一种芽孢杆菌fh3菌株及其筛选方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于微生物【技术领域】，特别涉及一种芽孢杆菌FH3菌株及其筛选方法和应用，所述芽孢杆菌FH3菌株的保藏号为CGMCC?NO.8269，该菌株酶解浒苔的应用方法为，将冻存的FH3菌株于LB斜面培养基中活化培养，然后挑取一满环于LB液体培养基中，振荡培养24-28h后取1-2mL菌液于已灭菌纤维素液体发酵培养基中，振荡培养5-7天；再将发酵液低温离心，取上清液为粗酶液或是将发酵液过滤，取滤液为粗酶液。将粗酶液与干净的浒苔粉于45-55℃条件下反应。所述芽孢杆菌FH3菌株具有产纤维素酶的能力，能有效地将浒苔中的纤维素类物质降解为还原糖，而且生产成本低，设备简单，反应温和，适合大规模工业生产。
【专利说明】一种芽孢杆菌FH3菌株及其筛选方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，特别涉及一种芽孢杆菌--3菌株及其筛选方法和应用。
【背景技术】
[0002]目前，世界石油资源供应渐趋紧张、环境污染日益严重，能源问题也越来越受到人们的关注。近两年来，各大能源消费国竞先寻求替代石油的新能源，生物乙醇燃料以其突出的环保性和可再生性，受到许多国家的重视和积极扶持。生物乙醇作为可再生资源，可减少对石油的消耗，能直接作为液体燃料或者同汽油混合使用。
[0003]2007年开始，我国黄海海域连续7年爆发大规模浒苔，浒苔糖类成分分析结果显示，其纤维素含量为13.3%、半纤维素含量为28.01%、淀粉含量为2.475%、水溶性多糖含量为11.503%、水溶性戊聚糖含量11.25%。纤维素是由葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的线状大分子物质，是地球上最丰富的多糖物质。1904年，在蜗牛消化液中人们首次发现了纤维素酶，从此，对于纤维素酶的研究日益深入。纤维素酶并不是单一酶，是一个酶系的总称。浒苔中的纤维素是用于制取生物乙醇的主要成分，在对浒苔中的纤维素降解时，一般采用商品纤维素酶，但是，商品纤维素酶成本较高，纤维素酶解过程对环境造成污染，不适合大规模工业生产。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种芽孢杆菌--3菌株，该菌株可分泌纤维素酶，对浒苔中的纤维素类物质有降解效果`，可将纤维素有效降解为还原糖，为浒苔进一步能源化利用奠定了基础。
[0005]本发明的另一目的是提供一种芽孢杆菌--3菌株的筛选方法。
[0006]本发明的另一目的是提供一种芽孢杆菌FH3菌株酶解浒苔的应用方法。
[0007]为了实现以上技术效果，本发明通过如下技术方案来实现:
[0008]一种芽孢杆菌--3菌株，其特征在于:保藏号为CGMCC N0.8269
[0009]上述芽孢杆菌Π13菌株的筛选方法，其步骤包括:
[0010](I)将腐烂的浒苔藻体的悬液加入到选择培养基中，摇床培养2-3天；
[0011](2)将步骤(1)中的选择培养液经梯度稀释后的菌悬液，涂布在鉴别培养基上，待菌落长出；
[0012](3)在长出菌落的平板上用刚果红染色法筛选有透明圈的菌株，并用平板划线分离法分离、提纯。
[0013]所述步骤(1)中，腐烂的浒苔藻体的悬液与选择培养基的体积比为1:25-45 ;摇床培养的温度为25-35°C，转速为135-145r/min。
[0014]所述步骤(1)中，选择培养基中的组分包括纤维素粉、硝酸钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母膏、水解酪素及陈海水，各组分的加入配比依次为3-5g:lg:0.3-0.5g:1.1-1.3g:0.8~lg:0.4-0.5g:0.4-0.5g:0.4-0.5g:950_1050mL。
[0015]所述步骤(2)中，鉴别培养基中的组分包括羧甲基纤维素钠、酵母膏、磷酸二氢钾、琼脂、土豆汁及陈海水，各组分的加入配比依次为5-10g:lg:0.1-0.3g:12-16g:90-1 IOmL:950_1050mL。
[0016]上述芽孢杆菌--3菌株酶解浒苔的应用方法:
[0017](a)将芽孢杆菌Π13菌株于LB液体培养基中振荡培养22_26小时，然后在菌液中加入冻存缓冲液，于-20—25°C保存；
[0018](b)将步骤(a)中的芽孢杆菌FH3菌株于LB斜面培养基中斜面活化培养，然后挑取一满环于LB液体培养基中，振荡培养24-28h后取l-2mL菌液于已灭菌纤维素液体发酵培养基中，振荡培养5-7天；将发酵液低温离心，取上清液为粗酶液或是将发酵液过滤，取滤液为粗酶液；
[0019](c)将干净的浒苔干燥、粉碎，然后与步骤(b)中的粗酶液于45_55°C条件下反应45-50小时。
[0020]所述步骤(a)中，振荡培养的温度为25-35°C，转速为135_145r/min ;所述缓冲液是体积浓度为45-55%的甘油，缓冲液与LB培养基的体积比为1: 1-1.5。
[0021]所述步骤(b)中，振荡培养的温度为30-35°C，转速为135-145r/min ;离心分离温度为3-5°C，离心转速为3500-4500r/min，离心时间为10-20分钟。
[0022]所述步骤(b)中，纤维素液体发酵培养基中的组分包括酵母浸膏、蛋白胨、羧甲基纤维素钠及陈海水，各组分的加入配比依次为Ig:3-6g:8-12g:950-1050mL。
[0023]所述步骤(c)中，将干净的浒苔于55_`65°C下干燥10-14小时，然后粉碎至70-90目；浒苔与粗酶液的加入量比为lg:45-55mL。
[0024]本发明的陈海水由上海金山区城市沙滩海域采集备用。
[0025]本发明筛选得到的菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.8269，保藏日期为2013年9月23日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，其16S rDNA序列，如下SEQ ID N0.1所示:
[0026]本发明的有益效果是:1、本发明提供的芽孢杆菌FH3菌株可分泌纤维素酶，而且在应用时，直接将该菌株的液体发酵体系与浒苔纤维素作用，能有效地将浒苔中的纤维素降解为还原糖，为更进一步地制备生物乙醇做好准备。2、本发明以绿潮藻浒苔为原料，变废为宝，而且生产成本低，设备简单，反应温和，操作简便，适合大规模工业生产。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例，对本发明作进一步说明:
[0028]陈海水:是指由上海金山区城市沙滩海域大量采集备用的海水。
[0029]实施例1
[0030]芽孢杆菌--3菌株的筛选
[0031](I)分别采自自然条件生长及绿潮海域密集漂浮的腐烂浒苔藻体，采集地为山东青岛第一海水浴场和第六海水浴场。采集后用保温箱低温运输带回实验室进行细菌筛选。
[0032]将采集到的腐烂浒苔藻体悬液lmL，加入装有30mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，30°C，140r/min震荡培养2~3天，直至培养液变浑浊。
[0033]其中选择培养基为:纤维素粉5g，
[0034]硝酸钠Ig,
[0035]氯化钾0.5g，
[0036]磷酸氢二钠1.2g,
[0037]磷酸二氢钾0.9g,
[0038]硫酸镁0.5g，
[0039]酵母膏0.5g，
[0040]水解酪素0.5g, [0041]陈海水1000mL。
[0042](2)将选择培养后的培养基进行梯度稀释:10' 10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，将稀释度为10_5、10_6的菌悬液各取0.2mL涂布在鉴别培养基上，48h后观察菌落。
[0043]其中鉴别培养基为:羧甲基纤维素钠5-10g，
[0044]酵母膏lg，
[0045]磷酸二氢钾0.25g,
[0046]土豆汁 IOOmL,
[0047]琼脂15g，
[0048]陈海水1000mL。
[0049](3)在长出菌落后的鉴别培养基平板上滴加1%的刚果红溶液染色，15min后倒去多余刚果红溶液，然后加入lmol/L的氯化钠溶液，荡去表面刚果红，15min后倒去溶液，观察透明圈，测量透明圈的直径，将透明圈较大的菌株进行平板划线分离得到纯菌株。
[0050]实施例2
[0051]粗酶液的制取。
[0052](I)将实施例1中得到的芽孢杆菌--3于LB液体培养基中，28 V，140r/min培养24h，然后在菌液中添加冻存缓冲液。缓冲液的体积浓度为50%的甘油，缓冲液与菌液的加入体积比为1:1，加入冻存缓冲液，为了更好地保护芽孢杆菌FH3菌株，使得该菌株不会因为脱水而死亡。
[0053](2)将上述中的芽孢杆菌--3菌株于LB培养基中斜面活化培养，活化2代后挑取一满环于LB液体培养基中，28°C, 140r/min培养24h后取ImL于50mL灭菌冷却的纤维素液体发酵培养基中，350C、140r/min振荡培养6天。
[0054]其中液体发酵培养基为:
[0055]酵母浸膏lg，
[0056]蛋白胨5g，
[0057]羧甲基纤维素钠10g，
[0058]陈海水1000ml。
[0059](3)将步骤(2)中得到的液体发酵培养液于4°C，4000r/min离心15分钟，取上清液作为粗酶液。
[0060]粗酶液的活性测定:
[0061]滤纸酶活(FPA)测定:将新华I号滤纸剪成I X 6cm大小卷成小卷,放进25mL比色管内，加入ImL柠檬酸缓冲液(pH=4.8)，再加入ImL本实施例中制得的粗酶液，摇匀使滤纸完全浸泡在溶液中，50°C准确保温Ih后立即按DNS法测还原糖，测得酶活力为22.55U/mL。
[0062]CMC酶活测定:移取ImL本实施例中所得的粗酶液于25mL比色管中，加入ImL含
0.5% CMC-Na的柠檬酸缓冲液(pH=4.4)，50°C准确保温30min后立即按DNS法测还原糖，测得酶活力为49.57U/mL。
[0063]实施例3
[0064]粗酶液的制取。
[0065]步骤(1)和步骤(2 )同实施例2。
[0066](3)将步骤(2)中得到的液体发酵培养液过滤，取其过滤溶液作为粗酶液。
[0067]粗酶液的活性检测:
[0068]滤纸酶活(FPA)测定:测定方法同实施例2，测得酶活力为27.83U/mL。
[0069]CMC酶活测定:测定方法同实施例2，测得酶活力为56.98U/mL。
[0070]实施例4
[0071 ] 粗酶液对浒苔的酶解应用。
[0072](I)以黄海海域大量暴发的绿潮藻浒苔为原料，清洗除去贝壳、沙石等杂物后，清水漂洗海藻3-4遍，放置于60°`C烘箱中12h，烘干后用粉碎机粉碎I分钟，过80目筛后备用。
[0073]( 2)将Ig干燥的浒苔粉置于三角瓶中，加入到实施例3中制得的粗酶液中，浒苔粉与粗酶液的加入配比为lg: 50mL，于50°C水浴锅中反应48h，然后按DNS法，测得还原糖得率为10.03%，说明粗酶液对浒苔中的纤维素类物质有很好地降解作用，可将纤维素降解为还原糖，为浒苔进一步制取生物乙醇做好了准备。
[0074]实施例5
[0075]粗酶液对浒苔的酶解应用。
[0076](I)以黄海海域大量暴发的绿潮藻浒苔为原料，清洗除去贝壳、沙石等杂物后，清水漂洗海藻3-4遍，放置于60°C烘箱中12h，烘干后用粉碎机粉碎I分钟，过80目筛后备用。
[0077]( 2)将Ig干燥的浒苔粉置于三角瓶中，加入到实施例2中制得的粗酶液中，浒苔粉与粗酶液的加入配比为lg: 50mL，于50°C水浴锅中反应48h，然后按DNS法，测得还原糖得率为9.53%，说明粗酶液对浒苔中的纤维素类物质有很好地降解作用，可将纤维素降解为还原糖，为浒苔进一步制取生物乙醇做好了准备。
【权利要求】
1.一种芽孢杆菌Π13菌株，其特征在于:保藏号CGMCC N0.8269。
2.如权利要求1所述的芽孢杆菌FH3菌株的筛选方法，其步骤包括: (1)将腐烂的浒苔藻体的悬液加入到选择培养基中，摇床培养2-3天； (2)将步骤(1)中的选择培养液经梯度稀释后的菌悬液，涂布在鉴别培养基上，待菌落长出； (3)在长出菌落的平板上用刚果红染色法筛选有透明圈的菌株，并用平板划线分离法分离、提纯。
3.根据权利要求2所述的芽孢杆菌--3菌株的筛选方法，其特征在于:所述步骤(O中，腐烂的浒苔藻体的悬液与选择培养基的体积比为1:25-45 ;摇床培养的温度为25-35°C，转速为 135-145r/min。
4.根据权利要求2或3所述的芽孢杆菌FH3菌株的筛选方法，其特征在于:所述步骤(O中，选择培养基中的组分包括纤维素粉、硝酸钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母膏、水解酪素及陈海水，各组分的加入配比依次为3-5g:lg:0.3-0.5g:1.1-1.3g:0.8~lg:0.4-0.5g:0.4-0.5g:0.4-0.5g:950_1050mL。
5.根据权利要求2所述的芽孢杆菌FH3菌株的筛选方法，其特征在于:所述步骤(2)中，鉴别培养基中的组分包括羧甲基纤维素钠、酵母膏、磷酸二氢钾、琼脂、土豆汁及陈海水，各组分的加入配比依次为 5-10g:lg:0.1-0.3g:12-16g:90-1 IOmL:950_1050mL。
6.如权利要求1所述的芽孢杆菌FH3菌株酶解浒苔的应用方法: Ca)将芽孢杆菌--3菌株于LB液体培养基中振荡培养22-26小时，然后在菌液中加入冻存缓冲液，于_20°C—-25°C保存； (b)将步骤(a)中的芽孢杆菌--3菌株于LB斜面培养基中斜面活化培养，然后挑取一满环于LB液体培养基中，振荡培养24-28h后取l-2mL菌液于已灭菌纤维素液体发酵培养基中，振荡培养5-7天；将发酵液低温离心，取上清液为粗酶液或是将发酵液过滤，取滤液为粗酶液； (c)将干净的浒苔干燥、粉碎，然后与步骤(b)中的粗酶液于45-55°C条件下反应45-50小时。
7.根据权利要求1所述的芽孢杆菌FH3菌株酶解浒苔的应用方法，其特征在于:所述步骤(a)中，振荡培养的温度为25-35°C，转速为135_145r/min ;所述缓冲液是体积浓度为45-55%的甘油，缓冲液与菌液的体积比为1:1-1.5。
8.根据权利要求1所述的芽孢杆菌FH3菌株酶解浒苔的应用方法，其特征在于:所述步骤(b)中，振荡培养的温度为30-35°C，转速为135-145r/min ;离心分离温度为3_5°C，离心转速为3500-4500r/min，离心时间为10-20分钟。
9.根据权利要求1所述的芽孢杆菌FH3菌株酶解浒苔的应用方法，其特征在于:所述步骤(b)中，纤维素液体发酵培养基中的组分包括酵母浸膏、蛋白胨、羧甲基纤维素钠及陈海水，各组分的加入配比依次为Ig:3-6g:8-12g:950-1050mL。
10.根据权利要求1所述的芽孢杆菌FH3菌株酶解浒苔的应用方法，其特征在于:所述步骤(c)中，将干净的浒苔于55-65°C下干燥10-14小时，然后粉碎至60-100目；浒苔与粗酶液的加入量比为Ig:45-55mL。
【文档编号】C12N1/20GK103695334SQ201310594997
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】费岚, 邵飞, 胡乐琴, 何培民, 贾睿 申请人:上海海洋大学