等多个学科密切结合，获得高纯度和完整的基因组DNA是进行后续分子生物学研究的基础，是其它研究工作的前提。外周血可作为造血系统疾病研究中分子标志，以及用于体外诊断系统的开发，还可用于血液系统外众多系统疾病的分子监测。从外周血中提取DNA，进行核酸水平的研究是临床分子生物学重要的研究手段。
[0004]在遗传性疾病和肿瘤以及心脑血管病等研究中，可以利用外周血作为生物材料，检测患病个体与正常健康个体之间的DNA差异，例如DNA甲基化分析和基因突变检测。寻找快速、经济的DNA提取方法是群体分子生物学实验面临的首要问题。然而，从血液中提取DNA面临的难题之一是DNA易受到多种物质的污染，使得DNA纯度下降，致使实验结果准确性降低。有些传统的外周血DNA提取方法使用饱和酚等有害物质，且操作复杂，过程繁琐，用时过长；开放的自动化DNA提取装置，虽然不再使用饱和酚等有害物质，操作过程也相对比较简单，但所用仪器和试剂极为昂贵，不适用于普通实验室大规模DNA的提取。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于提供一种快速、高效提取全血基因组DNA方法，保证提取出的基因组DNA完整，并使提取过程高效、快速、无毒。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:
一种高效全血基因组DNA提取方法，包括以下步骤:
(1)按全血:红细胞裂解液=1:1的体积比，向EP管中的全血中加入红细胞裂解液，涡旋2分钟后静置5分钟以上，直至溶液澄清透明，然后对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，离心时间为2分钟，弃去上清液；
(2)向步骤(1)的EP管中再加入占全血体积1/3的红细胞裂解液，涡旋I分钟，直至沉淀完全散开，然后对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，分离时间为I分钟，弃去上清液；重复本步骤一次，并用吸水纸吸干残留液体；
(3)向步骤(2)的EP管中加入占全血体积1/3的白细胞稀释液，另加入占全血体积1/600的蛋白酶K，混匀，37°C水浴60-90分钟，直至沉淀完全溶解；
(4)向步骤(3)的EP管中分别加入占全血体积1/12的5摩尔/升氯化钠溶液和占全血体积2/3的氯仿，充分摇匀，然后对溶液进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心时间为5分钟，将上层液体转移至另一洁净的EP管中；
(5)向步骤(4)的洁净的EP管中加入占管内溶液I/ 10体积的醋酸铵溶液和2倍体积的冰乙醇，充分摇匀，沉淀DNA，然后对溶液进行离心分离，离心分离的转速为4000转/分钟，分离时间为I分钟,弃去上清液；
(6)向步骤(5)的洁净的EP管中加入占全血体积1/3的75%乙醇，对DNA沉淀洗涤，然后进行离心分离，转速为12000转/分，离心时间为I分钟，弃去上清液；重复本步骤两次；
(7)将步骤(6)的洁净的EP管倒立放置在放有吸水纸的水平实验台上，自然干燥5分
钟；
(8)向步骤(7)的洁净的EP管中加入与全血同等体积的TE缓冲液，溶解DNA沉淀。
[0007]采用上述技术方案的本发明，与现有技术相比，其优点是:
①本发明个步骤中涉及的离心时间、离心机转速，使全血中基因组DNA的提取过程具有高效、快速、简便的特点；
②本发明整个过程不需要使用有毒的苯酚的试剂，且所有试剂成本较低，使整个过程不仅安全可靠，而且比较经济；
②使用本发明方法纯化的基因组DNA完整性好，纯度高，可用于聚合酶链反应(PCR)、实时定量荧光聚合酶链反应(Real Time PCR)、芯片分析、分子克隆等分子生物学实验。
[0008]作为优选，本发明更进一步的技术方案是:
所述红细胞裂解液中各组分的配方为:
Tris-HCl (PH7.6 或 8.0)0.01M
Sucrose320mM
MgCl25mM
TritonXlOO1%。
[0009]所述白细胞裂解液中各组分的配方为:
Tris-HCl (PH7.6 或 8.0)0.01M
EDTA (PH8.0)4mM
SDS0.2%
NaCl50mM。
·[0010]所述TE缓冲液中各组分的配方为:
Tris-HCl (PH7.6*8.0)IM
EDTA (ΡΗ8.0)0.5Μ。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实施例对本发明作进一步说明，目的仅在于更好地理解本
【发明内容】
。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。
[0012]实施例1:从人的全血中提取DNA。
[0013](I)向600微升人全血中加入红细胞裂解液600微升，加入的体积比为全血:红细胞裂解液=1:1，涡旋2分钟，静置5分钟以上，直至溶液澄清透明。对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，离心时间为2分钟，弃去上清液。其中红细胞裂解液按下述方法制备:取 IOmllMTris-HCl (ΡΗ7.6)，109.54g Sucrose，1.0lg MgCl2，加 IOml TritonX 100,力卩水至800ml，溶解定容至1000ml。
[0014](2)向步骤(1)的EP管中加入200微升的红细胞裂解液，涡旋I分钟，直至沉淀完全散开。对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，分离时间为I分钟，弃上清。重复一次，并用吸水纸吸干残留液体。
[0015](3)向步骤(2)的EP管中加入200微升白细胞稀释液，I微升蛋白酶K，混匀，37°C水浴60-90分钟，直至沉淀完全溶解。其中白细胞裂解液按下述方法制备:加IOmlIMTris-HCl (PH7.6), 8ml 0.5 M EDTA, 20ml 10% SDS, IOml 5M NaCl，定容至 1000ml。
[0016](4)向步骤(3)的EP管中加入50微升5摩尔/升氯化钠溶液和400微升氯仿，充分摇匀。对溶液进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心时间为5分钟。将上层液体转移至另一洁净EP管中。
[0017](5 )向步骤(4)的EP管中加入I / 10体积醋酸铵溶液和2倍体积冰乙醇，充分摇匀，沉淀DNA。对溶液进行离心分离，离心分离的转速为4000转/分钟，分离时间为I分钟，
弃上清。
[0018](6)向步骤(5)的EP管中加入200毫升75%乙醇，对DNA沉淀洗涤，于12000转/
分离心I分钟，弃上清。重复两次。
[0019](7)将步骤(6)的EP管倒立放置与放有吸水纸的水平实验台上，自然干燥5分钟。
[0020](8)加入600微升TE溶解DNA沉淀。其中TE缓冲液按下述方法制备:取IOml IMTris-HCl (PH8.6), 2ml 0.5 M EDTA，加水至 1000ml。
[0021]依照实施例1所述方法从600微升人全血中提取的DNA，通过其1%琼脂糖凝胶电泳检测发现DNA在23130bp处有一条单一亮条带。
[0022]实施例2:从小鼠的全血中提取DNA。
[0023](I)向600微升小鼠全血中加入红细胞裂解液600微升，加入的体积比为全血:红细胞裂解液=1:1，涡旋2分钟，静置5分钟以上，直至溶液澄清透明。对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，离心时间为2分钟，弃去上清液。其中红细胞裂解液，其制备方法是:取 IOmllMTris-HCl (PH7.6), 109.54g Sucrose，1.0lg MgCl2，加 IOml TritonXlOO,加水至800ml，溶解定容至1000ml。
[0024](2)向步骤(1)的EP管中加入200微升的红细胞裂解液，涡旋I分钟，直至沉淀完全散开。对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，分离时间为I分钟，弃上清。重复一次，并用吸水纸吸干残留液体。
[0025](3)向步骤(2)的EP管中加入200微升白细胞稀释液，I微升蛋白酶K，混匀，37°C水浴60-90分钟，直至沉淀完全溶解。其中白细胞裂解液，其制备方法是:加IOmlIMTris-HCl (PH7.6), 8ml 0.5 M EDTA, 20ml 10% SDS, IOml 5M NaCl，定容至 1000ml。
[0026](4)向步骤(3)的EP管中加入50微升5摩尔/升氯化钠溶液和400微升氯仿，充分摇匀。对溶液进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心时间为5分钟。将上层液体转移至另一洁净EP管中。
[0027](5 )向步骤(4)的EP管中加入1 / 10体积醋酸铵溶液和2倍体积冰乙醇，充分摇匀，沉淀DNA。对溶液进行离心分离，离心分离的转速为4000转/分钟，分离时间为I分钟，
弃上清。
[0028](6)向步骤(5)的EP管中加入200毫升75%乙醇，对DNA沉淀洗涤，于12000转/
分离心I分钟，弃上清。重复两次。
[0029](7)将步骤(6)的EP管倒立放置与放有吸水纸的水平实验台上，自然干燥5分钟。[0030](8)加入600微升TE溶解DNA沉淀。其中TE缓冲液，其制备方法是:取IOml IMTris-HCl (PH8.6), 2ml 0.5 M EDTA，加水至 1000ml。[0031]依照实施例2所述方法从从600微升小鼠全血中提取的DNA，通过其1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA在23130bp处有一条单一较亮带。
【权利要求】
1.一种高效全血基因组DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)按全血:红细胞裂解液=1:1的体积比，向EP管中的全血中加入红细胞裂解液，涡旋2分钟后静置5分钟以上，直至溶液澄清透明，然后对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，离心时间为2分钟，弃去上清液； (2)向步骤(1)的EP管中再加入占全血体积1/3的红细胞裂解液，涡旋I分钟，直至沉淀完全散开，然后对溶液进行离心分离，转速为4000转/分钟，分离时间为I分钟，弃去上清液；重复本步骤一次，并用吸水纸吸干残留液体； (3)向步骤(2)的EP管中加入占全血体积1/3的白细胞稀释液，另加入占全血体积1/600的蛋白酶K，混匀，37°C水浴60-90分钟，直至沉淀完全溶解； (4)向步骤(3)的EP管中分别加入占全血体积1/12的5摩尔/升氯化钠溶液和占全血体积2/3的氯仿，充分摇匀，然后对溶液进行离心分离，离心转速为12000转/分钟，离心时间为5分钟，将上层液体转移至另一洁净的EP管中； (5)向步骤(4)的洁净的EP管中加入占管内溶液I/ 10体积的醋酸铵溶液和2倍体积的冰乙醇，充分摇匀，沉淀DNA，然后对溶液进行离心分离，离心分离的转速为4000转/分钟，分离时间为I分钟,弃去上清液； (6)向步骤(5)的洁净的EP管中加入占全血体积1/3的75%乙醇，对DNA沉淀洗涤，然后进行离心分离，转速为12000转/分，离心时间为I分钟，弃去上清液；重复本步骤两次； (7)将步骤(6)的洁净的EP管倒立放置在放有吸水纸的水平实验台上，自然干燥5分钟； (8)向步骤(7)的洁净的EP管中加入与全血同等体积的TE缓冲液，溶解DNA沉淀。
2.如权利要求1所述的高效全血基因组DNA提取方法，其特征在于，所述红细胞裂解液中各组分的配方为: Tris-HCl (ΡΗ7.6*8.0)0.01M Sucrose320mMMgCl25mM TritonXlOO1%。
3.如权利要求1所述的高效全血基因组DNA提取方法，其特征在于，所述白细胞裂解液中各组分的配方为: Tris-HCl (PH7.6 或 8.0)0.01M EDTA (PH8.0)4mM SDS0.2% NaCl50mM。
4.如权利要求1所述的高效全血基因组DNA提取方法，其特征在于，所述TE缓冲液中各组分的配方为: Tris-HCl (PH7.6*8.0)IM EDTA (ΡΗ8.0)0.5Μ。
【文档编号】C12N15/10GK103571826SQ201310593112
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月23日 优先权日:2013年11月23日
【发明者】张雪梅, 张志 , 曹蕾 申请人:河北联合大学