一种高毒性、高增值能力的人d-cik细胞的制备方法
【专利摘要】本发明属于细胞免疫学【技术领域】，具体地说是一种高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，包括如下步骤：1)采集外周静脉血，获得单个核细胞；2)进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞；3)单核细胞诱导分化为成熟的DC；4)CD3+CD8+CIK细胞的诱导培养；5)D-CIK细胞的诱导培养，得到一种新的异质性细胞群，即D-CIK细胞。通过本发明所制备的D-CIK细胞与CIK细胞比较，增值活性和细胞毒活性更强，同时具有制备工艺简单、成本低廉、易于规模化生产等优势。通过本发明所制备的D-CIK细胞，其应用主要为癌症病人的治疗或者癌症高危人群的预防。
【专利说明】—种高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞免疫学【技术领域】，具体地说是一种高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法。
【背景技术】
[0002]细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinduced killer cell, CIK)是 Schmidt 等于1986年报道的从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中诱导出的一群异质性细胞。其主要效应细胞因同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，因此又被称为NK细胞样T淋巴细胞(NKT细胞)。体内外的实验研究表明，CIK细胞具有杀瘤活性高、增值速度快、抗凋亡及杀瘤效应不受癌细胞多重耐药的影响等优势。
[0003]树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前所知功能最强的抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC),表面具有丰富的有助于抗原呈递的分子,如主要组织相容性复合体 1、II (major histocompatibility complex I/I I, MHC I/II)、CD80/86、CD40、ICAM-1等共刺激分子，能有效的激活初始型T细胞(naiVe T cell)使其活化和增值，启动特异性免疫应答反应，发挥有效的抗肿瘤效应。
[0004]树突状细胞调节的细胞因子诱导的杀伤细胞(dendritic cell activated andcytokine induced killer cell, D-CIK)是指将成熟的DC与同源的CIK细胞同培养而形成的一群异质性细胞群。共培养既可以促进DC分泌IL-12，又可以促进CIK细胞的增值，并加强其抗肿瘤活性。Marten A等研究发现，IL-12摄取阻断会减弱CIK细胞的细胞毒活性。因此,D-CIK细胞应用于恶性肿瘤患者的治疗，有助于解除肿瘤患者体内T细胞的免疫无能，从而提高抗肿瘤活性。
[0005]现有CIK细胞制备技术中存在:(1)CIK细胞中绝大部分群体为⑶3+⑶8+T淋巴细胞，大约占CIK细胞的60%左右，然而其杀瘤活性却受到极大的限制；这与目前的CD3+0)8+T淋巴细胞,也即细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)是抗肿瘤的主要免疫效应细胞的认识存在差异。(2)虽然主要效应细胞一NKT细胞，扩增1000倍左右，但整体细胞群体扩增能力较为有限，大约80~100倍左右。DC制备技术中存在，成熟DC分泌IL-12因子的水平偏低。二者共培养后，增值能力和细胞毒活性提高不显著等问题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术的不足，通过选择优化的CIK细胞和DC培养方案的基础上，对CIK细胞和DC共培养方案进一步改进，提供了一种新的人D-CIK细胞的制备方法及其应用，解决了现有技术CIK细胞与DC共培养后，异质性细胞群体增值能力和细胞毒活性提高不显著等问题。
[0007]本发明所提供的人D-CIK细胞，是指以CD3+CD8+T淋巴细胞为主效应细胞，在人D-CIK细胞异质性群体中约95%，与K562细胞共培养8小时对肿瘤细胞杀伤活性可达93%左右。CD3+CD8+T淋巴细胞其表面标记为:人白细胞分化抗原CD3、人白细胞分化抗原CD8和人a PTCR受体。
[0008]本文中的“⑶3+⑶8+CIK细胞”表示CD3和⑶8均为阳性的CIK细胞。
[0009]为实现上述目的，设计一种高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，包括如下步骤:
[0010]I)采集外周静脉血，获得单个核细胞；
[0011]2)进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞；
[0012]3)单核细胞诱导分化为成熟的DC;
[0013]4)CD3+CD8+CIK细胞的诱导培养；[0014]5) D-CIK细胞的诱导培养。
[0015]作为优选，所述步骤I)为将外周静脉血经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞；所述步骤2)为通过贴壁法将上述单个核细胞进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞。
[0016]进一步地，所述步骤I)具体为采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法分离收集，并用生理盐水洗涤2次，低速离心后获得PBMCs。
[0017]所述步骤2)具体为将获取的PBMCs重悬于PAA?培养基、GT-T551?培养基、OPt1-MEM?培养基中的任意一种，然后于37°C，5% C02和饱和湿度的培养箱内静止2h，吸取其中悬浮细胞另行CD3+CD8+CIK细胞诱导培养，贴壁细胞则为单核细胞。
[0018]作为优选，所述步骤3)具体包括:将含有8-10%白体血浆、800_1000IU/mlGM-CSF、800-1000IU/ml IL-4的X-VIV0-15?培养基或者AM-V?培养基加入获取的单核细胞中，继续培养；培养2-3天后，更换新鲜培养基，并在新鲜培养基中加入I~20 μ g/ml的肿瘤抗原，继续培养；培养1-2天后，加入IL-Ιβ、IL-6、TNF-a，或者IL-1 β、IL_6、TNF_ a与Mtb-HAg及IFN- Y中的一种或者两种的组合；继续培养1-2天，进行DC成熟度和IL-12含量检测。
[0019]作为优选，所述步骤3)中加入的IL-Ιβ终浓度为8-15ng/mL，IL_6终浓度为50-150ng/mL, TNF- a 终浓度为 8_15ng/mL，Mtb-Hag 终浓度为 5 ~10 μ g/ml, IFN- Y 终浓度为 100 ~1000IU/ml ;GM_CSF 浓度为 800IU/ml、IL-4 浓度为 1000IU/ml ;所述的 DC 成熟度的检测方法为流式细胞术，IL-12含量检测方法为ELISA。
[0020]进一步地，所述步骤3)中加入的IL-1 β终浓度为10ng/mL，IL-6终浓度为IOOng/mL, TNF- α 终浓度为 10ng/mL，Mtb-Hag 终浓度为 8 μ g/ml, IFN- Y 终浓度为 1000IU/ml。
[0021]作为优选，所述步骤4)具体包括:将步骤2)中收集的悬浮细胞重悬于含8-10%自体灭活血浆的PAA?或者GT-T551?等商品化无血清培养基中，调整细胞密度(1_2) X IO6/ml左右，并加入IFN-Y至终浓度500-1500IU/ml，最后转移入培养瓶内进行培养；培养20-28小时后加入抗⑶3单抗、抗⑶28单抗、IL-1 α、IL-2,40-50小时后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin,BCG)连续培养6~7天,其中每2~3天补加含有IL-2的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在(1-2) X106/ml。
[0022]作为优选，所述步骤4)中所加入的抗⑶3单抗浓度为50~500ng/ml，抗⑶28单抗的浓度为50~500ng/ml，IL-1 α的浓度为0.5~5ng/ml，IL-2的浓度为50~1000IU/ml ;加入卡介苗的浓度为5~20 μ g/ml。
[0023]进一步地，所述步骤4)中IFN- Y的浓度为1000IU/ml，培养20_28小时候加入抗CD3单抗浓度为100ng/ml，抗CD28单抗的浓度为200ng/ml，IL-1 α的浓度为lng/ml，IL-2的浓度为1000IU/ml，40-50小时后加入BCG的浓度为10 μ g/ml。
[0024]作为优选，所述步骤5)具体包括:将步骤3)及步骤4)中培养的DC和CD3+CD8+CIK 收集并重悬于含有 5 ~20 μ g/ml 的 BCG、50 ~1000IU/ml 的 IL-2 的 GT-T551?培养基中在进行培养14~21天，每2~3天进行补加含有50~1000IU/ml的IL-2的GT-T551?培养基。
[0025]进一步优选地，所述BCG浓度为10 μ g/ml，所述IL-2终浓度为1000IU/ml。
[0026]本发明所制备的人D-CIK细胞主要应用于癌症病人的治疗或者癌症高危人群的预防。
[0027]所属肿瘤抗原包含并不限于下述抗原:CD19、CD20、WT-1、MUCl、LMP2、HPV E6E7、EGFRvII1、HER-2/neu、Idiotype, MAGE A3、p53、NY-ESO-l、PSMA、⑶2、CEA, MelanA/MARTl、Ras mutant、gp100、p53mutant、Proteinase3、bcr-ab1、Tyrosinase、Survivin、PSA、hTERT、Sarcoma、EphA2、PAP、ML-1AP、AFP、EpCAM、ERG、NAl7、PAX3、ALK、Androgen receptor、CycI inB1、Polysialic acid、MYCN、RhoC、TRP-2、⑶3、Fucosyl GMl、Mesothelin、PSCA、MAGE Al、sLe (animal)、CYPlBl、PLACl、GM3、BORIS、Tn。所述 IL-1 β (lOng/mL)，IL-6 (lOOng/mL)，TNF- a (lOng/mL)，Mtb-HAg 的终浓度为 8 μ g/ml, IFN- y 的终浓度为 1000IU/ml。
[0028]所述肿瘤包含并不限于B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和宫颈癌细胞等。
[0029]本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。
[0030]本发明同现有技术相比:本发明所制备的D-CIK细胞，细胞扩增效率高，总细胞扩增效率在21天是现有CIK细胞扩增效率的3倍左右；对肿瘤细胞杀伤活性强，其细胞毒活性从现有CIK细胞对K562细胞杀伤活性的50 %提高到90 %左右。同时具有制备工艺简单、成本低廉、易于规模化生产等优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]:图1:成熟DC形态。培养第7天，成熟DC在倒置显微镜下的形态，放大倍率为40 X ；
[0032]图2:培养第7天流式细胞术进行DC成熟度检测；
[0033]图3:不同培养方式培养的外周血来源PBMCs生长曲线(n=8);外周血来源的PBMCs通过不同方式培养，在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分别用细胞计数板和细胞计数仪进行计数，将当前细胞总数除以开始培养时(第O天)的细胞总数，所得数值即为细胞增殖倍数。CIK组:指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞<D3⑶8CIK组:指本发明中所采用的优化的CIK培养方式培养的细胞CD3+CD8+CIK细胞；D_CIK组:指本发明所采用的培养方式；
[0034]图4:采用流式细胞仪进行免疫表型检测(n=8)。外周血来源的PBMCs，通过不同方式培养，在第14天取细胞进行流式荧光抗体:抗CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PECY5.5、CD56_APC进行表面染色并检测。CIK组:指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞；CD3CD8CIK组:指本发明中所采用的优化的CIK培养方式培养的⑶3+⑶8+CIK细胞；D-CIK组:指本发明所采用的培养方式:；[0035]图5:采用CCK-8细胞毒活性检测试剂盒对不同培养方式培养的外周血来源PBMCs进行细胞毒性检测(n=8)。通过不同方式培养，在第14天取细胞通过CCK-8试剂盒进行细胞毒活性检测。CIK组:指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞KD3⑶8CIK组:指本发明中所采用的优化的CIK培养方式培养的CD3+CD8+CIK细胞；D_CIK组:指本发明所采用的培养方式。横坐标:表示效靶细胞比值，E: T=IO: I表示效应细胞与靶细胞的比值为10: 1,E: T=20: I表示效应细胞与靶细胞的比值为20: Ι,Ε: Τ=40: I表示效应细胞与靶细胞的比值为40: I。
【具体实施方式】
[0036]下面用实例来具体说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。
[0037]实施例1
[0038]本实施例1是分离获得的PBMCs并进行D-CIK细胞的培养。包括以下步骤:
[0039]1.采集患者外周静脉血30~50ml，经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞。具体步骤为:1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56°C灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1: 2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到PBMCs。
[0040]2.通过贴壁法将上述PBMCs进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞。具体步骤为:将上述分离的PBMCs重悬于PAA?培养基、GT-T551?培养基、Opt1-MEM?培养基的任意一种培养基中，调整细胞密度为(5~10) X 106/ml，总体积为IOml加入T75ml的细胞培养瓶内，于37°C、5%C02和饱和湿度的培养箱内贴壁2h ;轻轻晃动培养瓶，使未贴壁细胞重新悬浮；然后收集悬浮的未贴壁细胞，则留下的贴壁细胞即为单核细胞。
[0041]3.单核细胞诱导分化为成熟的DC。具体步骤为:将20ml含有10%自体血浆、800IU/mlGM-CSF、1000IU/ml IL-4 的 X-VIV0-15? 培养基或者 AM-V? 培养基加入上述 T75的培养瓶内，然后置于37°C、5% C02和饱和湿度的培养箱内培养。第三天(72h)吸弃IOml培养瓶内的培养基，并补加IOml新鲜的含有10%自体血浆、800IU/ml GM-CSF、1000IU/mlIL-4、I~20 μ g/ml的肿瘤抗原的X-VIV0-15?培养基或者AIM-V?培养基，其中肿瘤抗原优选的浓度为10yg/ml。在细胞培养的第五天,加入IL-1 β (10ng/mL), IL-6 (100ng/mL),TNF-t a (lOng/mL)，Mtb-HAg 终浓度为 8 μ g/ml, IFN- y 终浓度为 1000IU/ml。细胞培养的第6~7天，分别通过倒置显微镜和流式细胞术进行DC形态(见图1)和成熟度(见图2)检测。
[0042]4.⑶3+⑶8+CIK细胞的诱导培养。具体步骤为:将实施例1步骤2中收集的悬浮细胞重悬于含10%自体灭活血浆的PAA?或者GT-T551?等商品化无血清培养基中，调整细胞密度2 X 106/ml左右，并加入IFN-Y至终浓度1000IU/ml，最后转移入培养瓶内进行培养。培养24小时后加入抗⑶3单抗、抗⑶28单抗、IL-1 a、IL-2,48小时后加入卡介苗(bacillus Callmette-Guerin, BCG)连续培养6~7天,其中每2~3天补加含有IL_2的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在(I~2)X106/ml。其中，抗CD3单抗浓度为100ng/ml，抗CD28单抗的浓度为200ng/ml，IL-1 α的浓度为lng/ml，IL-2的浓度为1000IU/ml ；48小时后加入BCG的浓度为10 μ g/ml。
[0043]5.D-CIK细胞的诱导培养。具体步骤为:将实施例1步骤3、4中培养6~7天的DC 和 CD3+CD8+CIK 收集并重悬于含有 10 μ g/ml 的 BCG、1000IU/ml 的 IL-2 的 GT-T551? 培养基中在进行培养14~21天(PBMCs分离为第O天计算)，以后每2~3天进行补加含有1000IU/ml 的 IL-2 的 GT-T551? 培养基。
[0044]实施例2
[0045]本实施例2是对D-CIK细胞进行形态学和增值能力检测。包括以下步骤:
[0046]1.DC和⑶3+⑶8+CIK共培养24小时即可见细胞沉于培养瓶的底部，有大量的大小不一的集落和不规则的单个核细胞。对培养12~14天的细胞进行瑞姬氏染色，发现大多数细胞体积增大，呈椭圆形或不规则形，细胞核大多为椭圆形或圆形，核染色疏松，核膜不规则，有突起，每个细胞可见I个小核仁，呈深蓝色；胞质丰富，染成灰蓝色，形态不规贝U，有伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形。取培养12~14天的细胞100 μ 1，加入100 μ 10.4%台盼蓝染色液，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，显微镜下计数。本发明制备的细胞活力大于95%。
[0047]2.在第0、5、7、10、12、14、17、19、21天分别用细胞计数板和细胞计数仪进行计数，
将当前细胞总数除以开始培养时的细胞总数，所得数值即为细胞增殖倍数，以此进行动态观察细胞增殖情况并作为细胞补加新鲜培养基时的参考，细胞增殖倍数见图3、表1。
[0048]表1:不同培养方式培养的外周血来源PBMCs扩增倍数(η=8)
[0049]
【权利要求】
1.一种高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤: 1)采集外周静脉血，获得单个核细胞； 2)进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞； 3)单核细胞诱导分化为成熟的DC； 4)⑶3+⑶8+CIK细胞的诱导培养； 5)D-CIK细胞的诱导培养。
2.如权利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤I)为将外周静脉血经聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心获得单个核细胞；所述步骤2)为通过贴壁法将上述单个核细胞进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞。
3.如权利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括:将含有8-10%自体血浆、800-1000IU/ml GM-CSF、800_1000IU/mlIL-4的X-VIVO-15?培养基或者AIM-V?培养基加入获取的单核细胞中，继续培养；培养2_3天后，更换新鲜培养基，并在新鲜培养基中加入I~20 μ g/ml的肿瘤抗原，继续培养；培养1-2 天后，加入 IL-1 P、IL-6、TNF-α，或者 IL-1 P、IL-6、TNF-α 与 Mtb-HAg 及 IFN-Y 中的一种或者两种的组合；继续培养1-2天，进行DC成熟度和IL-12含量检测。
4.如权利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤4)具体包括:将步骤2)中收集的悬浮细胞重悬于含8-10%自体灭活血浆的ΡΑΑ?或者GT-T551?等商品化无血清培养基中，调整细胞密度(1_2) X 106/ml左右，并加入IFN-Y至终浓度500-1500IU/ml，最后转移入培养瓶内进行培养；培养20-28小时后加入抗CD3单抗、抗CD28单抗、IL-1a、IL-2,40-50小时后加入卡介苗(bacillusCallmette-Guerin, BCG)连续培养6~7天，其中每2~3天补加含有IL-2的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在(1-2) X106/ml。
5.如权利要求1所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤5)具体包括:将步骤3)及步骤4)中培养的DC和CD3+CD8+CIK收集并重悬于含有5~20 μ g/ml的BCG,50~1000IU/ml的IL-2的GT-T551?培养基中在进行培养14~21天，每2~3天进行补加含有50~1000IU/ml的IL-2的GT-T551?培养基。
6.如权利要求3所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述 IL-1 β 终浓度为 8-15ng/mL，IL-6 终浓度为 50_150ng/mL，TNF-α 终浓度为 8_15ng/mL, Mtb-Hag终浓度为5~10 μ g/ml, IFN- Y终浓度为100~1000IU/ml ;所述的DC成熟度的检测方法为流式细胞术，IL-12含量检测方法为ELISA。
7.如权利要求4所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述抗CD3单抗浓度为50~500ng/ml，抗CD28单抗的浓度为50~500ng/ml，IL-1 α的浓度为0.5~5ng/ml, IL-2的浓度为50~1000IU/ml ;加入卡介苗的浓度为5~20 μ g/ml。
8.如权利要求7所述的高毒性、高增值能力的人D-CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述BCG浓度为10 μ g/ml，所述IL-2终浓度为1000IU/ml。
【文档编号】C12N5/0783GK103642754SQ201310638842
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】马飞, 李龙云, 李正成 申请人:深圳市合一康生物科技有限公司