一种利用棉花子叶腋芽制备转基因棉花的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用棉花子叶腋芽制备转基因棉花的方法。本发明公开的一种侵染试剂，该侵染试剂由溶剂和溶质组成，溶剂为1/2MS培养基，溶质为SILWET?L-77、蔗糖、乙酰丁香酮和KT。本发明具有如下优点：1、利用棉花幼苗的子叶期的特殊阶段直接侵染，避免棉花组织培养再生受基因型限制问题，所有棉花品种均可转化。2、转化周期短，获得转基因植株仅需一个棉花生长周期约4个月左右。3转化效率高，可达到30％。
【专利说明】一种利用棉花子叶腋芽制备转基因棉花的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用棉花子叶腋芽制备转基因棉花的方法。
【背景技术】
[0002]目前，在棉花的转基因研究的转化技术方面建立了根癌农杆菌介导的组织培养植株再生转基因方法、基因枪法、花粉管通道法。
[0003]农杆菌介导的转基因方法是目前研究最多，机制最清楚，技术最成熟的转基因方法，是自然界天然的遗传转化系统。农杆菌介导外源基因进入植物细胞后，多以单拷贝的形式整合于染色体上，转基因后代遗传稳定性好，较少发生沉默，后代多数符合孟德尔遗传规律，便于后续的研究。同时Ti质粒的T-DNA可容纳长达50kb的大片段DNA分子的插入。目前获得的转基因植物中，80%以上是通过农杆菌介导的方式实现的。
[0004]根癌农杆菌介导的组织培养棉花遗传转化的缺点是依赖棉花的组培技术，组织培养突变率高，受基因型的限制，现在能够再生的品种(或材料)大多是生产上已淘汰的品种，而主栽品种往往不容易获得再生，需要通过转入模式材料得到转基因再生植株，再通过杂交或回交的方法把目的基因转育到优良的品种上。并且棉花的组织培养再生周期很长，大约要12-18个月，再加上杂交转育的时间，至少2年。
[0005]农杆菌介导的转基因方法技术方案如下:
[0006]1、犹取目的基因。
[0007]2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体(大多数选用质粒)用DNA连接酶连接起来。
[0008]3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组质粒导入农杆菌(农杆菌为受体细胞)。
[0009]4、农杆菌侵染模式材料愈伤组织，组织培养继代一般6~8代，每代约45天左右，体细胞再生植株。
[0010]5、再生植株的标记基因的鉴定，目的基因的检测与鉴定。
[0011]6、模式转基因材料与目标材料杂交转育，杂交后代选育，获得转基因材料。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是提供一种利用棉花子叶腋芽制备转基因棉花的方法。
[0013]本发明提供了一种侵染试剂，该侵染试剂由溶剂和溶质组成，溶剂为1/2MS培养基，溶质为SILWET L-77、蔗糖、乙酰丁香酮和KT ；
[0014]所述SILWET L-77在所述侵染试剂中的体积百分含量为0.02-0.04% ；
[0015]所述蔗糖在所述侵染试剂中的浓度为0.4g/100ml ；
[0016]所述乙酰丁香酮在所述侵染试剂中的浓度为50mg/L ；
·[0017]所述KT在所述侵染试剂中的浓度为0.lmg/L。
[0018]一种侵染液也属于本发明的保护范围，该侵染液由所述侵染试剂和含有目的基因的重组农杆菌组成。
[0019]上述侵染液中，所述侵染液的0D600为0.4-0.6。
[0020]一种制备转基因植物的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:
[0021](I)以两片子叶展开且第一片真叶伸出的植物幼苗为侵染对象；
[0022](2)破坏幼苗的茎尖顶芽，使茎尖不能进一步分化生长，启动子叶腋芽原基分裂；
[0023](3)在子叶腋芽处划伤口，并在伤口处滴加含有重组农杆菌的侵染液；
[0024]所述重组农杆菌是将含有外源目的基因的重组表达载体导入农杆菌中得到的；
[0025](4)将滴加侵染液后的幼苗保湿培养I天，然后继续培养； [0026](5)侵染后幼苗的子叶的茎尖停止生长，子叶腋芽原基分裂生长，形成新芽，继续培养长成的植株即为转基因植株。
[0027]上述方法中，所述步骤(3)中的所述子叶腋芽为单侧或双侧子叶腋芽。
[0028]上述任一所述的方法中，所述步骤(3)中的所述伤口的深度为2_5mm。
[0029]上述任一所述的方法中，所述步骤(3)中的所述侵染液为50ul上述侵染液。
[0030]上述任一所述的方法中，所述步骤(4)和步骤(5)中所述培养的条件为25°C光照
培养；
[0031]所述步骤(4)中所述保湿的条件为将所述滴加侵染液后的幼苗置于育苗盘，将育苗盘置于用透明塑料膜封住的塑料盒内。
[0032]上述任一所述的方法中，所述植物为棉花。
[0033]上述侵染试剂在制备转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围；
[0034]和/ 或，
[0035]上述任一所述的侵染液在制备转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围；
[0036]和/ 或，
[0037]上述任一所述的方法在制备转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0038]本发明具有如下优点:
[0039]1、利用棉花幼苗的子叶期的特殊阶段直接侵染，避免棉花组织培养再生受基因型限制问题，所有棉花品种均可转化。
[0040]2、转化周期短，获得转基因植株仅需一个棉花生长周期约4个月左右。
[0041]3、转化效率高，可达到30%左右。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1为侵染前的幼苗。
[0043]图2为侵染后子叶腋芽的再生。
[0044]图3为转基因植株的PCR分子检测。
[0045]图4为转基因植株的southern blotting检测。
【具体实施方式】
[0046]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048]YEP液体培养基中溶质及其在培养基中的浓度如下:[0049]
蛋白胨(peptone)5g/L
蔗糖(sucrose)5g/L
牛肉骨(Beef extract)lg/L
酵母提取物(Yeast extract) 5g/L
硫酸镁(MgS(V7H20)0.5g/L；
余量为水。
[0050]YEP固体培养基:向YEP液体培养基中加1.5%琼脂粉(％表示质量体积百分含量，g/100ml), pH = 7.2,121°C,高压灭菌 20min。
[0051]IOmM CaCl2水溶液按照如下方法配制:取0.15g CaCl2 ? 2H20加入约80ml蒸懼水溶解，加甘油15ml,用蒸懼水定容至100ml,调pH=5.8,121°C,高压灭菌20min。
[0052]农杆菌LBA4404购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号为MCC026。
[0053]pCAMBIA1300 (含潮霉素抗性基因)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号为MCV033。`
[0054]百棉I号在文献“王清连，张金宝，鲁玉贞.国审棉花新品种百棉I号[J].中国种业，2010，(2):75-76"中公开过，公众可从河南科技学院获得。
[0055]中棉所41在文献“刘金海，周关印，习玉鹏.双价转基因抗虫棉新品种中棉所41 [J].中国种业，2003，(I):51`”中公开过，公众可从河南科技学院获得。
[0056]珂字312在文献“贾佩佩，胡根海，张金宝，等.不同植物生长调节剂处理对陆地棉子叶节再生的影响[J].中国农学通报，2012，28 (15): 31-35”中公开过，公众可从河南科技
学院获得。
[0057]SILffET L-77 购自加拿大 GE Healthcare Bio-Sciences AB 公司，产品目录号为SL770080596。
[0058]KT (6-糠氨基嘌呤)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录号为MB-K5762。
[0059]实施例1、重组农杆菌的制备
[0060]一、LBA4404感受态的制备
[0061 ](一)接种环挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5ml YEP液体培养基(含50mg/L利福平)中，28°C、200r/mim培养过夜。
[0062](二)取2ml培养物于YEP液体培养基(含50mg/L利福平)中继续培养，直至0D600为0.5左右。
[0063](三)将步骤(二)的培养物置冰浴中30min，4°C、5000r/min、离心5min，弃去上清液。
[0064](四)用IOml冷的0.lmol/L NaCl溶液悬浮菌液。
[0065](五)将步骤(四)得到的悬浮菌液4°C、5000r/min,离心5min,弃去上清液。
[0066](六)用Iml冷的IOmMCaCl 2溶液悬浮菌液，分装成50 yl/管，液氮中冷冻后至-80°C保存。[0067]二、pCAMBIA1300 转化 LBA4404
[0068](一)将lugpCAMBIA1300加入200ul LBA4404感受态细胞中，冰上放置30分钟。
[0069](二)将步骤(一)的细胞在液氮中冷冻I分钟。
[0070](三)37°C水浴溶化细胞。
[0071](四)在细胞中加ImlYEP液体培养基，28°C摇床培养2-4hr (低速)。
[0072](五)离心I分钟，悬浮细胞在IOOulLB培养基中。
[0073](六)涂板(YEP固体平板培养基，含50mg/L利福平，30mg/L潮霉素)，28°C培养2-3天，长出的克隆即为带有PCAMBIA1300的LBA4404农杆菌，记作重组农杆菌。
[0074]实施例2、侵染液的制备
[0075]一、菌液扩繁
[0076]挑取实施例1得到的重组农杆菌单菌落于50mL含有潮霉素(30mg/L)和利福平(25mg/L)的 LB 培养基中，28°C，300r/min 震荡培养至 OD6tltl 值为 2.0-2.5，4°C，8000r/min 离心5min，收集菌体 。
[0077]二、侵染液的配制
[0078]侵染试剂:该试剂由溶剂和溶质组成；溶剂为1/2MS培养基；溶质为SILWET L-77、蔗糖、乙酰丁香酮和KT ；SILffET L-77在侵染试剂中的体积百分含量为0.02%-0.04%,蔗糖在侵染试剂中的浓度为0.4%(%表不质量体积百分含量，g/100ml),乙酰丁香酮在侵染试剂中的浓度为50mg/L，KT在侵染试剂中的浓度为0.lmg/L。
[0079]侵染试剂配制完成后，用侵染试剂悬浮步骤一离心得到的重组农杆菌菌体，使0D600为0.4-0.6左右，即为重组农杆菌的侵染液，将其置于4°C备用。
[0080]实施例3、转基因棉花的制备
[0081]一、棉花幼苗的准备:选取饱满的百棉I号的种子，在育苗盘点播，室温25°C萌发，3天左右出苗。
[0082]二、25°C条件下百棉I号在两片子叶展开到第一片真叶长出时约7-9天，两片子叶展开后至第一片真叶伸出为最佳转化期，棉花的子叶腋芽在此阶段处于休眠状态，一般不会生长，只有破坏茎尖顶芽才可以解除对子叶腋芽的抑制。
[0083]一支手轻拉一片子叶，使两子叶之间间隙略大，用解剖刀先轻横拨动两片子叶中间的幼嫩茎尖，以破坏茎尖顶芽，并保证子叶的完整，为启动子叶腋芽原基分裂生长创造条件。
[0084]三、在子叶腋芽处切深度约2_5mm的伤口，可以切两边，也可以一边，侵染前的幼苗的相关部位如图1所示。
[0085](两片子叶叶腋各有I个子叶腋芽，但同时切2边有一定的困难，可以只处理一边。)
[0086]四、侵染，在解剖刀切割的伤口处，用移液器滴入实施例2制备的重组农杆菌的侵染液一滴(约50微升)，浸染后保湿I天(将育苗盘放在17cmX45cmX70cm的塑料盒内，盒口用透明塑料膜封住，25°C光照培养)，然后将侵染后的幼苗挪出塑料盒，继续在25°C光照下培养。
[0087]五、由于茎尖顶芽已破坏，经过约15天子叶腋芽分裂再生，由腋芽原基部位发育成新芽，如图2所示，长出植株后，即为转pCAMBIA1300的TO代植株。[0088]六、转基因植株的鉴定
[0089](一)抗性筛选
[0090]用蒸馏水配制潮霉素溶液至浓度为250mg/L，待子叶腋芽发育后形成的植株(即转pCAMBIA1300的TO代植株)长出真叶后，用移液器或滴管，在真叶叶面划线，培养约7天观察实验结果，产生烧灼斑的为阴性植株，没有烧灼斑的为阳性植株。
[0091](二)PCR分子检测
[0092]对阳性植株DNA进行巢式PCR分子检测，具体步骤如下:
[0093]提取步骤(一)鉴定为阳性的转PCAMBIA1300的TO代植株以及野生型百棉I号植株的叶片的DNA为PCR模板，并同时设置水为阴性对照以及PCAMBIA1300质粒为阳性对照，根据pCAMBIA1300质粒上的潮霉素基因设计两对引物进行巢式PCR扩增。两轮扩增引物嵌套设计，第二轮扩增引物在基因核酸序列(GenBank:EU849664.1)的结合位置上与第一轮扩增引物相比，上游引物向内移动约50bp，下游引物向内移动约200bp。
[0094]第一轮PCR:
[0095]PCR扩增引物:
[0096]上游引物hptl:5，-CGCGGATCCATGAAAAAGCCTGAA-3，；(SEQ ID N0.1)
[0097]下游引物1^七2:5’-00^六6(:1'1'1'0^1'1'1'(:1'11^00:1'(:-3’。(SEQID N0.2)
[0098]PCR扩增体系:上下游引物(20mmol/L)各luL，IU Taq DNA聚合酶，10XPCR反应缓冲液 2ul, dNTP (2.5mmol/L) 1.6uL，浓度为 0.1-0.25ug/ul 的模板 DNA2.0ul，去离子水补足体系至20ul。
[0099]PCR 扩增程序:94°C预变性 4min ;94°C变性 30s，52°C退火 40s，72°C延伸 lmin，共35个循环；72°C延伸5min。
[0100]第二轮PCR:
[0101]PCR扩增引物:
[0102]上游引物hpt3:5，-TACTTCTACACAGCCATCGGTCC-3，；(SEQ ID N0.3)
[0103](SEQID N0.4)
[0104]PCR扩增体系:上下游引物(20mmol/L)各luL，IU Taq DNA聚合酶，10XPCR反应缓冲液2uL，dNTP(2.5mmol/L) 1.6uL，模板为第一轮PCR扩增产物1.0ul，去离子水补足体系至 20ul。
[0105]PCR扩增程序:94°C预变性 4min ;94°C变性 30s，54°C退火 40s，72°C延伸 50s，共 35个循环；72°C延伸5min。
[0106]第二轮的PCR扩增产物均用I %琼脂糖凝胶检测，有单一目的条带(约750bp )的样本含有潮霉素报告基因(即转入了 PCAMBIA1300质粒)，结果如图3所示。
[0107]图3 中，I 为 DNA marker,由下至上条带大小依次为 IOObp, 250bp, 500bp, 750bp,1000bp，2000bp ；2为阴性对照(水)；3为阳性对照(pCAMBIA1300质粒)；4为野生型百棉I号；5-7为三株步骤(一)鉴定为阳性的转pCAMBIA1300的TO代植株。
[0108]图3表明，阳性对照(pCAMBIA1300质粒)和步骤(一)鉴定为阳性的转pCAMBIA1300的TO代植株均可扩增出目的条带，经过PCR分子检测三株步骤(一)鉴定为阳性的转PCAMBIA1300的TO代植株进一步确定为阳性转基因植株。
[0109](三)southernblotting 检测[0110]对步骤(二)鉴定为阳性的转PCAMBIA1300的TO代植株的潮霉素基因的巢式PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并转膜，以潮霉素为标记探针做southern blotting检测，采用Roche公司的DIG DNA Labeling and Detection Kit进行,操作参见试剂盒说明书，结果如图4所示。
[0111]该探针的序列如SEQ ID N0.5所示。
[0112]图4表明，步骤(二)的巢式PCR鉴定为阳性的转pCAMBIA1300的TO代植株经过southern blotting检测进一步确定为阳性转基因植株。
[0113]计算得到本实施例的步骤一到步骤五的方法的转化效率为30%左右，结果如表1所示。
[0114]应用上述方法再转化中棉所41和珂字312并进行阳性植株的鉴定，结果如表1所示。
[0115]表1转化效率
[0116]
【权利要求】
1.一种侵染试剂，该侵染试剂由溶剂和溶质组成，溶剂为1/2MS培养基，溶质为SILWETL-77、蔗糖、乙酰丁香酮和KT; 所述SILWET L-77在所述侵染试剂中的体积百分含量为0.02-0.04% ； 所述鹿糖在所述侵染试剂中的浓度为0.4g/100ml ； 所述乙酰丁香酮在所述侵染试剂中的浓度为50mg/L ； 所述KT在所述侵染试剂中的浓度为0.lmg/L。
2.一种侵染液，该侵染液由权利要求1所述的侵染试剂和含有目的基因的重组农杆菌组成。
3.根据权利要求2所述的侵染液，其特征在于:所述侵染液的0D600为0.4-0.6。
4.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤: (1)以两片子 叶展开且第一片真叶伸出的植物幼苗为侵染对象； (2)破坏幼苗的茎尖顶芽，使茎尖不能进一步分化生长，启动子叶腋芽原基分裂； (3)在子叶腋芽处划伤口，并在伤口处滴加含有重组农杆菌的侵染液； 所述重组农杆菌是将含有外源目的基因的重组表达载体导入农杆菌中得到的； (4)将滴加侵染液后的幼苗保湿培养I天，并继续培养； (5)侵染后幼苗的子叶的茎尖停止生长，子叶腋芽原基分裂生长，形成新芽，继续培养长成的植株即为转基因植株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中的所述子叶腋芽为单侧或双侧子叶腋芽。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中的所述伤口的深度为2-5mm。
7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中的所述侵染液为50ul权利要求3所述的侵染液。
8.根据权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于:所述步骤(4)和步骤(5)中所述培养的条件为25°C光照培养； 所述步骤(4)中所述保湿的条件为将所述滴加侵染液后的幼苗置于育苗盘，将育苗盘置于用透明塑料膜封住的塑料盒内。
9.根据权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于:所述植物为棉花。
10.权利要求1所述的侵染试剂在制备转基因植物中的应用； 和/或， 权利要求2或3所述的侵染液在制备转基因植物中的应用； 和/或， 权利要求4-9任一所述的方法在制备转基因植物中的应用。
【文档编号】C12N15/84GK103667342SQ201310634992
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】胡根海, 王清连, 李成奇 申请人:河南科技学院