表达抑制麦长管蚜脂蛋白酯酶的发卡rna的dna分子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达抑制麦长管蚜脂蛋白酯酶的发卡RNA的DNA分子及其应用。本发明所提供的DNA分子的结构为SEQ正向-X-SEQ反向，所述SEQ正向的序列为序列表中序列1的第21-563位；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。实验证明，将所述DNA分子转化小麦，获得转基因株系，进行蚜虫饲喂试验，麦长管蚜食用转基因叶片后，脂蛋白酯酶基因表达量和繁殖率下降。可见，本发明对于农业生产上害虫的防治具有重要意义。
【专利说明】表达抑制麦长管蚜脂蛋白酯酶的发卡RNA的DNA分子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种表达抑制麦长管蚜脂蛋白酯酶的发卡RNA的DNA分子及其应用。
【背景技术】
[0002]蚜虫是小麦生产中的主要害虫，主要有麦无网长管蚜(Metopolophiumdirhodum),麦二叉姆(Schizaphis graminum),禾谷纟益管姆(Rhopalosiphum padi )和麦长管虫牙(Sitobion avenae),分布极广,几乎遍及世界各产麦国。姆虫以成虫、若虫吸取小麦汁液危害小麦，排到叶片上的蜜露降低光合作用，并传播多种病毒病，包括大麦黄矮病毒，导致小麦产量降低和品质下降。
[0003]目前，防治小麦蚜虫或者其他害虫主要还是依靠化学杀虫剂，虽然在一定程度上能够减少虫害所带来的产量下降，但是长期的使用化学杀虫剂不但费用较高而且容易使蚜虫产生相应的抗性，同时导致蚜虫天敌杀伤严重，环境污染加剧。
[0004]近年来，随着蚜虫抗药性的增强，化学杀虫剂的使用浓度和药用量也呈现增长的趋势。
[0005]RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。植物介导的dsRNA确可以长效的抑制目标基因的表达，达到生产上控制害虫的目的，这种利用植物表达与昆虫特定基因匹配的双链RNA分子，当昆虫取食这类植物后，其靶基因的表达被明显降低，这种技术不仅为昆虫的功能基因组研究提供了便捷的方法，也为农业害虫的防治提供了特异性更强且环境安全的新思路、新技术。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种表达抑制麦长管蚜脂蛋白酯酶的发卡RNA的DNA分子及其应用。
[0007]本发明所提供的DNA分子具体为如式(I)所示的DNA片段:
[0008]SEQ正向-X-SEQ反向(I)
[0009]所述序列如序列表中序列I的第21-563位核苷酸所示；
[0010]所述SEQg的序列与所述序列反向互补(序列I的第1728-2270位)；
[0011]所述X是所述SEQ1^1与所述间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQIE向及所述SEQ反向均不互补。
[0012]在本发明中，式(I)中所述X为FAD2内含子序列,具体如序列表中序列2所
[0013]更加具体的，式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列I所示。
[0014]含有所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。[0015]所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0016]在本发明中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为rbcS启动子。
[0017]进一步,所述rbcS启动子的序列如序列表中序列3所示。
[0018]在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为在pBAC-rbcs-sNTL载体的酶切位点插入序列I所示DNA片段后得到的重组质粒(pBAC-rbcs-LPL);所述酶切位点具体为 Kpn I 和 BamH I。
[0019]由以上式(I)所示DNA片段编码得到的RNA分子也属于本发明的保护范围。
[0020]以上式(I)所示DNA片段，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌，或所述RNA分子在如下al)_a4)任一中的应用也属于本发明的保护范围:
[0021]al)抑制麦长管蚜脂蛋白酯酶表达；
[0022]a2)降低麦长管蚜的繁殖率；
[0023]a3)防治麦长管蚜；
[0024]a4)培育抗麦长管蚜的转基因植物。
[0025]本发明的再一个目的是提供一种培育抗麦长管蚜的转基因植物的方法。
[0026]本发明所提供的培育抗麦长管蚜的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤:将以上式(I)所示DNA片段导入目的植物中，得到抗麦长管蚜的转基因植物；
[0027]所述抗麦长管蚜具体体现`在如下bl) _b2)中的至少一种:`[0028]bl)抑制麦长管蚜的脂蛋白酯酶表达；
[0029]b2)降低麦长管蚜的繁殖率。
[0030]进一步，在本发明的一个实施例中，al)和bI)中所述抑制麦长管蚜的脂蛋白酯酶表达具体为使麦长管蚜的脂蛋白酯酶编码基因在RNA水平的表达量降低。
[0031]在上述方法中，以上式(I)所示DNA片段具体是以重组表达载体的形式导入所述目的植物中的；在本发明中，所述重组表达载体为以上所述pBAC-rbcs-LPL载体。更加具体的，是将所述pBAC-rbcs-LPL载体和pBAC35SIH3载体按照3: I的摩尔比混合后共转化所述目的植物，从而实现将式(I)所示DNA片段导入所述目的植物。
[0032]在以上所述的应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物；在本发明中，所述植物为单子叶植物小麦，具体为小麦品种京花I号。在本发明中，所述麦长管蚜具体为一龄麦长管虫牙。
[0033]本发明通过RT-PCR方法克隆了麦长管蚜脂蛋白酯酶基因(SaLPL)片段，进一步构建了此基因片段的发夹RNAi构件。将该构件基因枪轰击受体品种京花I号，获得转基因株系，对转基因株系对麦长管蚜脂蛋白酯酶基因的干扰效果和抗虫性进行分析，表明转基因株系均能抑制麦长管蚜脂蛋白酯酶基因的表达量，且对麦长管蚜的繁殖率下降。可见，本发明对于农业生产上害虫的防治具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为麦长管蚜总RNA的电泳检测结果。其中，泳道1-4为四个重复，均为麦长管蚜总RNA。
[0035]图2为RT-PCR获得SaLPL基因片段(约543bp)。其中，泳道M为DAN分子量标准2000bp DNA Ladder ;泳道1_3为PCR扩增所得SaLPL基因片段。
[0036]图3为pHurricane载体的质粒图谱。
[0037]图4为重组质粒pBSK-FAD2Il-LPL鉴定结果。其中，泳道M为DAN分子量标准IkpDNA Ladder ;泳道 I 用引物 SaLPL-sl 和 AtFAD2I9F 扩增 pBSK_FAD2Il_LPL。
[0038]图5为重组质粒pBSK-LPL-R结果。其中，泳道M为DAN分子量标准2000bp DNALadder ;泳道 I 为用引物 SaLPL-sl 和 AtFAD2I9R 扩增 pBSK-LPL-R。
[0039]图6为pBAC-rbcs-sNTL载体的质粒图谱。
[0040]图7为重组质粒pBAC-rbcs-LPL的酶切鉴定结果。其中，泳道M为DAN分子量标准Ikp DNA Ladder ;泳道I为pBSK-LPL-R的Kpn I和BamH I酶切结果；泳道2为pBAC-rbcs-sNTL的Kpn I和BamH I酶切结果；泳道3为重组质粒pBAC-rbcs-LPL的Kpn I和BamH I酶切结果。
[0041]图8为重组表达载体pBAC-rbcs-LPL图谱。
[0042]图9为SaLPL的RNAi转基因小麦的PCR鉴定。其中，泳道M均为DNA分子量标准DL2000Marker ；泳道+均为阳性对照pBAC-rbcs-LPL质粒；泳道-均为阴性对照未转基因小麦；泳道1-17均为转基因植株，扩增出目的条带(箭头处)的为阳性植株。
[0043]图10为SaLPL的RNAi转基因小麦对麦长管蚜羧酸酯酶基因表达量干扰效果分析结果。具体为麦长管蚜取食转基因小麦叶片5天后的检测结果。
[0044]图11为SaLPL的 RNAi转基因小麦对麦长管蚜繁殖率的影响分析结果。
【具体实施方式】
[0045]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0046]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047]麦长管姆(Sitobion avenae):从中国农业大学上庄实验站小麦试验田获得,按照“王春芝，3种小麦蚜虫的形态识别与防治技术，农技服务，2008，25 (3):50，58” 一文记载的方法，鉴定证实确为麦长管姆(Sitobion avenae)。其形态学特征如下:无翅孤雌姆体长
3.1_，宽1.4_，长卵形，草绿色至橙红色，有时头部带红色或褐色，腹部两侧有不明显的灰绿至灰黑色斑。触角黑色，第3节有8-12个感觉圈排成一行。腹部第6-8节及腹面具横网纹，无缘瘤。喙粗大，黑色，长度超过中足基节。腹管长圆筒形，黑色，长为体长的1/4，在端部有十几行网纹。有翅孤雌蚜体长3.0mm，椭圆形，绿色。喙不达中足基节。腹管长圆筒形，黑色，端部具15~16行横行网纹，尾片长圆锥状，有8~9根毛。若蚜体绿色，有时粉红色，复眼红色，一般体较短。
[0048]pHurricane载体:记载于“张付芸，陈伟霞,刘子渲,李保云,梁荣奇.小麦SS I1-A基因片段的克隆及其RNAi表达载体的构建.中国农学通报，2011，27 (7):50_54”一文中的“H质粒”。公众可从中国农业大学获得。
[0049]pBAC35SIH3载体:记载于“隋晓燕，赵琰，王树彬等.无载体框架结构的大豆铁蛋白线性表达盒提高小麦籽粒铁含量的研究.农业生物技术学报，2012，20(7):766~773”一文中，用于基因枪遗传转化后抗性愈伤组织的筛选。公众可从中国农业大学获得。
[0050]小麦(Triticum aestivum L.)品种京花I号:记载于“胡道芬，袁振东，汤云莲等.植物细胞工程——冬小麦花培新品种京花I号的育成.中国科学(B辑化学生物学农学医学地学)，1986年03期，第283-292页” 一文。北京市农林科学院作物研究所，用(洛夫林18号X5238-036) X红良4号的杂交一代花粉培养选育而成。幼苗匍匐，叶片较宽，叶色深绿，分蘖力强，成穗率高，穗层整齐，多花多粒，穗粒数多，穗呈纺锤形、顶芒、白壳、白粒。京花I号属冬性，中晚熟品种。抗病性强，高抗条锈、叶锈和杆锈。抗干热风能力强，叶片功能期长，后期落黄好。抗寒性稍差，杆较弱，倒伏较重。公众可从中国农业大学获得。
[0051]实施例1、表达抑制麦长管蚜脂蛋白酯酶的发卡RNA的DNA分子的获得
[0052]一、麦长管蚜脂蛋白酯酶基因SaLPL目的片段获得
[0053]设计如下引物:
[0054]SaLPL-sl:5’ -CCTGTTCCTGAGAGGCGTCT-3’(序列 I 的第 21-40 位)；
[0055]SaLPL-al:5’-GCAACACCAGCTGAAAACGCTACTC-3’(序列 I 的第 539-563 位的反向互补序列)。
[0056]扩增片段长度为543bp。
[0057]取5龄麦长管蚜成虫，按照美莱博RNA提取试剂盒提取总RNA (图1)。图中，28S、18S都很清晰，说明提取的总RNA可以用于RT-PCR。利用该总RNA、引物Pl-R和Pl-F进行RT-PCR，反应条件:95°C预变性 5min ；94°C 40s, 55°C 40s, 72°C 90s, 33 个循环；最后 72°C延伸IOrnin0
[0058]结果显示，得到543bp左右的麦长管蚜脂蛋白酯酶基因SaLPL目的片段(图2)，将该目的片断从琼脂糖胶回收后连到pGEM-Teasy载体(promega公司)上,热激转化大肠杆菌DH5 α菌株，经蓝白斑筛选阳性克隆，提取质粒，并进行酶切鉴定及测序。
[0059]将经测序表明在pGEM-Teasy载体上连入序列I的第21-543位的重组质粒命名为pTE-LPL。
[0060]二、重组表达载体pBAC-rbcs-LPL的构建及鉴定
[0061]1、目的片段正向插入FAD2 Intronl的上游
[0062]用EcoR I同时酶切pTE-LPL和pHurricane载体(质粒图谱如图3所示)，电泳后分别回收前者约0.55Kb片段和后者的大片段，连接这两个片段，转化大肠杆菌DH5ci感受态，涂板，挑斑，摇菌，提取质粒，用引物SaLPL-sl和AtFAD2I9F对所提取的质粒进行初步鉴定，将PCR扩增得到大小约为674bp目的条带的质粒(图4)命名为pBSK-FAD2Il-LPL。
[0063]SaLPL-sl:5’ -CCTGTTCCTGAGAGGCGTCT-3’(序列 I 的第 2251-2270 位的反向互补序列)；
[0064]AtFAD2I9F:5’ -AGCAGATCTATCGTGAGCGG-3’(序列 I 的第 1597-1616 位)。
[0065]进一步，对所述重组质粒pBSK-FAD2Il-LPL进行序列测定，结果表明，重组质粒pBSK_FAD211-LPL为在pHurricane载体的FAD2 Intronl下游酶切位点EcoR I处正向插入“GATT+序列I的第21-563位+AATCACTAGT”后得到的重组质粒。
[0066]2、目的片段反向插入FAD2 Intronl的下游
[0067]用Not I同时酶切pTE-LPL和pBSK_FAD2Il_LPL，分别回收前者0.55Kb片段和后者的大片段，连接这两个片段，转化大肠杆菌DH5 α感受态，涂板，挑斑，摇菌，提取质粒，用引物SaLPL-sl和AtFAD2I9R对所提取的质粒进行初步鉴定，将PCR扩增得到大小约为674bp目的条带的质粒(图5)命名为pBSK-LPL-R。
[0068]SaLPL-sl:5，-CCTGTTCCTGAGAGGCGTCT-3，(序列 I 的第 21-40 位)；[0069]AtFAD2I9R:5’ -GAAGACTCTCTTGAATCGTTACC-3’(序列 I 的第 672-694 位的反向互补序列)。
[0070]进一步，对所述重组质粒pBSK-LPL-R进行序列测定，结果表明，重组质粒pBSK-LPL-R为在pBSK-FAD2Il-LPL载体的FAD2 Intronl上游酶切位点Not I处反向插入“GGGAATTCGATT+ 序列 I 第 21-563 位 +AATCACTAGTGAATTC” 后得到的重组质粒。
[0071 ] 在重组质粒pBSK-LPL-R中，位于酶切位点Kpn I和BamH I之间的序列即为RNAi构件。
[0072]3、将RNAi构件置于rbcs启动子下游
[0073]用限制性内切酶Kpn I和BamH I同时双酶切pBAC-rbcs-sNTL载体(质粒图谱如图6所示，构建过程见下文)和以上构建的重组质粒pBSK-LPL-R，电泳后分别回收前者大小约为4kb的片段和后者大小约为2.3kb的片段，连接这两个片段，转化大肠杆菌感受态，涂板，挑斑，摇菌，提取重组质粒，将其命名为pBAC-rbcs-LPL。
[0074]用限制性内切酶Kpn I和BamH I对pBSK_LPL_R、pBAC-rbcs-sNTL，以及重组质粒pBAC-rbcs-LPL分别进行双酶切。结果如图7所示，酶切pBAC-rbcs-sNTL可得到一条大小约为4kb的骨架片段,酶切pBSK-LPL-R可得到一条大小约为2.3kb的目的片段,而酶切重组质粒pBAC-rbcs-LPL则得到一条约4kb的片段和一条约为2.3kb的片段，其中大片段同pBAC-rbcs-sNTL酶切后的骨架片段大小相符，小片段同目的片段大小相符，证明从pBSK-LPL-R上切下的约2.3kb的目的片段已经连接到pBAC-rbcs-sNTL上酶切位点Kpn I和BamH I之间。
[0075]进一步，对所述重组质粒pBAC-rbcs-LPL进行序列测定，结果表明，重组质粒pBAC-rbcs-LPL为在pBAC-rbcs-sNTL载体的rbcs启动子下游的酶切位点Kpn I和BamH I之间插入序列表中序列I后得到的重组质粒。
[0076]重组表达载体pBAC-rbcs-LPL的质粒图谱如图8所示。在重组表达载体pBAC-rbcs-LPL中，启动所述序列I所示DNA片段转录的启动子为rbcs启动子,其核苷酸序列如序列表中序列3所示。序列I由2296个核苷酸组成。其中，第21-563为SaLPL基因片段的正向序列；第594-1711位为FAD2内含子核苷酸序列(序列2);第1728-2270位为所述SaLPL基因片段的反向序列。正向序列和反向序列之间由一段内含子(intron)序列隔开以维持载体的稳定性；该系统在植物细胞中转录产生带发夹结构(hairpin)的dsRNA,弓丨发RNAi，从而可用于抑制目的基因的表达。
[0077]其中，pBAC-rbcs-sNTL载体的构建方法及后续的筛选鉴定过程参见文献uSambrook J,Fritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning - A laboratory Mauual, 2nded., New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.”。具体方法如下:
[0078]I)将载体PBAC202 (参考文献“高泽发，陈旭清，杨凤萍，梁荣奇，张立全，张晓东.人工合成gna基因在小麦中的表达及其抗蚜虫效果研究，农业生物技术学报，2006，14(4): 559-564”)用 BamH I 和 Kpn I 酶切，回收 3.8Kb 载体片段。
[0079]2)由上海捷瑞生物工程有限公司人工化学合成sNTL基因全长(5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上Kpn I酶切位点)，经过DNA测序证明正确。sNTL基因⑶S全长为序列表中序列4。
[0080]3) BamH I和Kpn I双酶切上一步获得的sNTL基因片段和用BamH I和Kpn I酶切载体PBAC202得到的3.8kb载体片段连接后，选择sNTL方向和rbcs启动子方向一致的重组载体，命名为pBAC-rbcs-sNTL。重组载体pBAC-rbcs-sNTL的结构描述为:在载体PBAC202的酶切位点BamH I和Kpn I之间插入了序列表中序列4所示DNA片段后得到的
重组载体。
[0081]实施例2、SaLPL的RNAi转基因小麦的获得及鉴定
[0082]一、SaLPL的RNAi转基因小麦的获得
[0083]选取开花后12-15天的小麦品种京花I号的幼穗，将其种子消毒后剥取幼胚，盾片向上置于幼胚接种培养基(配方:MS基本培养基+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，pH5.8。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度)上，25±1°C暗培养3-5天诱导出小麦愈伤组织。选择生长状态良好的愈伤组织块进行基因枪共转化(将pBAC-rbcs-LPL和PBAC35SIH3按照3:1摩尔比混合，其中pBAC35SIH3质粒带有Basta抗性基因bar)，转化后的愈伤25 ± I °C暗培 养2-3天后移至筛选培养基(配方:幼胚接种培养基+Basta 2_25mg/L。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度)上进行除草剂抗性筛选；观察筛选1-2周之后，将生长状态良好、颜色鲜黄的抗性愈伤组织转移到分化培养基(配方:MS基本培养基+玉米素10mg/L+Basta0.5mg/L, pH5.8。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度)上使其分化，大约4-5周后可分化出幼苗，将其转移到生根壮苗培养基(配方:MS培养基+IAA 10mg/L，pH5.8。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度)中进行生根壮苗，直到根系生长繁茂、小麦绿苗足够壮实；炼苗2-3天后移栽至土壤中可长成Ttl代转基因植株。
[0084]同时设置向小麦品种京花I号中转入pBAC-rbcs空载体的对照。
[0085]pBAC-rbcs载体是用BamH I和Kpn I双酶切pBAC-rbcs-sNTL载体后，将载体大片段末端补平后连接得到的载体。
[0086]二、SaLPL的RNAi转基因小麦的鉴定
[0087]用针对FAD2 Intronl的引物对AtFAD-s2/AtFAD_a2对步骤一获得具有Basta抗性的SaLPL的RNAi转基因小麦的Ttl-T3代植株进行PCR鉴定。以重组表达载体pBAC-rbcs-LPL作为阳性对照，未转基因的小麦品种京花I号为阴性对照，同时设置向小麦中转入pBAC-rbcs的空载体对照。实验重复3次。
[0088]AtFAD-s2:5’ -TTCTGGTGGGTTGGTGGAAA-3’(序列 I 的第 1336-1355 位的反向互补序列)；
[0089]AtFAD-a2:5’ -CAGGTTGTGAAAGGGATTGCC-3，(序列 I 的第 720-740 位)。
[0090]结果如图9所示，作为阳性对照的pBAC-rbcs-LPL质粒扩增出636bp左右的目标带，而作为阴性对照的未转基因植株和转入pBAC-rbcs的空载体的植株均没有扩出目标片段；而SaLPL的RNAi转基因小麦可扩增出636bp左右的目标片段，这些扩增出约636bp目的片段的转基因小麦为阳性植株。从阳性植株中随机选取I株，种成株系，命名为dsLPL-1。
[0091]实施例3、SaLPL的RNAi转基因小麦对麦长管蚜防治效果研究
[0092]麦长管蚜种群，室内饲养蚜虫三代，期间从未施用过任何杀虫剂。室内饲养温度为21±1°C，相对湿度为30-40%，光周期为L:D=16h:8h。蚜虫饲养在感蚜小麦品种京411上，两周更换一次新鲜的幼苗用于蚜虫
[0093]一、SaLPL的RNAi转基因小麦对麦长管蚜脂蛋白酯酶基因表达量干扰效果分析
[0094]以处于一龄时期的麦长管蚜为实验材料，饲喂在T3代SaLPL的RNAi转基因株系dsLPL-1上5天。利用qRT-PCR技术分析麦长管蚜体内脂蛋白酯酶基因的表达量。具体操作如下:
[0095]设计脂蛋白酶基因SaLPL的扩增引物对SaLPL-s2/SaLPL_a2 (扩增片段大小为249bp),设计内参基因β -actin的扩增引物对Actin-sl/Actin_al (扩增片段大小为238bp)0
[0096]脂蛋白酶基因SaLPL的扩增引物:
[0097]SaLPL-s2:5’ -AGGCGTCTCTGTCATCTACC-3’ ；
[0098]SaLPL-a2:5， -TGTGTCAAGAACCCAAGGA-3，。
[0099]内参基因β -actin的扩增引物:
[0100]P3-F:5， -CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3，；
[0101]P3-R: 5，-GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3，。
[0102]取麦长管蚜，按照美莱博RNA提取试剂盒提取总RNA，用针对SaLPL基因的引物对SaLPL-s2/SaLPL-a2 (扩增片段大小为249bp)进行实时荧光定量PCR。以β-actin为内参基因，扩增引物对为Actin-sl/Actin-al (扩增片段大小为238bp)。取500ng总RNA反转录为cDNA,稀释10°、IO1UO2UO3' IO4、IO5倍，作为荧光定量PCR的模板，检测以上2对引物的特异性。经检测特异性良好后进行正式检测。
[0103]实时荧光定量PCR体系:上下游引物(浓度ΙΟμπιοΙ.L—1)各0.5 μ L、2 X TransStart TM Green qPCR SuperMixl2.5 μ L> Passive Reference Dye 0.5 μ L、模板 cDNAI μ L, ddH20 补充至 25 μ L。
[0104]PCR 循环程序:95°C 30s ；95°C 5s，57°C 15s，72°C 10s，40 个循环；每个样本 3 个重复。
[0105]最终结果的计算采用I—一法(Ct表示循环数)进行计算，使用EXcel2003软件进行统计学分析，具体参见 “Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the2 AAct method.Methods25(4):402~408.”一文，使用Excel2003软件进行统计学分析，计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析(t-test，n=3，P < 0.01或0.05)。
[0106]实验重复3次，结果取平均值。
[0107]同时设置以未转基因的小麦品种京花I号(CK)和转入pBAC-rbcs空载体的小麦植株饲喂麦长管蚜的对照。
[0108]结果如图10所示，从图中可以看出，麦长管蚜取食dsLPLl叶片5天后，其体内脂蛋白酯酶基因表达量较对照(CK)降低。以上结果表明，SaLPL的RNAi转基因小麦可有效降低麦长管蚜体内脂蛋白酯酶的表达量。
[0109]二、SaLPL的RNAi转基因小麦对麦长管蚜繁殖率的影响
[0110]以处于一龄麦长管蚜为实验材料，分别饲喂在T3代SaLPL的RNAi转基因株系dsLPLl上3、6、10、17天。饲喂在两种转基因株系上的麦长管蚜的初始数量均为5头。饲喂
3、6、10、17天后，统计各转基因株系上麦长管蚜的数目。
[0111]实验重复3次，结果取平均值。
[0112]同时设置以未转基因的小麦品种京花I号(CK)和转入pBAC-rbcs空载体的小麦植株饲喂麦长管蚜的对照。[0113]结果如图11示，从图中可以看出，饲喂转基因株系dsLPLl的3、6、10、17天后，麦长管蚜数目均较对照(CK)极显著降低。而对于用转入pBAC-rbcs空载体的小麦植株饲喂麦长管蚜的对照组，其结果与未转基因对照 (CK)基本一致，无统计学差异。以上结果表明，SaLPL的RNAi转基因小麦可有效降低麦长管蚜的繁殖率。
【权利要求】
1.如式(I)所示的DNA片段: SEQ正向-X-SEQ反向(I) 所述序列如序列表中序列I的第21-563位核苷酸所示； 所述SEQ的序列与所述序列反向互补； 所述X是所述SEQ1^1与所述SEQi^i间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ1向及所述SEQfi^1均不互补。
2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述X的序列如序列表中序列2所/Jn ο
3.根据权利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于:所述DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列I所示。
4.含有权利要求1-3中任一所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体； 所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为rbcS启动子。
6.权利要求1-3中任一所述的DNA片段编码得到的RNA分子。
7.权利要求1-3中任一所述的DNA片段，或权利要求4或5所述的重组表达载体、表达盒或重组菌，或权利要求6所述的RNA分子在如下al) -a4)任一中的应用: al)抑制麦长管蚜脂蛋白酯酶表达； a2)降低麦长管蚜的繁殖率； a3)防治麦长管蚜； a4)培育抗麦长管蚜的转基因植物。
8.一种培育抗麦长管蚜的转基因植物的方法，包括如下步骤:将权利要求1-3中任一所述的DNA片段导入目的植物中，得到抗麦长管蚜的转基因植物； 所述抗麦长管蚜具体体现在如下bl)和/或b2): bl)抑制麦长管蚜的脂蛋白酯酶表达； b2)降低麦长管蚜的繁殖率。
9.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.根据权利要求9所述的应用或方法，其特征在于:所述单子叶植物为小麦。
【文档编号】C12N15/113GK103667294SQ201310644179
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】梁荣奇, 倪中福, 许兰杰, 张小华, 侯起岭, 尤明山, 解超杰, 李保云, 彭惠茹, 姚颖垠, 杜金昆, 刘志勇, 胡兆荣, 孙其信 申请人:中国农业大学