一种云南省松茸的产地属性dna指纹图谱的建立方法
【专利摘要】一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，本发明包括如下步骤：1)样品DNA提取：对云南各松茸产区的松茸样品进行DNA提取；2)按顺序使用pL28l／DS48引物、pDGSL313一l／pS48引物、pDGSL719-2／pS48引物对提取的松茸样品的DNA进行PCR扩增；3)运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测；4)获得云南松茸的产地特征属性DNA指纹图谱。本发明提供一种针对中国云南松茸主产区松茸的地属性DNA指纹图谱的构建方法，以及由此方法得到的松茸的产地属性的DNA指纹图谱。从而能够为残留监控中的问题松茸的云南原产地溯源提供理论参考依据。
【专利说明】—种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，尤其涉及的是中国云南松茸主产区的松茸产地属性的DNA指纹图谱的建立方法。
【背景技术】
[0002]松鸾隶属担子菌门(Basidiomycota)、担子菌纲(Basidiomycetes)、伞菌目(Agaricales)、口薦科(Tricholoma)、口薦属(Tricholoma) [1]。全球已报道了 15 个种，我国已记载了 5个种一个变种，即松鸾(T.matsutake)、假松鸾(T.bakamatsukake)、青岗覃(T.quercicola)、粗壮口蘑(T.robustum)、黄褐口蘑(T.fulvoeastaneum)和台湾松鸾变种(T.matsutake),松鸾是一种外生菌根真菌类，由菌丝体、子实体和孢子组成,本发明所指的松茸是T.matsutake这个品种，且指可食用的子实体部分，也就是人们在市场上见到的松茸菌。
[0003]松茸是一种味道鲜美、口感上乘、气味浓郁独特、营养价值高、具有食疗效果的纯天然食用菌。目前尚不能人工驯化栽培，基本上都野生菌，所以来自不同分布区域的松茸拥有产地属性。本发明只针对新鲜松茸，松茸加工制品中，DNA可能发生断裂和降解，且目前多数松茸加工品不具有产地属性，没有对其进行产地溯源的需要。
[0004]日本是松茸的最大消费国，也是最大的进口国。我国松茸主要出口至日本，其中鲜松茸的出口量占日本进口量的43%，具有巨大的海外贸易价值。
[0005]我国松茸的主产区是云南、四川、吉林和黑龙江，其中云南的产量最大。
[0006]目前东北生产的鲜松鸾从吉林口岸出口，云南、四川和西藏鲜松鸾从云南出入境口岸出口，但有时东北产的松茸也会从云南口岸出口。年平均统计数据显示:云南口岸出口的鲜松茸量平均占中国出口的鲜松茸量的71%，甚至有时可占占全国出口量的85%，居全国之首。
[0007]中国云南地区的松茸的主要分布在云南的迪庆州、大理州、楚雄州、怒江州的海拔为2000-4000米的原始森林区。交通不便，气候寒冷，人烟稀少，多是高山少数名族居住于附近。目前多是由当地高山贫困少数民族开始对其进行采摘并卖给当地的松茸出口收购商，这已成为这些少数民族脱贫致富的主要经济来源。因此，松茸的顺利出口关系到这些边疆少数民族的经济收入，关系到边疆地区的民族团结和政治稳定。
[0008]松茸虽然是纯天然的野生食用菌 ，但是生长地分散，采摘人员多半是居住于附近的当地居民——散户，从采撷到出口还要经历很多环节，面对出口国特别是日本苛刻的进口食品贸易壁垒，检验检疫部门必须对松茸的采摘到出口的全过程进行质量安全控制和溯源管理，尽可能保证松茸的顺利出口。另外，日本也要求我国提供对日出口的松茸的官方原产地证明。
[0009]中国国家质量监督检验检疫总局制定了《出口鲜松茸质量安全控制要求》指出“在强化检验把关中指出“指导出口企业避免从农残和重金属污染严重的地区收购原料，降低农残和重金属含量超标的风险”。虽然检验检疫监督管理部门按照溯源管理措施，要求企业对产地进行编号管理，按照原料来源分产地加工、存储堆放，在报检时必须提供该批出口松茸原料溯源管理网络图，但实际情况是企业履行得并不严格，这给经出口口岸检验检疫部门检验发现残留监控不合格的松茸的溯源造成困难，为了保护云南口岸出口的持续性，以及更有效、更有针对性对某个地区进行松茸质量的管理，管理监管部门除了依靠企业诚信备案登记外，还需要能识别松茸的产地属性的技术手段，用于区别产地来自不同云南产地的松茸货品。
[0010]中国整个西南地区的松茸外观相近，气味相同，微有口感上的差异，且不同成熟期松茸子实体外观会发生变化，受此影响，仅从感官判断不易辨别产地。王明富等研究者就认为中国西南地区的松茸和日本的松茸即使地理跨度较大，但形态接近，菌丝体不拮抗，属同一品系的松鸾。
[0011]以松茸含有的总蛋白以及多糖类进行分析，这些营养物质在松茸的不同成熟期表达量的不同，受此影响，由此得到的化学分析数据不能用于产地溯源。
[0012]相对于感官以及营养成分的分析，遗传物质的特性不会随着菌体生长而发生显著改变，相对于一个个体，遗传物质从幼到老基本都是稳定的。
[0013]但沙涛等认为滇产松茸的IGS1-RFLP与日产松茸的主要类型十分相似，认为滇产的和日产的松茸可能是同源的。
[0014]直到Murata等(2008)创建了并运用这两套引物pDGSL313_l/pS48和pDGSL719-2/pS48,序列为:pS48:GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ;pDGSL313_l:CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT ;pDGSL719_2:TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT ;采用琼脂糖凝胶电泳技术，对日本、北朝鲜、中国东北省区、中国西南省区、不丹的松茸进行了地理原产地的追溯，开创了利用遗传物质进行松茸原产地溯源的局面。其中对中国东北省的松茸进行pDGSL719-2/pS48的PCR扩增有PCR产物，而对中国西南省区的松茸进行pDGSL719_2/PS48的PCR扩增没有PCR产物，这是区分中国西南省区和东北省区的松茸关键。
[0015]琼脂糖凝胶电泳技术电泳方法自身重复性不佳、分辨率低下、操作时间长，操作人员易接触可能致畸的基因染料，不适宜将来运用于新鲜松茸的溯源检测过程。全自动DNA分析系统基于全自动毛细管电泳的原理，是一种用样量少，环境友好，操作快速，分辨率高，电泳条件固定的PCR产物分离系统，所得出的DNA指纹图谱在数据的重复性和稳定性、量化确定性、以及质量的控制等方面都比琼脂糖凝胶电泳技术得出的DNA指纹图谱更加可靠。
[0016] Murata 等(2006)设计的 pL281/pS48PCR 反应系统，序列为 pL281:
[0017]CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG ；pS48:
[0018]GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ；利用一对引物就可以得到丰富的遗传多态信息，当时Murata等用于区分是否为T.matsutake类的松鸾并未用这套引物进行松鸾原产地的追溯。
[0019]目前除本发明外无任何学者对中国云南松茸主产区的松茸建立过产地属性的DNA指纹图谱。
【发明内容】
[0020]本发明的目的是针对出口松茸的原产地溯源管理的现实需求，补填我国目前没有对中国云南松茸原产地溯源的DNA技术的缺口，提供一种针对中国云南松茸主产区松茸的地属性DNA指纹图谱的构建方法，以及由此方法得到的松茸的产地属性的DNA指纹图谱。从而能够为残留监控中的问题松茸的云南原产地溯源提供理论参考依据。
[0021]本发明的中国云南松茸产地属性DNA指纹图谱的建立具体包括下列步骤:
[0022]一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，使用以下pL281/pS48引物、
[0023]pDGSL313-l/pS48引物、pDGSL719_2/pS48引物的引物序列，引物序列分别为:PL281:
[0024]CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG ；pS48:
[0025]GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ;pDGSL313_l:
[0026]CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT ;pDGSL719_2:
[0027]TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT ;其特征在于，包括如下步骤:
[0028]I)样品DNA提取:对云南各松茸产区的松茸样品进行DNA提取；
[0029]2)按顺序使用 pL281/pS48 引物、pDGSL313_l/pS48 引物、pDGSL719_2/pS48 引物对提取的松茸样品的DNA进行PCR扩增；
[0030]3)运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测；
[0031]4)获得云南松茸的产地 特征属性DNA指纹图谱。
[0032]本发明该方法的具体参数为，
[0033]I)样品DNA提取:取每个地区的鲜松茸样本菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性指套中捻碎；必须选择使用非过柱离心的可破碎细胞壁的商业DNA提取试剂盒提取新鲜样本的DNA ；
[0034]2)按顺序使用 pL281/pS48 引物、pDGSL313_l/pS48 引物、pDGSL719_2/pS48 引物对提取的松茸样品的DNA进行PCR扩增；其中，PCR的反应体系和检测条件:Premix TaqVersion2.010 u L,上游引物 0.5 u M,下游引物 0.5 u M，DNA25_50ng，补 ddH20 M 20 u L,混合均匀后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火温度 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pL281/pS48 引物体系 64°C，pDGSL313-l/pS48 引物体系 64°C，pDGSL719_2/pS48 引物体系 68.5 °C ；
[0035]3)运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测:pDGSL719_2/pS48引物扩增的产物采用DNA Screening kit卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313-l/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹执行分辨率适度的0M500程序进行核酸分析；
[0036]4)获得云南省松茸的产地特征属性DNA指纹图谱。
[0037]1:本发明按照上述步骤即得到云南省大理白族自治州剑川县东山乡、云南省楚雄彝族自治州南华县五街镇地区的松茸产地属性DNA指纹图谱。
[0038]I1:本发明按照在上述步骤3)后增加如下步骤:
[0039]a)单酶限制性酶切体系:10X QuickCut? Bufferl u L, QuickCut? EcoR V0.1 u L,DNA25-50ng,补 ddH20 M 10 u L,混合均匀后，37°C IOmin ；
[0040]b)再次进行pL281/pS48的PCR反应体系:限制性酶切体系10 U L，Premix TaqVersion2.09.8 y L，上游引物 0.5 y M，下游引物 0.5 u M ；
[0041]即得到云南省大理白族自治州剑川县老君山上兰乡、云南省大理白族自治州喜州镇、云南省大理白族自治州宾川县、云南省大理白族自治州祥云县、云南省迪庆藏族自治州香格里拉县的松茸产地属性DNA指纹图谱。
[0042]II1:本发明按照在上述步骤3)后增加如下步骤:
[0043]a)混合酶限制性酶切体系:10 X QuickCut? Bufferl u L, 10 X QuickCut?Bufferl u L, QuickCut? EcoR V0.1 u L, QuickCut? Sph 10.1 u L, DNAl u L,补 ddH20 至
10u L，混合均匀后，37°C IOmin ；
[0044]b)再次进行pL281/pS48的PCR反应体系:限制性酶切体系10 U L，Premix TaqVersion2.09.8 y L，上游引物 0.5 y M，下游引物 0.5 u M ；
[0045]即得到云南省怒江傈僳族自治州兰坪白族普米族自治县和云南省丽江市纳西族自治县玉龙石鼓镇的松茸产地属性DNA指纹图谱。
[0046]本发明方法的优点是方法稳定、重现性好、易于掌握，能将中国云南松茸主产区的松茸溯源至单个产地或者范围较小的片区，可做为中国云南松茸主产区的鲜松茸的原产地溯源的理论方法之一。
[0047] 本发明旨在为判别云南松茸的产地提供参考数据，此方法的推行与运用，可更好的对云南本地产的松茸进行针对性的区域管理提供技术支撑，从而起到保护云南口岸出口的持续性的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0048]图1是实施例1中运用pDGSL719_2/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州剑川县东山乡松茸DNA指纹图谱；
[0049]图2是实施例1中运用pDGSL313_l/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州剑川县东山乡松茸DNA指纹图谱；
[0050]图3是实施例1中运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州剑川县东山乡松茸的DNA指纹图谱；
[0051]图4是实施例2中运用pDGSL719-2/pS48PCR体系得到的云南省楚雄彝族自治州南华县五街镇松茸DNA指纹图谱；
[0052]图5是实施例2中运用pDGSL313_l/pS48PCR体系得到的云南省楚雄彝族自治州南华县五街镇松茸DNA指纹图谱；
[0053]图6是实施例2中运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省楚雄彝族自治州南华县五街镇松茸DNA指纹图谱；
[0054]图7是实施例3中运用pDGSL719_2/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州剑川县老君山上兰乡松茸DNA指纹图谱；
[0055]图8是实施例3中运用pDGSL313-l/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州剑川县老君山上兰乡松茸DNA指纹图谱；
[0056]图9是实施例3中运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州剑川县老君山上兰乡松茸DNA指纹图谱；
[0057]图10是实施例3中采用限制性酶EcoR V处理样本DNA后再运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州剑川县老君山上兰乡松茸DNA指纹图谱；
[0058]图11是实施例4中运用pDGSL719_2/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州喜州镇松茸DNA指纹图谱；
[0059]图12是实施例4运用pDGSL313_l/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州喜州镇松茸DNA指纹图谱；
[0060]图13是实施例4运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州喜州镇松茸DNA指纹图谱；
[0061]图14是实施例4采用限制性酶EcoR V处理样本DNA后再运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州宾川县松茸DNA指纹图谱；
[0062]图15是实施例5中运用pDGSL719_2/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州宾川县松茸DNA指纹图谱；
[0063]图16是实施例5运用pDGSL313_l/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州宾川县松茸DNA指纹图谱；
[0064]图17是实施例5运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州宾川县松茸DNA指纹图谱；
[0065]图18是实施例5采用限制性酶EcoR V处理样本DNA后再运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州祥云县松茸DNA指纹图谱；
[0066]图19是实施 例6中运用pDGSL719_2/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州祥云县松茸DNA指纹图谱；
[0067]图20是实施例6运用pDGSL313_l/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州祥云县松茸DNA指纹图谱；
[0068]图21是实施例6运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州祥云县松茸DNA指纹图谱；
[0069]图22是实施例6采用限制性酶EcoR V处理样本DNA后再运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省大理白族自治州祥云县松茸DNA指纹图谱；
[0070]图23是实施例7中运用pDGSL719-2/pS48PCR体系得到的云南省迪庆藏族自治州香格里拉县松茸DNA指纹图谱；
[0071]图24是实施例7运用pDGSL313-l/pS48PCR体系得到的云南省迪庆藏族自治州香格里拉县松茸DNA指纹图谱；
[0072]图25是实施例7运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省迪庆藏族自治州香格里拉县松茸DNA指纹图谱；
[0073]图26是实施例7采用限制性酶EcoR V处理样本DNA后再运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省迪庆藏族自治州香格里拉县松茸DNA指纹图谱；
[0074]图27是实施例8中运用pDGSL719_2/pS48PCR体系得到的云南省丽江市纳西族自治县玉龙石鼓镇松茸DNA指纹图谱；
[0075]图28是实施例8运用pDGSL313_l/pS48PCR体系得到的云南省丽江市纳西族自治县玉龙石鼓镇松茸DNA指纹图谱；
[0076]图29是实施例8运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省丽江市纳西族自治县玉龙石鼓镇松茸DNA指纹图谱；
[0077]图30是实施例8采用限制性酶EcoR V+Sph I处理样本DNA后再运用pL281/PS48PCR体系得到的云南省丽江市纳西族自治县玉龙石鼓镇松茸DNA指纹图谱；[0078]图31是实施例9中运用pDGSL719_2/pS48PCR体系得到的云南省怒江傈僳族自治州兰坪白族普米族自治县松茸DNA指纹图谱；
[0079]图32是实施例9运用pDGSL313_l/pS48PCR体系得到的云南省怒江傈僳族自治州兰坪白族普米族自治县松茸DNA指纹图谱；
[0080]图33是实施例9运用pL281/pS48PCR体系得到的云南省怒江傈僳族自治州兰坪白族普米族自治县松茸DNA指纹图谱；
[0081]图34是实施例9采用限制性酶EcoR V+Sph I处理样本DNA后再运用pL281/PS48PCR体系得到的云南省怒江傈僳族自治州兰坪白族普米族自治县松茸指纹图谱。
【具体实施方式】
[0082]实施例1
[0083]松茸样本:6个来自云南省大理白族自治州剑川县东山乡的新鲜松茸子实体。
[0084]DNA提取:分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性的指套中抢碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放样孔中，用promega Maxwel 116核酸自 动提取仪提取DNA。
[0085]按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/pS48 引物体系的PCR扩增，扩增条件如下:Premix Taq Version2.010 y L，上游引物(IOmM) I y L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至 20 y L，混合均匀后，94°C 2min ；94°C 30sec,退火温度30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pDGSL719_2/pS48 引物体系 68.5°C，pDGSL313-l/pS48 引物体系 64°C，pL281/pS48 引物体系 64°C。
[0086]pDGSL719-2/pS48 引物扩增的产物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313_l/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹(QIAxcel)执行0M500程序(分辨率更高)进行核酸分析。
[0087]云南省大理白族自治州剑川县东山乡松茸经按顺序依次进行pDGSL719_2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图1至图3。
[0088]图1图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号。
[0089]图1图谱特征:pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。
[0090]图2图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0091]图2图谱特征:pDGSL313-l/pS48引物扩增有273bp条带，个别样本还有60bp和65bp条带。
[0092]图3图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0093]图3图谱特征:pL281/pS48引物扩增一定具有100、155、210、620bp条带
[0094]综合图1至图3的图谱特征，即为云南省大理白族自治州剑川县东山乡松茸的DNA产地属性的指纹图谱，此组图谱信息可为云南省大理白族自治州剑川县东山乡松茸的产地溯源提供参考依据。[0095]实施例2
[0096]松茸样本:6个来自云南省楚雄彝族自治州南华县五街镇的新鲜松茸子实体。
[0097]DNA提取:分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性的指套中抢碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放样孔中，用promega Maxwel 116核酸自动提取仪提取DNA。
[0098]按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/pS48 引物体系的PCR扩增，扩增条件如下:Premix Taq Version2.010 y L，上游引物(IOmM) I y L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至 20 y L，混合均匀后，94°C 2min ；94°C 30sec,退火温度30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pDGSL719_2/pS48 引物体系 68.5°C，pDGSL313-l/pS48 引物体系 64°C，pL281/pS48 引物体系 64°C。
[0099]pDGSL719-2/pS48 引物扩增的产物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313_l/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹(QIAxcel)执行分辨率适当0M500程序进行核酸分析。
[0100]云南省楚雄彝族自治州南华县五街镇松茸经按顺序依次进行PDGSL719-2/PS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图4至图6。
[0101]图4图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号。
[0102]图4图谱特征:pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。
[0103]图5图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0104]图5图谱特征:pDGSL313-l/pS48引物扩增只有273bp条带。
[0105]图6图注:M:DNA Size Marker,大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0106]图6图谱特征:pL281/pS48引物扩增一定具有210、330、800、620bp条带。
[0107]综合图4至图6的图谱特征:即为云南省楚雄彝族自治州南华县五街镇松茸的DNA产地属性的指纹图谱，此组图谱信息可为云南省楚雄彝族自治州南华县五街镇松茸的产地溯源提供参考依据。
[0108]实施例3
[0109]松茸样本:5个来自云南省大理白族自治州剑川县老君山上兰乡的新鲜松茸子实体
[0110]DNA提取:分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性的指套中抢碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放样孔中，用promega Maxwel 116核酸自动提取仪提取DNA。
[0111]将提取的DNA 进行如下酶切反应:10XQuickCut? Buffer (TaKaRa) Iu L,,QuickCut?EcoR V (TaKaRa) 0.2 y L，DNAl y L，补 ddH20 至 10 y L，混合均匀后，37°C IOmin,得到模板DNA2。
[0112]以DNAl 为模板按顺序依次进行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物体系的PCR扩增，扩增条件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至 20 y L，混合均匀后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火温度 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pDGSL719_2/pS48 引物体系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物体系 64°C，pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0113]以DNA2为模板进行pL281/pS48引物体系扩增，扩增条件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至20 u L,混合均匀后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火温度 30sec，72 °C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0114]pDGSL719-2/pS48 引物扩增的产物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313_l/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹(QIAxcel)执行分辨率适当0M500程序进行核酸分析。
[0115]云南省大理白族自治州剑川县老君山上兰乡松茸经按顺序依次进行PDGSL719-2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图7至图10。
[0116]图7图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_05为样品标号?
[0117]图7图谱特征:pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。
[0118]图8图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是 为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_05为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0119]图8图谱特征:pDGSL313-l/pS48引物扩增仅有273bp条带。
[0120]图9图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_05为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。[0121]图9图谱特征:pL281/pS48引物扩增一定具有100、210bp条带，没有155bp的条带。
[0122]图10图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_05为样品标号。
[0123]图10图谱特征:经EcoR V酶切+pL281/pS48引物后，一定呈现固定的由100、155、210、600、620、800bp条带构成的结构图谱。
[0124]综合图7至图10的图谱特征，即为云南省大理白族自治州剑川县老君山上兰乡松茸的DNA产地属性的指纹图谱，此组图谱信息可为云南省大理白族自治州剑川县老君山上兰乡松茸的产地溯源提供参考依据。
[0125]实施例4
[0126]松茸样本:8个来自云南省大理白族自治州喜州镇的新鲜松茸子实体
[0127]DNA提取:分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性的指套中抢碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放样孔中，用promega Maxwel116核酸自动提取仪提取DNA,得到模板DNAl。
[0128]将提取的DNA 进行如下酶切反应:10 X QuickCut? Buffer (TaKaRa) I U L,,QuickCut?EcoR V (TaKaRa) 0.2 y L，DNAl y L，补 ddH20 至 10 y L，混合均匀后，37°C IOmin,得到模板DNA2。
[0129]以DNAl 为模板按顺序依次进行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物体系的PCR扩增，扩增条件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至 20 y L，混合均匀后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火温度 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pDGSL719_2/pS48 引物体系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物体系 64°C，pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0130]以DNA2为模板进行pL281/pS48引物体系扩增，扩增条件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至20 u L,混合均匀后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火温度 30sec，72 °C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0131]pDGSL719-2/pS48 引物扩增的产物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313_l/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹(QIAxcel)执行分辨率适当0M500程序进行核酸分析。
[0132]云南省大理白族自治州喜州镇松茸经按顺序依次进行pDGSL719_2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图11至图14。
[0133]图11图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_08为样品标号.[0134]图11图谱特征:pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。[0135]图12图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_08为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0136]图12图谱特征:pDGSL313-l/pS48引物扩增仅有273bp条带。
[0137]图13图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_08为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0138]图13图谱特征:pL281/pS48引物扩增一定具有100、210bp条带，没有155bp的条带。
[0139]图14图注:M:DNA Size Marker,大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_08为样品标号。
[0140]图14图谱特征:经EcoR V酶切+pL281/pS48引物后，一定呈现固定的由100、155、210、600、620、800bp条带构成的结构图谱。
[0141]综合图11至图14的图谱特征，即为云南省大理白族自治州喜州镇松茸的DNA产地属性的指纹图谱，此组图谱信息可为云南省大理白族自治州喜州镇松茸的产地溯源提供参考依据。
[0142]实施例5
[0143]松茸样本:11个来自云南省大理白族自治州宾川县的新鲜松茸子实体。
[0144]DNA提取:分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性的指套中抢碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放样孔中，用promega Maxwel116核酸自动提取仪提取DNA,得到模板DNAl。
[0145]将提取的DNA 进行如下酶切反应:10 X QuickCut? Buffer (TaKaRa) I U L,,QuickCut?EcoR V (TaKaRa) 0.2 y L，DNAl y L，补 ddH20 至 10 y L，混合均匀后，37°C IOmin,得到模板DNA2。
[0146]以 DNAl 为模板按顺序依次进行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物体系的PCR扩增，扩增条件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至 20 y L，混合均匀后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火温度 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pDGSL719_2/pS48 引物体系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物体系 64°C，pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0147]以DNA2为模板进行pL281/pS48引物体系扩增，扩增条件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至20 u L,混合均匀后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火温度 30sec，72 °C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0148]pDGSL719-2/pS48 引物扩增的产物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313_l/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹(QIAxcel)执行分辨率适当0M500程序进行核酸分析。
[0149]云南省大理白族自治州宾川县松茸经按顺序依次进行pDGSL719_2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图15至图18。
[0150]图15图注:M:DNA Size Marker,大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_11为样品标号.[0151]图15图谱特征:pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。
[0152]图16图注:M:DNA Size Marker,大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_11为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0153]图16图谱特征:pDGSL313-l/pS48引物扩增仅有273bp条带。
[0154]图17图注:M:DNA Size Marker,大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_11为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0155]图17图谱特征:pL281/pS48引物扩增一定具有100、210bp条带，没有155bp的条带。
[0156]图18图注:M:DNA Size Marker,大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_11为样品标号。
[0157] 图18图谱特征:经EcoR V酶切+pL281/pS48引物后，一定呈现固定的由100、155、210、600、620、800bp条带构成的结构图谱。
[0158]综合图15至图18的图谱特征，即为云南省大理白族自治州宾川县松茸的DNA产地属性的指纹图谱，此组图谱信息可为云南省大理白族自治州宾川县松茸的产地溯源提供参考依据。
[0159]实施例6
[0160]松茸样本:6个来自云南省大理白族自治州祥云县的新鲜松茸子实体。
[0161]DNA提取:分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性的指套中抢碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放样孔中，用promega Maxwel116核酸自动提取仪提取DNA,得到模板DNAl。
[0162]将提取的DNA 进行如下酶切反应:10 X QuickCut? Buffer (TaKaRa) I U L,,QuickCut?EcoR V (TaKaRa) 0.2 y L，DNAl y L，补 ddH20 至 10 y L，混合均匀后，37°C IOmin,得到模板DNA2。
[0163]以DNAl 为模板按顺序依次进行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物体系的PCR扩增，扩增条件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I y L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至 20 y L，混合均匀后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火温度 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pDGSL719_2/pS48 引物体系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物体系 64°C，pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0164]以DNA2为模板进行pL281/pS48引物体系扩增，扩增条件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至20 u L,混合均匀后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火温度 30sec，72 °C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0165]pDGSL719-2/pS48 引物扩增的产物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313_l/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹(QIAxcel)执行分辨率适当的0M500程序进行核酸分析。
[0166]云南省大理白族自治州祥云县松茸经按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图19至图22。
[0167]图19图注:M:DNA Size Marker,大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号.[0168]图19图谱特征:pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。
[0169]图20图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0170]图20图谱特征:pDGS`L313-l/pS48引物扩增仅有273bp条带。
[0171]图21图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0172]图21图谱特征:pL281/pS48引物扩增一定具有100、210bp条带，没有155bp的条带。
[0173]图22图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号。
[0174]图22图谱特征:经EcoR V酶切+pL281/pS48引物后，一定呈现固定的由100、155、210、600、620、800bp条带构成的结构图谱。
[0175]综合图19至图22的图谱特征，即为云南省大理白族自治州祥云县松茸的DNA产地属性的指纹图谱，此组图谱信息可为云南省大理白族自治州祥云县松茸的产地溯源提供参考依据。
[0176]实施例7[0177]松茸样本:6个来自云南省迪庆藏族自治州香格里拉县的新鲜松茸子实体。
[0178]DNA提取:分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性的指套中抢碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放样孔中，用promega Maxwel116核酸自动提取仪提取DNA,得到模板DNAl。
[0179]将提取的DNA 进行如下酶切反应:10 X QuickCut? Buffer (TaKaRa) I U L,QuickCut? EcoR V (TaKaRa)0.2WL，DNAl WL，补 ddH20 至 IOli L，混合均匀后，37°C IOmin,得到模板DNA2。
[0180]以DNAl 为模板按顺序依次进行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物体系的PCR扩增，扩增条件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至 20 y L，混合均匀后，94°C 2min ；、94°C 30sec，退火温度 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pDGSL719_2/pS48 引物体系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物体系 64°C，pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0181]以DNA2为模板进行pL281/pS48引物体系扩增，扩增条件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至20 u L,混合均匀后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火温度 30sec，72 °C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0182]pDGSL719-2/pS48 引物扩增的产物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313_l/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹(QIAxcel)执行分辨率适当的0M500程序进行核酸分析。
[0183]云南省迪庆藏族自治州香格里拉县松茸经按顺序依次进行pDGSL719_2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图23至图26。
[0184]图23图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号.[0185]图23图谱特征:pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。
[0186]图24图注:M:DNA Size Marker,大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0187]图24图谱特征:pDGSL313-l/pS48引物扩增仅有273bp条带。
[0188]图25图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0189]图25图谱特征:pL281/pS48引物扩增无IOObp条带，具有210bp和155bp的条带。
[0190]图26图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号。
[0191]图26图谱特征:经EcoR V酶切+pL281/pS48引物扩增后始终不会出现IOObp的条带，部分样本大于250bp以上的片段全部消失。
[0192]综合图23至图26的图谱特征，即为云南省迪庆藏族自治州香格里拉县松茸的DNA产地属性的指纹图谱，此组图谱信息可为云南省迪庆藏族自治州香格里拉县松茸的产地溯源提供参考依据。
[0193]实施例8
[0194]松茸样本:6个来自云南省丽江市纳西族自治县玉龙石鼓镇的新鲜松茸子实体。
[0195]DNA提取:分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性的指套中抢碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放样孔中，用promega Maxwel116核酸自动提取仪提取DNA,得到模板DNAl。
[0196]10XQuickCut? Buffer (TaKaRa)Iu L,10XQuickCut? Buffer (TaKaRa)Iu L,，QuickCut?EcoR V (TaKaRa)0.1u L,QuickCut? Sph I (TaKaRa)0.1u L，DNA1u L，补 ddH20至10 ii L，混合均匀后，37°C IOmin,得到模板DNA2。
[0197]以DNAl 为模板按顺序依次进行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物体系的PCR扩增，扩增条件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至 20 y L，混合均匀后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火温度 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pDGSL719_2/pS48 引物体系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物体系 64°C，pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0198]以DNA2为模板进行pL281/pS48引物体系扩增，扩增条件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至20 u L,混合均匀后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火温度 30sec，72 °C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0199]pDGSL719-2/pS48 引物扩增的产物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313_l/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹(QIAxcel)执行分辨率适当的0M500程序进行核酸分析。
[0200]云南省丽江市纳西族自治县玉龙石鼓镇松茸经按顺序依次进行PDGSL719-2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图27至30。
[0201]图27图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号.[0202]图27图谱特征:pDGSL719_2/pS48引物扩增无条带。
[0203]图28图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。[0204]图28图谱特征:pDGSL313_l/pS48引物扩增仅有273bp条带。
[0205]图29图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0206]图29图谱特征:pL281/pS48引物扩增无IOObp条带，具有210bp和155bp的条带。
[0207]图30图注:M:DNA Size Marker ，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号。
[0208]图30图谱特征:经EcoR V+Sph I酶切+pL281/pS48引物扩增后，大于250bp以上的片段全部消失，仅在100、155、210、250bp处出现条带。
[0209]综合图27至图30的图谱特征即为云南省丽江市纳西族自治县玉龙石鼓镇松茸的DNA产地属性的指纹图谱，此组图谱信息将来可为云南省丽江市纳西族自治县玉龙石鼓镇松茸的产地溯源提供参考数据。
[0210]实施例9
[0211]松茸样本:6个来自云南省怒江傈僳族自治州兰坪白族普米族自治县的新鲜松茸子实体。
[0212]DNA提取:分别取菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性的指套中抢碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放样孔中，用promega Maxwel116核酸自动提取仪提取DNA,得到模板DNAl。
[0213]将提取的DNA 进行如下酶切反应:10 X QuickCut? Buffer (TaKaRa) I U L,,10XQuickCut?Buffer (TaKaRa)I u L, QuickCut? EcoR V (TaKaRa)0.1 u L, QuickCut? SphI (TaKaRa) 0.1 u L, DNAl u L,补 ddH20 M 10 u L,混合均匀后，37°C IOmin,得到模板 DNA2。
[0214]以DNAl 为模板按顺序依次进行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物体系的PCR扩增，扩增条件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至 20 y L，混合均匀后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火温度 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pDGSL719_2/pS48 引物体系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物体系 64°C，pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0215]以DNA2为模板进行pL281/pS48引物体系扩增，扩增条件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,补 ddH20 至20 u L,混合均匀后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火温度 30sec，72 °C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pL281/pS48 引物体系 64。。。
[0216]pDGSL719-2/pS48 引物扩增的产物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313_l/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹(QIAxcel)执行分辨率适当的0M500程序进行核酸分析。
[0217]云南省怒江傈僳族自治州兰坪白族普米族自治县松茸经按顺序依次进行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/pS48引物体系扩增得到的DNA指纹图谱见图31 至 34。
[0218]图31图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号.[0219]图31图谱特征:pDGSL719-2/pS48引物扩增无条带。
[0220]图32图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号；三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带。
[0221]图32图谱特征:pDGSL313-l/pS48引物扩增仅有273bp条带。
[0222]图33 图注:DNA Size Marker ;每一个泳道都有的 15bp 和 1000bp 为 AlignmentMarker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道，使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小。三角形标注的地方表示此大小的条带为样品间共有条带，角型括符标注的地方某些产地特有的一段区间内的扩增条带系列。
[0223]图33图谱特征:pL281/pS48引物扩增一定具有100、620、210bp条带，且在210-620bp间有其他多态性扩增条带，但同一地区样本间无共有性。
[0224]图34图注:M:DNA Size Marker，大小单位为bp ;每一个泳道都有的15bp和1000bp为Alignment Marker,不是PCR的扩增产物，作用是为了对齐每一个泳道,使PCR产物的电泳条带能够准确锚定于DNA Size Marker区间里，以便准确读出产物大小；01_06为样品标号。
[0225]图34图谱特征:经EcoR V+Sph I酶切+pL281/pS48引物扩增后，具有600bp、620、800bp的条带,多态性扩增条带区间消失。
[0226]综合图31至图34的图谱特征即为云南省怒江傈僳族自治州兰坪白族普米族自治县松茸的DNA产地属性的指纹图谱，此组图谱信息将来可为云南省怒江傈僳族自治州兰坪白族普米族自治县松茸的产地溯源提供参考数据。
[0227]运用pL281/pS48引物的指纹图谱总结
[0228]pL281/pS48引物得到的多态性较高，为了便于理解由此得到的图谱特征，用下述表格进行总结。
[0229]表1运用pL281/pS48引物的指纹图谱总结
【权利要求】
1.一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，使用以下pL281/pS48引物、 pDGSL313-l/pS48引物、pDGSL719_2/pS48引物的引物序列，引物序列分别为:pL281:
CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG ；pS48:
GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ;pDGSL313_l:
CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT ;pDGSL719_2: TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT ;其特征在于，包括如下步骤: 1)样品DNA提取:对云南各松茸产区的松茸样品进行DNA提取； 2)按顺序使用pL281/pS48 引物、pDGSL313-l/pS48 引物、pDGSL719_2/pS48 引物对提取的松茸样品的DNA进行PCR扩增； 3)运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测； 4)获得云南松茸的产地特征属性DNA指纹图谱。
2.根据权利要求1所述的一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，该方法的具体参数为， 1)样品DNA提取:取每个地区的鲜松茸样本菌褶部分500mg，以一个子实体用一个指套放入一次性PE手套为原则，放入一次性指套中捻碎；必须选择使用非过柱离心的可破碎细胞壁的商业DNA提取试剂盒提取新鲜样本的DNA ； 2)按顺序使用pL281/pS48 引物、pDGSL313-l/pS48 引物、pDGSL719_2/pS48 引物对提取的松茸样品的DNA进行PCR扩增；其中，PCR的反应体系和检测条件:Premix TaqVersion2.0lO y L，上游引物 0.5 y M，下游引物 0.5 y M，DNA25_50ng，补 ddH20 至 20 y L，混合均匀后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火温度 30sec，72°C lmin，30 个循环；72°C IOmin0 退火温度:pL281/pS48 引物体系 64°C，pDGSL313-l/pS48 引物体系 64°C，pDGSL719_2/pS48 引物体系 68.5 °C ； 3)运用QIAxcel全自动DNA分析系统进行产物检测:pDGSL719_2/pS48引物扩增的产物采用DNA Screening kit卡夹执行AL300程序进行核酸分析；pL281/pS48引物扩增的产物和pDGSL313-l/pS48引物扩增的产物采用DNA High Resolution kit卡夹执行分辨率适度的0M500程序进行核酸分析； 4)获得云南省松茸的产地特征属性DNA指纹图谱。
3.根据权利要求2所述的一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，按照该步骤即得到云南省大理白族自治州剑川县东山乡、云南省楚雄彝族自治州南华县五街镇地区的松茸产地属性DNA指纹图谱。
4.根据权利要求2所述的一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，该方法在步骤3)后还包括如下步骤: a)单酶限制性酶切体系:10XQuickCut?Buffer I u L, QuickCut? EcoR V0.1 u L,DNA25-50ng,补 ddH20 M 10 u L,混合均匀后，37°C IOmin ； b)再次进行pL281/pS48的PCR反应体系:限制性酶切体系10ii L，Premix TaqVersion2.09.8 y L，上游引物 0.5 y M，下游引物 0.5 y M ; 即得到云南省大理白族自治州剑川县老君山上兰乡、云南省大理白族自治州喜州镇、云南省大理白族自治州宾川县、云南省大理白族自治州祥云县、云南省迪庆藏族自治州香格里拉县的松茸产地属性DNA指纹图谱。
5.根据权利要求2所述的一种云南省松茸的产地属性DNA指纹图谱的建立方法，其特征在于，该方法在步骤3)后还包括如下步骤: a)混合酶限制性酶切体系:10XQuickCut? Bufferl u L, 10 X QuickCut? Bufferl u L,QuickCut? EcoR V0.1 u L, QuickCut? Sph 10.1 u L, DNAl u L,补 ddH20 M 10 u L,混合均匀后，37°C IOmin ； b)再次进行pL281/pS48的PCR反应体系:限制性酶切体系10ii L，Premix TaqVersion2.09.8 y L，上游引物 0.5 y M，下游引物 0.5 y M ; 即得到云南省怒江傈僳族自治州兰坪白族普米族自治县和云南省丽江市纳西族自治县玉龙石鼓镇的松茸产地属性DNA指纹图谱。
【文档编号】C12Q1/68GK103571966SQ201310594661
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】陈丽萍, 陈芸, 刘忠民, 赵永昌, 陈立佼, 陈卫民, 李树红, 岳亮亮, 李旻, 丁元明, 杨玲春, 滕平, 王裔耿, 李云飞, 殷红, 陈宏仙, 颜庆, 傅士华 申请人:云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心