一种分级沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法
【专利摘要】本发明公开了一种分级沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法，其原理在于高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化层，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。而硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。因此，本发明选择硫酸铵分级沉淀法对糜蛋白酶原和胰蛋白酶原提取工艺进行了研究、改进，特别是采用亲和层析使得制备糜蛋白酶原的收率提高到0.5％～0.6％，同时得到副产品胰蛋白酶原。
【专利说明】一种分级沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地说涉及一种应用硫酸铵分级沉淀提取糜蛋白酶原的同时得到胰蛋白酶原的方法。
【背景技术】
[0002]糜蛋白酶原是糜蛋白酶的前体，它属于丝氨酸蛋白酶，分子量为25000道尔顿。糜蛋白酶又称胰凝乳蛋白酶，分子量为42000道尔顿，用于肽链的酶解，专门水解肽键，属于肽链内切酶，水解产率很高，但其专一性小于胰蛋白酶。其固体状态较稳定，呈白色棒状结晶；而水溶液极不稳定，pH在5~8时，其活力最强，也最易失去活性。
[0003]胰蛋白酶原为胰蛋白酶的前体，在胰脏中合成，存在于胰液里，分泌到十二指肠中，通过十二指肠粘膜中的肠激酶的作用，在6位赖氨酸和7位异亮氨酸之间切断。从N端到第6位置之间的肽链(H-val-Asp4-Lys-0H)切断时便出现活性，这种激活作用也可以通过胰蛋白酶的自我催化反应进行。
[0004]糜蛋白酶为胰腺分泌的一种蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质，作用、用途与胰蛋白酶相似，比胰蛋白酶分解能力强、毒性低、不良反应小。一般用于手术后创口或创伤愈合、抗炎及防止局部积血、水肿、扭伤血肿、乳房手术后局部肿胀、鼻炎、中耳炎等。也可用于白内障摘除、松解睫状肌韧带，以减少膜破裂和视网膜损伤。此外，糜蛋白酶与胰蛋白酶或其他化学药剂共同治疗
[0005]各种炎症具有协同作用，故常用于外科创伤及眼睛消肿治疗。
[0006]本发明人自2008年开始对糜蛋白酶的生产工艺进行试验研究，特别是在其前体糜蛋白酶原的生产过程中，不断 探索，力求优化完善工艺参数，使糜蛋白酶原收率提高到5%~6%，同时还能得到副产品胰蛋白酶原，生产工艺稳定，质量可控。
【发明内容】
[0007]1、本发明提供了一种分级沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法，是为了解决糜蛋白酶原提取工艺收率低、活性低的缺点，改进糜蛋白酶原提取的工艺，从而提高收率，减少蛋白活性损失，特别是采用亲和层析得到副产品胰蛋白酶原。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现:
[0009]一种分级沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法，其特征在于:选用硫酸铵分级沉淀，改进糜蛋白酶原提取工艺，特别是采用亲和层析将糜蛋白酶原收率提高到0.5%~
0.6%，同时得到副产品胰蛋白酶原，更好的保持了蛋白的活性。在发明技术方案中，其特征还在于所述提取工艺包括如下步骤:
[0010]I)原料预处理
[0011]胰脏洗净后，立即浸入预先冰冻好的硫酸溶液中，骤然冷却，在零度左右保存。
[0012]2)蛋白浸溃提取
[0013]2.1)取预处理过的胰脏投入绞肉机中绞碎成胰浆(必要时应绞3次)，加入胰浆2倍量的冰冷硫酸，置冷室中，多次搅拌，浸溃提取。
[0014]2.2)浸溃物过滤后，滤渣再用I倍量的冰冷硫酸重复上述过程，再进行过滤，弃滤渣，合并2次滤液，加入硫酸铵，使硫酸铵浓度达到40%饱和度，冷室放置，过夜。
[0015]2.3)虹吸上清液，底层沉淀加入适量硅藻土作助滤剂，减压过滤，上清液和滤液合并，得提取液，加入硫酸铵，使硫酸铵浓度达到70%饱和度，冷室放置过夜。
[0016]3)分级沉淀
[0017]3.1)次日上层清液弃去，底层沉淀减压过滤至干，加入3倍于滤饼重的冰水使之溶解，重复用硫酸铵40%和70%饱和度分级沉淀；
[0018]3.2)将最后一次70%饱和度沉淀滤饼，加入1.5倍于滤饼重的冰水溶解，并加入
0.5倍滤饼重量的饱和硫酸铵溶液。
[0019]4)亲和层析
[0020]4.1)用适量的0.01-0.3mol / L，PH5-10的Tris-HCL缓冲液平衡亲和层析快胶柱；
[0021]4.2)将混合液流经此柱，流速控制在I~5mL / min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液；
[0022]4.3)平衡后，用0.l-5mol / L的NaCL溶液洗脱完全，得含胰蛋白酶原的淋洗液。
[0023]5)结晶
[0024]5.1)将含糜蛋白酶原的淋洗液，用氢氧化钠调节PH5.0，于25°C恒温箱中静置，保温，进行结晶。
[0025]5.2)将结晶减压抽滤，干燥后得糜蛋白酶原。
[0026]经核算，所得糜蛋白酶收率约为0.5%~0.6%。
[0027]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
[0028]选用硫酸铵分级沉淀提取糜蛋白酶原，可以提高提取糜蛋白酶原的效率，并且使其理化性质和生物活性保持稳定，从而有利于下一步对糜蛋白酶原进行精制，最终使糜蛋白酶的各项指标均符合中国药典标准。更重要的是，通过工艺的不断改进和完善，特别是采用亲和层析将糜蛋白酶原收率提高到0.5%~0.6%，同时得到副产品胰蛋白酶原，节约成本，提高了经济效益。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，而不以任何方式限制。
[0030]实施例1
[0031]1)原料预处理
[0032]胰脏洗净后，去掉脂肪、结缔组织等杂物，立即浸入预先冰冻好的硫酸溶液中，骤然冷却，在零度左右保存。
[0033]2)蛋白浸溃提取
[0034]2.1)将预处理过的胰脏投入绞肉机中绞碎成胰浆，称重后积满IOOkg投入反应罐，加入200L冰冷硫酸。置冷室中，每I~2h搅拌I次，浸溃提取24h。
[0035]2.2)浸溃物用粗滤袋(或二层纱布)过滤，滤干后，得到滤渣86kg。再用86L冰冷硫酸重复上述过程，再进行过滤，弃滤渣，合并2次滤液共270L，加入固体硫酸铵65.34kg,使硫酸铵浓度达到40%饱和度，冷室放置，过夜。
[0036]2.3)虹吸上清液，底层沉淀加入适量硅藻土作助滤剂，减压过滤，上清液和滤液合并，得提取液264L，加入固体硫酸铵54.12kg，使硫酸铵浓度达到70%饱和度，冷室放置过夜。[0037]3)分级沉淀
[0038]3.1)次日上层清液弃去，底层沉淀减压过滤至干称重46.68kg，加入140L冰水使之溶解，重复用硫酸铵40%和70%饱和度分级沉淀；
[0039]3.2)取第二次70%饱和度沉淀滤饼9.6kg，加入14.4L冰水溶解，并加入4.8L饱和硫酸铵溶液。
[0040]4)亲和层析
[0041]4.1)用80L0.2mol / L，PH8的Tris-HCL缓冲液平衡亲和层析快胶柱；
[0042]4.2)将混合液19.2L流经此柱，流速控制在2mL / min左右，得到含糜虿白酶原的淋洗液16.4L ；
[0043]4.3)平衡后，用36.8L1.5mol / L的NaCL溶液洗脱，得含胰蛋白酶原的淋洗液37.4L。
[0044]5)结晶
[0045]5.1)将含糜蛋白酶原的淋洗液16.4L，用5mol / L氢氧化钠调节PH5.0，于25°C恒温箱中静置，保温48h进行结晶；
[0046]5.2)将结晶减压抽滤，干燥后得糜蛋白酶原0.55kg。
[0047]经核算，所得糜蛋白酶原收率为0.55%。
[0048]实施例2
[0049]I)原料预处理
[0050]胰脏洗净后，去掉脂肪、结缔组织等杂物，立即浸入预先冰冻好的硫酸溶液中，骤然冷却，在零度左右保存。
[0051]2)蛋白浸溃提取
[0052]2.1)将预处理过的胰脏投入绞肉机中绞碎成胰浆，称重后积满IOOkg投入反应罐，加入200L冰冷硫酸。置冷室中，每I~2h搅拌I次，浸溃提取24h。
[0053]2.2)浸溃物用粗滤袋(或二层纱布)过滤，滤干后，得到滤渣88kg。再用88L冰冷硫酸重复上述过程，再进行过滤，弃滤渣，合并2次滤液共275L，加入固体硫酸铵66.55kg,使硫酸铵浓度达到40%饱和度，冷室放置，过夜。
[0054]2.3)虹吸上清液，底层沉淀加入适量硅藻土作助滤剂，减压过滤，上清液和滤液合并，得提取液268L，加入固体硫酸铵54.94kg，使硫酸铵浓度达到70%饱和度，冷室放置过夜。
[0055]3)分级沉淀
[0056]3.1)次日上层清液弃去，底层沉淀减压过滤至干称重48.67kg，加入146L冰水使之溶解，重复用硫酸铵40%和70%饱和度分级沉淀；
[0057]3.2)取第二次70%饱和度沉淀滤饼9.8kg，加入14.7L冰水溶解，并加入4.9L饱和硫酸铵溶液。
[0058]4)亲和层析[0059]4.1)用82L0.15mol / L，PH7的Tris-HCL缓冲液平衡亲和层析快胶柱；
[0060]4.2)将混合液19.6L流经此柱，流速控制在3mL / min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液16.8L ；
[0061]4.3)平衡后，用38.5Llmol / L的NaCL溶液洗脱，得含胰蛋白酶原的淋洗液37.6L。
[0062]5)结晶
[0063]5.1)将含糜蛋白酶原的淋洗液16.8L，用5mol / L氢氧化钠调节PH5.0，于25°C恒温箱中静置，保温48h进行结晶；
[0064]5.2)将结晶减压抽滤，干燥后得糜蛋白酶原0.58kg。
[0065]经核算，所得糜蛋白酶原收率为0.58%。
[0066]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【权利要求】
1.一种分级沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法，应用硫酸铵分级沉淀法对糜蛋白酶原和胰蛋白酶原提取工艺进行了研究、改进通过工艺参数的研究、改进，提高了蛋白提取的效率，减少了蛋白活性的损失，特别是采用亲和层析并且得到副产品胰蛋白酶原。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述糜蛋白酶原和胰蛋白酶原是通过以牛胰或猪胰等为原料，将原料依次经过预处理、蛋白浸溃提取、分级沉淀、亲和层析、结晶制备得到的。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述提取工艺包括如下步骤: (1)胰脏洗净后 ，立即浸入预先冰冻好的硫酸溶液保存； (2)将上述胰脏绞成胰浆，加入冰冷硫酸置于冷室中，搅拌后浸溃提取； (3)过滤,滤液中加入硫酸铵,冷室放置过夜后,减压过滤； (4)经硫酸铵分级沉淀后得含糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的混合液； (5)再经过亲和层析，将两者分离，得胰蛋白酶原和含糜蛋白酶原的淋洗液； (6)将含糜蛋白酶原的淋洗液于恒温箱中静置结晶，减压抽滤，得糜蛋白酶原。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，胰脏在绞碎前，始终在冰冷的硫酸溶液中保存。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述硫酸溶液的浓度均为0.0125mol/ L。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，为了更好的提取蛋白，硫酸铵沉淀可反复进行。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述亲和层析快胶柱包括:DEAE-Sepharose2B FF, DEAE-Sepharose4B FF, DEAE-Sepharose6B FF, DEAE-SepharoseCL-2B FF，DEAE-Sepharose CL-4B FF，DEAE-Sepharose CL-6BFF。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述亲和层析条件为:平衡液选用0.01-0.3mol / L，PH5-10的Tris-HCL缓冲液，流速控制在I~5mL / min左右，洗脱液选用 0.l-5mol / L 的 NaCL 溶液。
9.如权利要求1~6所述的方法，其特征在于:所得糜蛋白酶原收率提高到0.5%~0.6%，同时得到副产品胰蛋白酶原。
【文档编号】C12N9/76GK103667227SQ201310616061
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月23日 优先权日:2013年11月23日
【发明者】刘乃山, 林晓磊, 孙延年, 葛翠凤 申请人:青岛康原药业有限公司