一种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法
【专利摘要】本发明公开了一种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：（1）将NF-κB-luc转基因小鼠分为两组，第一组饲喂普通饲料，第二组饲喂待测饲料，所述待测饲料为待测食品与普通饲料的混合物；（2）10周后，取小鼠的粪便，提取总DNA；（3）取总DNA，打碎，得到300-800bp的DNA片段；（4）取DNA片段，进行细菌16S?rRNA的高通量测序；（5）根据测序结果，得到肠道菌群的组成，如果第二组小鼠的粪便中厚壁菌门的相对丰度显著高于第一组小鼠且具有统计学差异，待测食品中含有转基因植物成分。本发明提供的方法操作简便，成本低廉，结果判断简易，具有非常大的推广和应用价值。
【专利说明】一种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法。
【背景技术】
[0002]转基因生物在联合国公约《生物安全议定书》上，各个国家全部都接受的一个概念，称做“改性活生物体” Living Modified Organisms,简称LMOs,或者叫“遗传饰变生物”Genetically Modified Organisms,GMOs。LMOs或GMOs就是指凭借现代生物技术获得的遗传材料新异组合的活生物体。实际上就是将外源DNA导入生物体基因组，引起了遗传改变，改变了遗传组成的生物，就是转基因生物。
[0003]从1996年开始，转基因植物大面积的推广，如转基因大豆、转基因玉米、转基因番茄等。在世界上，美国是转基因技术发展最快的国家，其国内转基因农作物种类最多，种植面积也最大。目前美国60%以上的加工食品都是以转基因农作物为原料。
[0004]肠道菌群是肠道内各类细菌的集合体。动物在漫长的进化过程中，已经与肠道菌群微生物形成了一种共生/寄生的关系。目前在人体肠道微生物系统中发现9个门的细菌，其中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形杆菌门(Proteobacteria)是哺乳动物肠道中的主要细菌。
[0005]传统的研究肠道微生物的方法，是通过分离肠道排泄物中的微生物，进行选择性培养，或者是通过直接 形态观察来获得部分信息，再进行鉴定和分类。这类方法费时费力，易受操作方法的影响，敏感度低，且在现有技术条件下能够通过培养分离的微生物只占细菌总数的0.1%-1%左右，只能定性检测可培养的细菌，不能鉴定未知的细菌，故不能正确的反映肠道菌群的数量和多样性。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法。
[0007]本发明提供的第一种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法，包括如下步骤:
[0008](1)将NF-κ B-luc转基因小鼠分为两组，第一组饲喂普通饲料，第二组饲喂待测饲料，所述待测饲料为待测食品与普通饲料的混合物；
[0009](2)所述步骤(1)进行10周后，取小鼠的粪便，提取总DNA ；
[0010](3)取步骤(2)得到的总DNA，打碎，得到300_800bp的DNA片段；
[0011](4)取步骤(3)得到的DNA片段，进行细菌16S rRNA的高通量测序；
[0012](5)根据测序结果，得到肠道菌群的组成，根据肠道菌群的组成进行如下结果判读:如果第二组小鼠的粪便中厚壁菌门的相对丰度显著高于第一组小鼠且具有统计学差异，待测食品中含有转基因植物成分。
[0013]本发明提供的第二种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法，包括如下步骤:[0014](I)将NF-κ B-1uc转基因小鼠分为两组，第一组饲喂普通饲料，第二组饲喂待测饲料，所述待测饲料为待测食品与普通饲料的混合物；
[0015](2)所述步骤(1)进行10周后，取小鼠的粪便，提取总DNA ；
[0016](3)取步骤(2)得到的总DNA，打碎，得到300_800bp的DNA片段；
[0017](4)取步骤(3)得到的DNA片段，进行细菌16S rRNA的高通量测序；
[0018](5)根据测序结果，得到肠道菌群的组成，根据肠道菌群的组成进行如下结果判读:如果第二组小鼠的粪便中Erysipelotrichia纲的相对丰度显著高于第一组小鼠且具有统计学差异，待测食品中含有转基因植物成分。
[0019]本发明提供的第三种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法，包括如下步骤:
[0020](I)将NF-κ B-1uc转基因小鼠分为两组，第一组饲喂普通饲料，第二组饲喂待测饲料，所述待测饲料为待测食品与普通饲料的混合物；
[0021](2)所述步骤(1)进行10周后，取小鼠的粪便，提取总DNA ；
[0022](3)取步骤(2)得到的总DNA，打碎，得到300_800bp的DNA片段；
[0023](4)取步骤(3)得到的DNA片段，进行细菌16S rRNA的高通量测序；
[0024](5)根据测序结果，得到肠道菌群的组成，根据肠道菌群的组成进行如下结果判读:如果第二组小鼠的粪便中Erysipelotrichales目的相对丰度显著高于第一组小鼠且具有统计学差异，待测食品中含有转基因植物成分。
[0025]本发明提供的第四种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法，包括如下步骤:
[0026](I)将NF-κ B-1uc转基因小鼠分为两组，第一组饲喂普通饲料，第二组饲喂待测饲料，所述待测饲料为待测食品与普通饲料的混合物；
[0027](2)所述步骤(1)进行10周后，取小鼠的粪便，提取总DNA ；
[0028](3)取步骤(2)得到的总DNA，打碎，得到300_800bp的DNA片段；
[0029](4)取步骤(3)得到的DNA片段，进行细菌16S rRNA的高通量测序；
[0030](5)根据测序结果，得到肠道菌群的组成，根据肠道菌群的组成进行如下结果判读:如果第二组小鼠的粪便中Erysipelotrichaceae科的相对丰度显著高于第一组小鼠且具有统计学差异，待测食品中含有转基因植物成分。
[0031]本发明提供的第五种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法，包括如下步骤:
[0032](I)将NF-κ B-1uc转基因小鼠分为两组，第一组饲喂普通饲料，第二组饲喂待测饲料，所述待测饲料为待测食品与普通饲料的混合物；
[0033](2)所述步骤(1)进行10周后，取小鼠的粪便，提取总DNA ；
[0034](3)取步骤(2)得到的总DNA，打碎，得到300_800bp的DNA片段；
[0035](4)取步骤(3)得到的DNA片段，进行细菌16S rRNA的高通量测序；
[0036](5)根据测序结果，得到肠道菌群的组成，根据肠道菌群的组成进行如下结果判读:如果第二组小鼠的粪便中Clostridium_XlVb属的相对丰度显著高于第一组小鼠且具有统计学差异，待测食品中含有·转基因植物成分。
[0037]以上任一所述的方法中，具体采用Roche454GS Junior测序仪进行所述高通量测序。采用Roche454GS Junior测序仪进行所述高通量测序时，具体可采用338F和907R组成的引物对(通用引物)。
[0038]338F (序列表的序列 1):ACTCCTACGGGAGGCAGCAG ；
[0039]907R (序列表的序列 2):CCGTCAATTCMTTTGAGTTT?
[0040]以上任一所述的方法中，所述待测饲料具体可为将1体积份待测食品与3体积份普通饲料混合得到的混合物。
[0041]以上任一所述的方法中，所述普通饲料具体可为北京华阜康生物科技股份有限公司的大小鼠维持料(产品代号为1022)。
[0042]以上任一所述的方法中，所述转基因植物可为转基因玉米，更具体可为NK603转基因玉米。
[0043]以上任一所述的方法中，具体可采用DNA超声粉碎仪(如Covaris公司S220)进行所述步骤(3)中的“打碎”。
[0044]以上任一所述的方法中，所述步骤(2)中具体可采用粪便样本DNA提取试剂盒(康为生物技术公司)提取总DNA。
[0045]以上任一所述的方法中，可将所述测序结果在MG-RAST序列比对数据库网站(实际应用中，也可使用MEGAN、RDP classifier,NIH Blast等本地软件)进行菌群数据库比对和物种注释，从而获知肠道菌群的组成。
[0046]采用宏基因组学测序技术可以实现高通量、大规模测序，结合生物信息学工具，能够发现大量过去无法得到的微生物新基因或新的基因簇，从而快速获得微生物种群的定性、定量数据，为人们研究肠道微生物，了解肠道微生物区系组成、进化历程和代谢特点提供了新的技术平台。`
[0047]肠道菌群的宏基因组分析，包括全基因组测序和16S rRNA测序两种方法，前者能够检测出细菌基因的突变情况，而后者更适合对肠道菌群组成结构和比例的分析。细菌的16S rRNA基因是一段稳定的遗传编码，约1550bp，大小适中，不同种属的细菌的16S rRNA基因既有着高度的序列保守性，也存在变异性较大的高可变区，其信息量大，可以作为细菌生物进化过程中的进化标尺。对肠道排泄物中菌群16S rRNA高可变区的PCR产物(一般是V2-V6区)进行高通量测序，比对数据库确定每条cDNA片段所代表的细菌种属，结合同种cDNA片段读取到的次数，即可计算分析出该样本DNA中细菌群落的多样性，包括物种的分类信息和相对丰度信息等，可以进一步发掘呈现规律性改变的菌种。
[0048]本发明提供的方法操作简便，成本低廉，结果判断简易，具有非常大的推广和应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0049]图1 为 Alpha-diversity 结果。
[0050]图2 为 Beta-diveristy 结果。
[0051]图3为基于0TU丰度的PCA分析结果。
[0052]图4为通过加权UniFrac Distance热图。
【具体实施方式】[0053]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例中所用的转基因玉米为NK603转基因玉米(又称转基因玉米NK603，是在普通玉米中导入抗草甘膦基因得到的)。NF-K B-1uc转基因小鼠:购自南京模式动物研究所，产品目录号为D0161。
[0054]实施例1、
[0055]将NF- K B-1uc转基因小鼠进行分组饲喂，每组3只，分组饲喂方式如下:
[0056]第一组(Ctrl组):喂养正常饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司的大小鼠维持料，产品代号为1022)；
[0057]第二组(GM组):饲喂混合鼠料(将I体积份转基因玉米的粉末与3体积份正常饲料混合，得到混合鼠料)。
[0058]2、分组饲养10周后取小鼠的粪便，采用粪便样本DNA提取试剂盒(康为生物技术公司)提取总DNA。
[0059]3、取步骤2得到的总DNA，用DNA超声粉碎仪(Covaris公司S220 )打碎，得到300~800bp的DNA片段。
[0060]4、采用Roche454GS Junior测序仪(罗氏公司)和配套的GS FLX反应体系试剂盒对步骤3得到的DNA片段进行细菌16S rRNA的高通量测序(通用引物:338F:ACTCCTACGGGAGGCAGCAG ；907R:CCGTCAATTCMTTTGAGTTT ；M 为简并序列)。
[0061] 5、将步骤3得到的测序结果在MG-RAST序列比对数据库网站(实际应用中，也可使用MEGAN、RDP classifier,NIH Blast等本地软件)进行菌群数据库比对和物种注释，获得样本的菌群结构，即各门/属/种的细菌分别测出哪些，各自的测序读取次数(reads数目)以及各自的读序次数占样本测序读取总次数的百分比(相对丰度)。
[0062]Alpha-diversity结果见图1。分组饲养10周后,两组的菌群多样性呈现差异性。
[0063]Beta-diveristy结果见图2 (样品OTU分布比较-VENN图)。分组饲养10周后，两组小鼠的肠道菌群结构有一定的相似程度(表现为交集部分)，同时两组又各有其特有的OTU序列(表明两组存在一定的菌群差异)。
[0064]基于OTU丰度的PCA分析结果见图3。分组饲养10周后，两组小鼠各自具有较好的聚集趋势，Ctrl组与GM组处于不同的坐标分区，这表明不同组之间的菌群结构有明显异。
[0065]UniFrac分析结合考虑OTU序列丰度，进一步分析各样本的相似程度，相似度越低则相距越远，通过加权UniFrac Distance热图，见图4,各组内样本相互靠近,组间距离较远，表明不同组的菌群多样性有较明显的差别。
[0066]发掘两组之间相对丰度具有显著差异的菌群(同组小鼠之间相对丰度没有显著差异)，结果见表1。
[0067]表1分组饲养10周后两组小鼠粪便中有统计学差异的细菌种属的相对丰度
[0068]
【权利要求】
1.一种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法，包括如下步骤:(1)将NF-KB-luc转基因小鼠分为两组，第一组饲喂普通饲料，第二组饲喂待测饲料，所述待测饲料为待测食品与普通饲料的混合物；(2)所述步骤(1)进行10周后，取小鼠的粪便，提取总DNA；(3)取步骤(2)得到的总DNA，打碎，得到300-800bp的DNA片段；(4)取步骤(3)得到的DNA片段，进行细菌16SrRNA的高通量测序；(5)根据测序结果，得到肠道菌群的组成，根据肠道菌群的组成进行如下结果判读:如果第二组小鼠的粪便中厚壁菌门的相对丰度显著高于第一组小鼠且具有统计学差异，待测食品中含有转基因植物成分。
2.一种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法，包括如下步骤:(1)将NF-κB-luc转基因小鼠分为两组，第一组饲喂普通饲料，第二组饲喂待测饲料，所述待测饲料为待测食品与普通饲料的混合物；(2)所述步骤(1)进行10周后，取小鼠的粪便，提取总DNA；(3)取步骤(2)得到的总DNA，打碎，得到300-800bp的DNA片段；(4)取步骤(3)得到的 DNA片段，进行细菌16SrRNA的高通量测序；(5)根据测序结果，得到肠道菌群的组成，根据肠道菌群的组成进行如下结果判读:如果第二组小鼠的粪便中Erysipelotrichia纲的相对丰度显著高于第一组小鼠且具有统计学差异，待测食品中含有转基因植物成分。
3.一种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法，包括如下步骤:(1)将NF-κB-luc转基因小鼠分为两组，第一组饲喂普通饲料，第二组饲喂待测饲料，所述待测饲料为待测食品与普通饲料的混合物；(2)所述步骤(1)进行10周后，取小鼠的粪便，提取总DNA；(3)取步骤(2)得到的总DNA，打碎，得到300-800bp的DNA片段；(4)取步骤(3)得到的DNA片段，进行细菌16SrRNA的高通量测序；(5)根据测序结果，得到肠道菌群的组成，根据肠道菌群的组成进行如下结果判读:如果第二组小鼠的粪便中Erysipelotrichales目的相对丰度显著高于第一组小鼠且具有统计学差异，待测食品中含有转基因植物成分。
4.一种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法，包括如下步骤:(1)将NF-κB-luc转基因小鼠分为两组，第一组饲喂普通饲料，第二组饲喂待测饲料，所述待测饲料为待测食品与普通饲料的混合物；(2)所述步骤(1)进行10周后，取小鼠的粪便，提取总DNA；(3)取步骤(2)得到的总DNA，打碎，得到300-800bp的DNA片段；(4)取步骤(3)得到的DNA片段，进行细菌16SrRNA的高通量测序；(5)根据测序结果，得到肠道菌群的组成，根据肠道菌群的组成进行如下结果判读:如果第二组小鼠的粪便中Erysipelotrichaceae科的相对丰度显著高于第一组小鼠且具有统计学差异，待测食品中含有转基因植物成分。
5.一种辅助检测食品中是否含有转基因植物成分的方法，包括如下步骤:(1)将NF-κ B-luc转基因小鼠分为两组，第一组饲喂普通饲料，第二组饲喂待测饲料，所述待测饲料为待测食品与普通饲料的混合物；(2 )所述步骤(1)进行10周后，取小鼠的粪便，提取总DNA ； (3)取步骤(2)得到的总DNA，打碎，得到300-800bp的DNA片段； (4)取步骤(3)得到的DNA片段，进行细菌16SrRNA的高通量测序； (5)根据测序结果，得到肠道菌群的组成，根据肠道菌群的组成进行如下结果判读:如果第二组小鼠的粪便中CloStridiUm_XlVb属的相对丰度显著高于第一组小鼠且具有统计学差异，待测食品中含有转基因植物成分。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述步骤(4)中，采用Roche454GS Junior测序仪进行所述高通量测序。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于:所述待测饲料为将I体积份待测食品与3体积份普通饲料混合得到的混合物。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于:所述普通饲料为北京华阜康生物科技股份有限公司的大小鼠维持料。`
【文档编号】C12Q1/04GK103667460SQ201310606732
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】杜杰, 郑帅, 刘婷婷, 朴春梅, 谢道昕 申请人:北京市心肺血管疾病研究所