IgE介导肥大细胞脱颗粒模型的建立的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种建立人肥大细胞脱颗粒模型的方法，具体包含步骤：1）提供肥大细胞系细胞，检测细胞的生长曲线；2）建立1种或多种指标物检测的标准曲线；3）活化步骤1）所述的肥大细胞系细胞，将活化的肥大细胞系细胞在900rpm×5min离心，取上清液作为检测样本；4）使用如步骤2）所述的1种或多种指标物检测步骤3）所述的检测样本。本发明还进一步提供了根据上述方法建立的人肥大细胞脱颗粒模型。本发明提供的建立人肥大细胞脱颗粒模型的方法及人肥大细胞脱颗粒模型有效的降低了成本，并且明显缩短建立人肥大细胞脱颗粒模型的时间，提高了工作效率。
【专利说明】IgE介导肥大细胞脱颗粒模型的建立
【技术领域】
[0001] 本发明涉及到I型超敏反应的研究领域，具体涉及IgE介导的肥大细胞脱颗粒模
型的建立。
【背景技术】
[0002]I型超敏反应发作迅速、强烈，但消退亦快，故又称速发型超敏反应或过敏反应，主要由血清中IgE介导引起，是临床上最多见的一种变态反应性疾病。有明显的个体差异和遗传素质。I型超敏反应的发生常分为两个阶段:致敏阶段和发敏阶段。
[0003]在I型超敏反应的发生的致敏阶段，变应原进入机体，激活⑶4’ Th2细胞和B细胞，诱导产生特异性IgE抗体(少数人产生IgC4)。其Fe段能与肥大细胞和嗜碱粒细胞膜表面结合，使机体处于致敏状态。具体为变应原通过呼吸道、消化道、注射等途径遗入机体，激活⑶4’ Th2细胞，⑶4’ Th2细胞及其分泌的IL-4等细胞因子可诱导变应原特异性B细胞增殖分化为产生特异性IgE抗体的浆细胞，从而产生特异性IgE。IgE吸附于肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面。
[0004]肥大细胞主要分布于结缔组织和黏膜下层，嗜碱粒细胞主要分布于外周血液。这两类细胞表面均表达高亲和性IgE Fe受体，可与IgE的Fe段结合，使机体处于致敏状态。
[0005]在I型超敏反应的发生的发敏阶段，当相同变应原再次进入机体时，与致敏靶细胞(即肥大细胞和嗜碱性粒细胞)表面IgE Fab段特异性结合，触发靶细胞(即肥大细胞和嗜碱性粒细胞)的细胞膜变化，使其脱颗粒及合成新的活性介质。这些介质作用于相应的效应器官，引起效应器官病理改变。肥大细胞和嗜碱粒细胞活化后释放的活性介质主要有组胺、激肽原酶、白三烯、前列腺素D2、血小板活化因子。
[0006]为了研究I型超敏反应和抑制由IgE介导的过敏性疾病通常需要利用从人骨髓及脐血中分离诱导培养的肥大细胞建立人肥大细胞脱颗粒模型，但是，从人骨髓及脐血中分离诱导培养的肥大细胞，成本昂贵、培养周期较长，因此如何将获得的永生化人肥大细胞系用于过敏反应研究，建立由IgE介导的人肥大细胞脱颗粒模型是研究I型超敏反应和抑制由IgE介导的过敏性疾病急需解决的问题。
【发明内容】
[0007]针对上述需要，本发明提供了一种基于永生化肥大细胞系的建立人肥大细胞脱颗粒模型的方法，其技术方案具体如下:
[0008]建立人肥大细胞脱颗粒模型的方法，其步骤为:
[0009]I)提供肥大细胞系细胞，检测细胞的生长曲线；
[0010]2)建立I种或多种指标物检测的标准曲线；
[0011]3)活化步骤I)所述的肥大细胞系细胞，将活化的肥大细胞系细胞在900rpmX5min离心,取上清液作为检测样本；
[0012]4)使用如步骤2)所述的I种或多种指标物检测步骤3)所述的检测样本；[0013]其中，步骤3)所述的活化步骤I)所述的肥大细胞系细胞的步骤是:
[0014]a)将所述肥大细胞系细胞离心后用台式液重悬，并调整细胞浓度为IXlO6细胞/ml ；
[0015]b)取5份细胞悬液，分别加入Biotin-1gE使所述Biotin-1gE的终浓度分别为O、50、100、500、1000ng/ml ；
[0016]c)将如步骤b)所述分别添加过Biotin-1gE的细胞悬液置于37°C孵育2小时；
[0017]d)将如步骤c)所述孵育后的5份细胞悬液离心去除上清，得到5份细胞沉淀物；
[0018]e)向步骤d)所述的5份细胞沉淀物中分别添加台式液，并且分别添加链霉亲和素，使每份中所述链霉亲和素终浓度为1000ng/ml，混匀并重悬细胞，得到5份细胞重悬液；
[0019]f)将步骤e)所述的5份细胞重悬液37°C孵育半小时，吹打细胞至悬浮，900gX 5min 离心。
[0020]优选地，步骤I)所述的肥大细胞系细胞为LAD2细胞。
[0021]进一步优选地，步骤2)所述的指标物为组胺和/或氨基己糖苷酶。
[0022]本发明还进一步提供了根据前述的方法建立的人肥大细胞脱颗粒模型。
[0023]通过本 发明提供的建立人肥大细胞脱颗粒模型的方法及人肥大细胞脱颗粒模型成功将获得的永生化人肥大细胞系用于过敏反应研究，有效地降低了为研究I型超敏反应和抑制由IgE介导的过敏性疾病而建立的由IgE介导的人肥大细胞脱颗粒模型的研究成本，并且缩短了建立由IgE介导的人肥大细胞脱颗粒模型所需要的时间，提高了工作效率。
[0024]从人静脉血或脐血中分离纯化诱导生成的肥大细胞，诱导周期一般为7-8周，诱导培养过程中所需要的因子除干细胞因子外，还需要白介素3和白介素6，培养成本高及周期长，限制了其应用。
[0025]在LAD2细胞培养过程中，发明人发现细胞倍增时间为10天，与Nagai K等人2012年报道的生长状态一致。在细胞传代培养期间，状态较好的细胞一般会均匀的平铺于细胞培养瓶底部，而状态稍差的细胞可能会聚集成团，轻轻吹打并继续培养后细胞状态会逐渐恢复。
[0026]脱颗粒是肥大细胞激活的标志，组胺是肥大细胞脱颗粒的主要炎性介质。由于组胺分子量小，无免疫原性，在血浆中半衰期较短，在临床检测中存在一定难度。目前实验室检测组胺常用的方法有酶联免疫分析法、荧光分光光度法、放射免疫分析法。郭永超等采用荧光分光光度法，利用组胺样本与邻二甲苯(OPT)共孵育后进行检测，该方法结果不够稳定(郭永超，李振兴，林洪.组胺、类胰蛋白酶、β-氨基己糖苷酶在肥大细胞体外释放过程中的相互关系[J].细胞与分子免疫学杂志，2009，259 (12): 1073-1075)。放射免疫法虽然灵敏性高，但是复杂耗时，特别是每个实验室均需自行分离甲基转移酶(孙仁山，刘荣卿.肥大细胞脱颗粒的标志[J].国外医学临床生物化学与检验学分册，2001，22(2):100-101)。本发明应用的酶联免疫法，将组胺样本酰基化后，添加组胺碱性酶联物共孵育进行检测，检测结果稳定可靠。组胺释放水平随着Biotin-1gE浓度的升高而逐渐升高，可以应用于IgE介导的肥大细胞脱颗粒研究。组胺及β_氨基己糖苷酶是肥大细胞脱颗粒的常用检测指标。检测肥大细胞脱颗粒还可以用类胰蛋白酶、前列腺素、白介素、TNF等，本发明优选地利用组胺及β-氨基己糖苷酶两个指标成功建立的IgE介导的LAD2细胞脱颗粒模型，为进一步研究I型超敏反应奠定了基础。[0027]目前应用较多的肥大细胞系有大鼠嗜碱性粒细胞来源的RBL-2H3细胞，小鼠肥大细胞瘤P815细胞，人肥大细胞系有HMC-1细胞和LAD2细胞。人肥大细胞系HMC-1的IgE高亲和力受体(Fe ε RI)表达水平低、颗粒含量少。新近建立的肥大细胞系LAD2细胞来源于一肥大细胞增多症患者的骨髓，由美国国立卫生研究院过敏性疾病实验室(laboratoryof allergic diseases)建系成功,从表型、核型及过敏介质等方面证实了该细胞几乎包含完整的人原代培养肥大细胞的生物学特征，更适合进行I型超敏反应的研究。
[0028]本发明培养和鉴定了该肥大细胞系，建立了由IgE介导的人肥大细胞脱颗粒模型。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1a所示为普通倒置显微镜(X 200)下观察的LAD2细胞的形态；
[0030]图1b所示为经0.5%甲苯胺蓝染色后，在倒置显微镜(X 200)下观察的LAD2细胞的形态；
[0031]图1c所示为经改良吉姆萨染色后，在倒置显微镜(X200)下观察的LAD2细胞的形态；
[0032]图1d所示为LAD2细胞透射电镜(X8000)观察的LAD2细胞的形态；
[0033]图2所示为LAD2细胞生长曲线；
[0034]图3所示为测定组胺的标准曲线，其中相关系数r=0.99945 ；
[0035]图4所示为随着致敏浓度的升高，组胺的释放水平逐渐升高的条形图；
[0036]图5所示随着致敏浓度的升高，β -氨基己糖苷酶的释放水平逐渐升高的条形图。
【具体实施方式】
[0037]为了使本发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0038]试剂及细胞
[0039]Biotin-1gE (USBiological )，细胞培养基(STEMPR0-34SFM Complete Medium),LAD2细胞(中国人民解放军第三军医大学第三附属医院)。重组人干细胞因子(P印lOtech)，谷氨酰胺、青链霉素溶液(Gibco)，组胺检测试剂盒(BECKMAN)，MTT (碧云天)，吉姆萨改良型染液、β -氨基己糖、柠檬酸、柠檬酸钠(sigma)，2.5%的戊二醛(市售产品，分析纯)，链霉亲和素甲苯胺蓝、二甲基亚砜、台盼蓝、甲苯胺蓝、TritionX-1OO (上海生工)。配制含钙台式液(Tyrode)及Na2C03/NaHC03缓冲液所需试剂均为国产分析纯。
[0040]仪器
[0041 ] 二氧化碳细胞培养箱(Thermo)，低温台式离心机(BECKMAN)，倒置显微镜(OLYMPUS 1X70)，透射电子显微镜(日本日立公司H-7500)。
[0042]实施例1LAD2细胞的培养
[0043]LAD2细胞培养于50ml的培养瓶中，每瓶5ml完全培养基。完全培养基包含StemPro-34Nutrient Supplement、100IU/ml 青霉素、lOOug/ml 链霉素、2mM 谷氨酸胺、100ng/ml重组人干细胞因子。细胞密度应维持在0.5X106-lX106/ml，每周半量更换新鲜培养基。利用六个96孔板，10000个细胞/孔，200ul培养基/孔，每隔3天半量更换培养基，并利用MTT法检测细胞的生长曲线。
[0044]实施例2LAD2细胞的组织学染色和电镜观察
[0045]倒置显微镜下观察细胞基本形态，台盼蓝检测活力、吉姆萨染色，甲苯胺蓝染色、电镜超微结构观察。
[0046]参照图1a-图ld，普通倒置显微镜下观察，LAD2细胞呈不规则圆形，直径约为18-22um (如图1a所示)。经0.5%甲苯胺蓝染色后LAD2细胞的细胞核呈深灰色，胞浆颗粒呈浅灰色(如图1b所示);经改良吉姆萨溶液染色后LAD2细胞的细胞核呈深灰色，胞浆颗粒呈浅灰色(如图1c所示);透射电镜下LAD2细胞的细胞核(在图1d中以N标示)周围聚集大量大小不等颗粒(如图1d所示)。
[0047]实施例3建立组胺检测的标准曲线
[0048]按照组胺检测试剂盒说明书进行，简述如下:取6个1.5mlEP管，分别添加25ul的酰基缓冲液，分别添加IOOul的组胺标准品，浓度分别为0nM、lnM、3nM、10nM、30nM、100nM。分别添加25ul酰基试剂并且立即涡旋。吸50ul酰基化标准品到抗体包被孔中。添加200ul/孔的酶联物。放4°C冰箱孵育18h。人工洗板三次后各添加200ul的底物。18-25°C避光，边摇晃边孵育30min。添加50ul的终止缓冲液。在405nm处读吸光度OD值，各浓度标准品做一复孔。CurceExpertl.3软件绘制标准曲线。 [0049]在MTT法测定实验中，发明人利用检测过程中甲臜生成量与活细胞数成正比的关系，根据光密度OD值推测出活细胞的数目。结果显示LAD2细胞倍增时间为10天(如图2所示)。
[0050]组胺试剂盒的工作原理是竞争ELISA，组胺浓度越高，OD值越低。组胺标准品的浓度分别为ΟηΜ、1ηΜ、3ηΜ、10nM、30nM、IOOnM0以OD值为纵坐标，组胺浓度为横坐标，绘制标准曲线如图3。
[0051]实施例4IgE介导的LAD2细胞的活化
[0052]LAD2细胞离心后用台式液重悬，调整细胞浓度为I X IO6细胞/ml，取5支1.5mlEP管，每管添加0.5ml细胞悬液，依次加入Biotin-1gE使其终浓度分别为0、50、100、500、1000ng/ml，37°C孵育2小时。离心去上清后，添加台式液0.5ml，然后分别添加链霉亲和素5ul，使其终浓度为1000ng/ml，混匀并重悬细胞，37°C孵育半小时。吹打细胞至悬浮，900gX5min离心。实验阴性对照:用ddH20来代替Biotin-1gE ;总β-氨基己糖苷酶释放:0.5ml 细胞悬液 1000rpmX 5min 离心后，加入 0.5mlTritionX-100 反应 30min 后，900gX5min离心取上清做为检测样本。实验中均采用3个平行实验管，重复实验三次。
[0053]实施例5组胺检测
[0054]组胺检测样本的酰基化和酶联步骤同实施例3的步骤。
[0055]实施例6 β -氨基己糖苷酶检测
[0056]吸取上清液30ul于96孔板上，加入50ul的ImM氨基己糖与30ul细胞上清液在37°C培养箱中反应2小时。2h后用0.lmol/L的Na2C03/NaHC03终止反应，并用酶标仪检测410nm下的观光度。
[0057]实验中采用逐渐升高的的Biotin-1gE致敏浓度(0-1000ng/ml)，2小时后用链霉亲和素(1000ng/ml)激活肥大细胞，结果显示随着致敏浓度的升高，组胺和β -氨基己糖苷酶的释放水平逐渐升高，并于500-1000ng/ml达到平台期(图4、图5)。β -氨基己糖苷酶释放率的计算公式为:β -氨基己糖苷酶释放率％=刺激β -氨基己糖苷酶释放量/总β -氨基己糖苷酶释放量％。
[0058]实施例7统计学处理
[0059]采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，数据用Z ± S表示，2组间比较采用两样本均数t检验。P <0.01提示差异具有显著性。P>0.05提示无明显统计学意义。 [0060]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
【权利要求】
1.一种建立人肥大细胞脱颗粒模型的方法，其特征在于，包含步骤: 1)提供肥大细胞系细胞，检测细胞的生长曲线； 2)建立I种或多种指标物检测的标准曲线； 3)活化步骤I)所述的肥大细胞系细胞，将活化的肥大细胞系细胞在900rpmX5min离心,取上清液作为检测样本； 4)使用如步骤2)所述的I种或多种指标物检测步骤3)所述的检测样本。
2.如权利要求1所述的建立人肥大细胞脱颗粒模型的方法，其特征在于，步骤3)所述的活化步骤I)所述的肥大细胞系细胞的步骤是:a)将所述肥大细胞系细胞离心后用台式液重悬，并调整细胞浓度为IX IO6细胞/ml ； b)取5份细胞悬液，分别加入Biotin-1gE使所述Biotin-1gE的终浓度分别为0、50、100、500、1000ng/ml ； c)将如步骤b)所述分别添加过Biotin-1gE的细胞悬液置于37°C孵育2小时； d)将如步骤c)所述孵育后的5份细胞悬液离心去除上清，得到5份细胞沉淀物； e)向步骤d)所述的5 份细胞沉淀物中分别添加台式液，并且分别添加链霉亲和素，使每份中所述链霉亲和素终浓度为1000ng/ml,混匀并重悬细胞,得到5份细胞重悬液； f)将步骤e)所述的5份细胞重悬液37°C孵育半小时，吹打细胞至悬浮，900gX5min离心。
3.如权利要求1所述的建立人肥大细胞脱颗粒模型的方法，其特征在于，步骤I)所述的肥大细胞系细胞为LAD2细胞。
4.如权利要求1或2所述的建立人肥大细胞脱颗粒模型的方法，其特征在于，步骤2)所述的指标物为组胺和/或β-氨基己糖苷酶。
5.一种根据权利要求1-3任一项所述的方法建立的人肥大细胞脱颗粒模型。
【文档编号】C12N5/0787GK103614337SQ201310594931
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】孙仁山, 陈晓红, 杨永强, 冉新泽 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院