Afp和il-2双基因共表达重组载体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种AFP和IL-2双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有AFP基因、IRES序列和IL-2基因，或者沿载体转录方向依次连接有IL-2基因、IRES序列和AFP基因；所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。本发明所述的双基因共表达重组载体，采用IRES序列来连接AFP基因和IL-2基因，能够在同一载体中同时表达人甲胎蛋白以及人白细胞介素-2，该重组载体可用于肝癌的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的免疫调节作用，又能靶向性地针对肝癌产生特异性抗肿瘤效应。
【专利说明】AFP和IL-2双基因共表达重组载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种重组载体及其制备方法和应用，特别是涉及一种双基因共表达重组载体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌的高发区，每年发生的肝癌占全世界的50%以上，肝癌死亡率己占全国肿瘤死亡率的第二位，是一种严重威胁人们生命健康的疾病。手术切除是目前疗效最好的肝癌治疗手段，目前肝移植技术亦相当成熟，但由于费用高、供体来源困难，术后使用抗排斥药物会因免疫抑制而使残癌生长更快和出现转移等问题，对中晚期肝癌的疗效欠佳。
[0003]近年来，随着分子生物学和肿瘤免疫学等学科的飞速发展，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗研究的热点，多种免疫治疗方法已用于肝癌的临床研究，比如细胞因子治疗，自体完整的肿瘤细胞疫苗，效应细胞回输治疗，以树突状细胞为基础的肝癌疫苗等。目前，多种不同的免疫治疗策略已经显示了抗肝癌的生物免疫活性和初步的临床效力，能够影响肝癌复发和治疗后生存期。其中，细胞因子基因免疫治疗是肿瘤免疫治疗与基因治疗的结合，其通过将具有抗肿瘤作用的细胞因子基因导入宿主体内，并使之稳定有效地表达，使体内持续存在一定水平的内源性细胞因子，以发挥抗肿瘤的作用。然而，目前的细胞因子基因免疫治疗方法缺乏肿瘤靶向性，其抗肿瘤效果有待提高。
[0004]白细胞介素-2(interleukin-2, IL-2),又名 T 细胞生长因子(T cell growthfactor, TCRF)，是主要由活化的⑶4+T细胞和⑶8+T细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子。IL-2是所有T细胞亚群的生长因子，并可促进活化B细胞增殖，故为调控免疫应答的重要因子，其亦参与抗体反应、造血和肿瘤监视。IL-2抗肿瘤作用的机制主要通过刺激机体的固有免疫系统和获得性免疫系统`来对肿瘤细胞进行杀伤作用。IL-2可以促进某一特定T细胞群的克隆性扩增，其可通过提高NK细胞与淋巴激活杀伤细胞(LAK)的细胞数量和活性，并激活TIL细胞，从而诱导机体抗肿瘤免疫反应，使肿瘤生长停止或瘤体消退。此外，IL-2也在调节T细胞成熟过程中起重要作用，同时也能协同刺激B细胞增殖与分泌、增强活化的T细胞产生干扰素。
[0005]近年来，IL-2因其能够激活抗肿瘤免疫作用，被认为是治疗消化系统实质性肿瘤的有效选择。联合使用吉西他滨和IL-2对于胰腺癌肝转移的治疗或是胰腺癌术后预防肝转移都有较好的效果。研究发现，IL-2是肝癌病人的一个重要的预后影响因子，甚至对于一些早期的病人来说也是如此；经门静脉直接注射IL-2能够更好地刺激肝脏自然杀伤细胞(Nature Killer Cell, NK细胞)，对肝脏肿瘤起杀伤作用；而联合使用IL-2和IL-12被报道能够提高肝癌术后患者机体免疫能力并延长生存率。然而，目前的IL-2基因免疫治疗方法只是局部地提高机体的IL-2蛋白表达水平，其免疫调节作用、抗肿瘤能力较小，且缺乏免疫治疗的靶向性。
[0006]甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein, AFP)是一个胚胎特异性的a-球蛋白，是哺乳动物早期胚胎血清中的一个重要的组份。正常情况下，AFP是由胎儿的肝脏和卵黄囊产生的，胎儿出生后，血清中的AFP含量迅速下降，在正常的成人体内是检测不到或仅有极其微量的AFP。AFP是人类发现的第一个具有临床应用价值的肿瘤标志物，一直以来被认为是诊断原发性肝细胞癌的重要标志物。在成人中，约有80%的原发性肝细胞癌患者的血清中，都可以检测到AFP的表达，显示AFP筛查是发现早期肝癌的一种高效的手段。AFP可以作为肿瘤标志物，作为肿瘤免疫治疗的靶位，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，肿瘤细胞可以在其表面表达并递呈AFP多肽与MHC复合物，进而刺激机体免疫系统，产生特异性杀伤性T细胞，杀伤肿瘤细胞。研究表明，AFP可以和多种抗癌药物结合，并通过受体介导的胞吞作用选择性地进入肿瘤细胞，从而靶向、高效地杀死肿瘤细胞。
【发明内容】
[0007]基于此，有必要针对现有技术存在的缺陷，提供一种AFP和IL-2双基因共表达重组载体，该重组载体可用于肝癌的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的的免疫调节作用，又能靶向性地针对肝癌产生特异性抗肿瘤效应。
[0008]本发明的另一个目的是，提供所述AFP和IL-2双基因共表达重组载体的制备方法。
[0009]本发明的再一个目的是，提供所述AFP和IL-2双基因共表达重组载体在肝癌的基因免疫治疗中的应用。
[0010]AFP和IL-2双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有AFP基因、IRES序列和IL-2基因，或者沿载体转录方向依次连接有IL-2基因、IRES序列和AFP基因；所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示,所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
[0011]在其中一个实施例中，所述的载体为PIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为PIRES2-AFP-1L-2重组载体；其中，AFP基因位于IRES序列的上游，IL-2基因位于IRES序列的下游。
[0012]在其中一个实施例中，所述pIRES2-EGFP质粒载体中的EGFP序列被IL-2基因替代。
[0013]本发明所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤:
[0014]I)获得含有特异性酶切位点的AFP基因片段；
[0015]2)将步骤I)得到的AFP基因片段连接于载体，构建含有AFP基因的重组载体；
[0016]3)获得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段；
[0017]4)将步骤3)得到的IL-2基因片段连接于步骤2)得到的重组载体，构建所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体。
[0018]在其中一个实施例中，所述的pIRES2-AFP-1L-2重组载体的制备方法，包括以下步骤:
[0019]a)获得含有特异性酶切位点的AFP基因片段:从肝癌细胞H印G2获取cDNA作为模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位点序列的AFP特异性引物进行PCR扩增，得到含有BglII和EcoR I酶切位点的AFP基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示；
[0020]b)构建pIRES2-AFP-EGFP重组载体:用限制性内切酶Bgl I1、EcoR I分别酶切PIRES2-EGFP质粒以及步骤a)得到的AFP基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到 pIRES2-AFP-EGFP 重组载体；
[0021]c)获得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段:从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的IL-2特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到IL-2基因片段混合物，其中的一种IL-2基因片段具有BstX
I和Not I酶切粘性末端；
[0022]d)构建pIRES2-AFP-1L-2重组载体:用限制性内切酶BstX 1.Not I酶切步骤b)得到的pIRES2-AFP-EGFP重组载体，将步骤c)得到的IL-2基因片段混合物与酶切后线性化的PIRES2-AFP-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2_AFP-1L_2
重组载体。
[0023]在其中一个实施例中，步骤a)所述的AFP特异性引物为:
[0024]AFP 上游引物:5 ’ -GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3，，
[0025]AFP 下游引物:5 ’ -TTGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3 ’。
[0026]在其中一个实施例中，步骤c)所述的IL-2特异性引物包括IL-2第一引物对和IL-2第二引物对，所述的IL-2第一引物对由IL-2上游长引物和IL-2下游长引物组成，所述的IL-2第二引物对由IL-2上游短引物和IL-2下游短引物组成:
[0027]IL-2第一引物对为:
[0028]IL-2 上游长引物:5’ -AACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，
[0029]IL-2 下游长引物:5’-GGCCGCTCAAGTCAGTGITGAGATGAT-3’ ；
[0030]IL-2第二引物对为:
[0031]IL-2 上游短引物:5’ -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，
[0032]IL-2 下游短引物:5’ -GCTCAAGTCAGTGITGAGATGATGC-3’。
[0033]本发明所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体在肝癌基因免疫治疗中的应用。
[0034]在其中一个实施例中，将所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体转染肝癌患者自身或异体分离的树突状细胞后植入患者体内，进行肝癌基因免疫治疗。
[0035]本发明所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体，采用IRES序列来连接AFP基因和IL-2基因，能够在同一载体中同时表达人甲胎蛋白(AFP)以及人白细胞介素-2 (IL-2)，可减少基因载体的用量，减少非治疗相关的外源基因序列的引入。其中，AFP是肿瘤靶向性的相关抗原，IL-2是发挥免疫调节作用的细胞因子，两者联合使用，既可以发挥细胞因子的免疫调节作用，又可以靶向性地针对肝癌产生特异性的抗肿瘤效应，从而能够获得更好的肝癌免疫治疗效果。将双基因共表达重组载体转染肝癌患者自身或异体分离的树突状细胞后植入患者体内，AFP的大量表达，可刺激树突状细胞递呈AFP多肽与MHC复合物，进而刺激机体免疫系统，产生特异性杀伤性T细胞，靶向性杀伤表达AFP多肽的肿瘤细胞；而IL-2的大量表达，能进一步增 强机体免疫调节能力，并能增强特异性T淋巴细胞的扩增能力和细胞活力，增强活化的T细胞产生干扰素，协同扩大抗肿瘤免疫效应。
[0036]IRES序列是来源于某些病毒和细胞mRNA5’端的一段非翻译区，可以不依赖帽的方式启动远端的mRNA翻译，可在上游启动子的控制下和与之相连的基因共同转录，在同一转录本上翻译出不同的蛋白。IRES连接多基因进行共表达时，多个基因的mRNA在同一条转录子上，但转录后的翻译过程相互独立，上游基因以传统方式进行翻译，下游基因依靠IRES序列以不依赖帽的方式进行翻译，保证了各个基因的独立结构及功能。利用IRES代替内部启动子，不但可使多基因共表达载体大大缩小，而且还克服了传统多基因表达载体中启动子之间的相互抑制现象，避免融合蛋白的产生。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为实施例一所得的含有特异性酶切位点序列的AFP基因片段的电泳图，其中，I为AFP基因，M为标记；
[0038]图2 为 pIRES2-EGFP 质粒图谱；
[0039]图3为实施例二所得的PIRES2-AFP-EGFP重组载体图谱；
[0040]图4为实施例二所得的PIRES2-AFP-EGFP重组载体的PCR鉴定电泳图，其中，I为PCR反应产物，M为标记；
[0041]图5为实施例二所得的PIRES2-AFP-EGFP重组载体的酶切鉴定电泳图，其中，I为酶切反应产物，M为标记；
[0042]图6为实施例三所得的带有限制性内切酶粘性末端的IL-2基因片段的电泳图，其中，I为PCR扩增产物A，2为PCR扩增产物B，M为标记；
[0043]图7为实施例三所述的杂交PCR反应的流程图；
[0044]图8为实施例四所得的PIRES2-AFP-1L-2重组载体图谱；
[0045]图9为实施例四所得的PIRES2-AFP-1L-2重组载体的酶切鉴定电泳图，其中，I为Bgl II/EcoR I双酶切反应产物，2为EcoR I/Not I双酶切反应产物，3为Bgl I I/Not I双酶切反应产物，M为标记。
【具体实施方式】`
[0046]下述实施例中，所用到的实验技术，例如PCR技术、引物设计技术、载体构建技术、检测技术、电泳技术等均为基因工程中的常规技术，本领域技术人员可根据现有技术实现(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，科学出版社第三版；或者按照产品说明书进行)。在操作过程中所用到的设备、试剂、载体、菌株等，均为通过市场购买得到的常规产品。
[0047]实施例一:获取含有特异性酶切位点的AFP基因片段
[0048]1、引物设计
[0049]根据AFP基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)和pIRES2_EGFP质粒载体上预期插入的多克隆位点，设计特异性引物如下:
[0050]AFP上游引物(如序列表中SEQ ID N0:4所示):
[0051]5? -GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3?(下划线部分为 Bgl II 酶切位点序列)，
[0052]AFP下游引物(如序列表中SEQ ID NO: 5所示):
[0053]5，-TTGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3，(下划线部分为 EcoR I 酶切位点序列)。
[0054]2、获取cDNA模板
[0055]TRIzon法从人肝癌细胞H印G2中提取RNA(TRIzon总RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，产品编号为CW0580)，并反转录成cDNA (反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，产品编号为RR019A)。[0056]3、获取含有特异性酶切位点的AFP基因片段
[0057]以人肝癌细胞H印G2中提取的RNA所反转录的cDNA为模板，在上述含有特异性酶切位点的上、下游引物的作用下，通过PCR反应获得AFP基因片段，其上游含有Bgl II酶切位点序列，下游含有EcoR I酶切位点序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 6所示。用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图1所示。
[0058]PCR反应体系如下(50 ii L):
[0059]
【权利要求】
1.AFP和IL-2双基因共表达重组载体，其沿载体转录方向依次连接有AFP基因、IRES序列和IL-2基因，或者沿载体转录方向依次连接有IL-2基因、IRES序列和AFP基因； 所述AFP基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: I所示，所述IL-2基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
2.根据权利要求1所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体，其特征在于：所述的载体为pIRES2-EGFP质粒载体，所述的双基因共表达重组载体为pIRES2-AFP-IL-2重组载体；其中，AFP基因位于IRES序列的上游，IL-2基因位于IRES序列的下游。
3.根据权利要求2所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体，其特征在于：所述PIRES2-EGFP质粒载体中的EGFP序列被IL-2基因替代。
4.权利要求1所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤： 1)获得含有特异性酶切位点的AFP基因片段； 2)将步骤I)得到的AFP基因片段连接于载体，构建含有AFP基因的重组载体； 3)获得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段； 4)将步骤3)得到的IL-2基因片段连接于步骤2)得到的重组载体，构建所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体。
5.权利要求2所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体的制备方法，包括以下步骤： a)获得含有特异性酶切位点的AFP基因片段：从肝癌细胞H印G2获取cDNA作为模板，用含有Bgl II和EcoR I酶切位点序列的AFP特异性引物进行PCR扩增，得到含有Bgl II和EcoR I酶切位点的AFP基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示； b)构建pIRES2-AFP-EGFP重组载体：用限制性内切酶BglII、EcoR I分别酶切PIRES2-EGFP质粒以及步骤a)得到的AFP基因片段，并采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到 pIRES2-AFP-EGFP 重组载体； c)获得含有酶切粘性末端的IL-2基因片段：从CIK细胞获取cDNA作为模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的IL-2特异性引物进行PCR扩增，所得到的PCR反应产物再进行杂交PCR反应，得到IL-2基因片段混合物，其中的一种IL-2基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； d)构建pIRES2-AFP-IL-2重组载体：用限制性内切酶BstXI.Not I酶切步骤b)得到的pIRES2-AFP-EGFP重组载体，将步骤c)得到的IL-2基因片段混合物与酶切后线性化的PIRES2-AFP-EGFP重组载体混合，采用T4DNA连接酶进行连接反应，得到pIRES2_AFP-IL_2重组载体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述的AFP特异性引物为： AFP 上游引物：5’ -GCAGATCTATGAAGTGGGTGGAA-3’， AFP 下游引物：5’ -ITGAAITCTTAAACTCCCAAAGCAGC-3’。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤c)所述的IL-2特异性引物包括IL-2第一引物对和IL-2第二引物对，所述的IL-2第一引物对由IL-2上游长引物和IL-2下游长引物组成，所述的IL-2第二引物对由IL-2上游短引物和IL-2下游短引物组成： IL-2第一引物对为： IL-2 上游长引物：5’ -AACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’，IL-2 下游长引物：5’ -GGCCGCTCAAGTCAGTGITGAGATGAT-3’ ； IL-2第二引物对为： IL-2 上游短引物：5’ -ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’， IL-2 下游短引物：5’ -GCTCAAGTCAGTGITGAGATGATGC-3’。
8.权利要求1或2所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体在肝癌基因免疫治疗中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将所述的AFP和IL-2双基因共表达重组载体转染肝癌患者自身或异体分离的树突状细胞后植入患者体内，进行肝癌基因免疫治疗。
【文档编号】C12N15/85GK103614414SQ201310603467
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】曹毓琳, 左百乐, 栗炳南, 连杰, 林俊堂, 丰慧根 申请人:河南省华隆生物技术有限公司