用于检测gdnf剪接变异体2、4的实时荧光定量pcr专用引物及方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测GDNF剪接变异体2、4的实时荧光定量PCR专用引物及方法。所述引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。所述荧光定量PCR方法，以脑组织cDNA样品为模板，同时设立无模板对照，利用上述的引物，摸索并优化定量反应体系的条件参数，开发出可靠、灵敏的剪接变异体定量检测方法。本发明可以检测GDNF剪接变异体2（GenecodeNO.：NM_001190469.1）和剪接变异体4（GenecodeNO.:NM_199231.2）表达水平，具有特异性强、重复性高的优点。
【专利说明】用于检测GDNF剪接变异体2、4的实时荧光定量PCR专用引物及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测领域，具体涉及检测GDNF剪接变异体的实时荧光定量PCR的方法，特别涉及一种检测⑶NF剪接变异体2 (Gene code N0.:NM_001190469.1)和剪接变异体4 (Gene code N0.:NM_199231.2)表达水平的引物。
【背景技术】
[0002]胶质细胞系源性神经营养因子(glialcell-line derived neurotrophicfactor, GDNF)是一个研究历史较长的蛋白，最初在大鼠胶质瘤细胞株B49的培养基中分离出来，被认为可维持神经元的发育和再生，促进神经元轴突的生长(Lin et al.1993)。从蛋白质结构来看，⑶NF属转化生长因子_β超家族成员(transforming growthfactor- β , TGF- β ) (Airaksinen and Saarma, 2002)。距今为止，各国研究者对它的研究已接近20年，对其生物学作用也开展了多方面探索，认为该蛋白不仅仅以旁分泌途径作用于其他细胞，也以自分泌途径作用于自身，是一个具重要调节作用多效能营养因子。比如:在帕金森病动物模型和一些体外研究中，该因子保护多巴胺能神经元，是一个很重要的治疗帕金森病的候选因子(Lin et al., 1993; Bjorklund et al., 2000;Airaksinen and
Saarma, 2002);在生殖方面的研究中，⑶NF可在支持细胞中分泌，通过旁分泌途径对精原干细胞的增值和分化起具有决定作用(Guan et al，2006)。 [0003]人类⑶NF基因位于5号染色体pl2_pl3.1区，含2个启动子、4个内含子和5个外显子(Baecker PA et al，1999，结构模式图详见图1)。该基因在转录过程中外显子4发生5’选择性剪切，同时由于存在两个启动子，可转录为不同的mRNA序列，其剪接模式详见图2。
[0004]在对基因转录过程中的产生的各种mRNA剪接变异体进行检测过程中，通常采用复杂且昂贵的杂交探针，相较于杂交探针的方法，采用荧光定量PCR具有快速、廉价和精确的特点，为达到检测基因的选择性剪接目的，适应于荧光定量方法，筛选出合适的引物以及适当的PCR扩增条件体系是关键。针对现有技术的检测发现，国内外尚未用于检测GDNF剪接变异体2、4 (亦即pre-(i3)pix)-GDNF)的实时荧光定量PCR专用引物及方法的报道。
【发明内容】
[0005]为解决以上技术问题，需要开发专门用于检测pre-( β )pro-GDNF mRNA表达水平的实时荧光定量PCR专用引物及方法。本发明目的之一在于提供一种特异性引物，用于人组织或细胞内剪接变异体2 (Gene code N0.:NM_001190469.1)和剪接变异体4 (Genecode N0.:NM_199231.2)荧光定量检测(注:如【背景技术】所述，由于该两个剪接变异体存在相同的78bp剪接片段缺失，该种类型剪接变异体被称之为pre-W )pro-GDNF，故以下均用pre-(^ )pro-GDNF代表以上cDNA序列)。本发明的另一个目的在于提供一种用于检测人组织或细胞内pre-(i3 )pix)-GDNF实时荧光定量检测的实时荧光定量PCR的方法。[0006]本发明的目的是这样实现的:
[0007]一种用于检测pre-(i3)pro-GDNF mRNA表达水平实时荧光定量的引物，其关键在于:其特异性双向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0008]特异性序列的弓丨物序列为:
[0009]上游引物:CCGCCGGACGGGACTTTA(SEQID N0.1),
[0010]下游引物:ATATTTGCGGCGGGCAGC(SEQ ID N0.2)。
[0011]一种用于检测人组织或细胞内检测pre-W )pro-GDNF mRNA表达水平的实时荧光定量方法。其特征包括以下几个步骤:
[0012]人组织或细胞cDNA标准品的制备，以样品cDNA为模板，利用本发明提供的引物进行荧光定量PCR，建立实时荧光定量PCR的体系。
[0013]本发明提供的优选实时荧光定量扩增反应程序:
[0014]应用LightCycler? 480System Real Time PCR 扩增仪，95 °C 预变性 30 秒，ICycle ;95°C变性 5 秒，60°C退火 20 秒，72°C延伸 10 秒，40Cycles ；
[0015]本发明提供的优选配制PCR反应液，包括:SYBR? PremiX Ex Taq (TAKARADRR041A) 10 μ I, PCR Forward Primer (SEQ ID N0.1,10 μ M) 0.5 μ I, PCRReverse Primer(SEQ ID N0.2，10 μ M) 0.5 μ 1，cDNA 模板 I μ I, dH208 μ I。
[0016]该方法的有益效果主要体现在:本发明通过设计特异性引物，用于特异性检测人组织或细胞中pre- ( β ) pro-GDNF mRNA表达水平，通过摸索并优化实时荧光定量PCR反应体系的条件参数等，建立一种快速有效的荧光定量PCR检测方法，可对人组织或细胞中的pre-(^)pro-GDNF mRNA表达水平进行准确的定量检测。通过融解曲线、扩增效率等验证，结果表明该体系特异性强、重复性好、操作简单，可作为准确检测pre-(P )pro-GDNF mRNA表达水平检测样品的手段。
[0017](I)特异性强:结果显示，该荧光定量PCR引物仅对pre-W)pro-GDNF mRNA进行特异性扩增，而对其他GDNF剪接变异体如pre- ( a ) pro-GDNF mRNA均未见扩增。
[0018](2)重复性好:同样样品PCR模板与Ct值之间具有良好的线性函数关系，操作简单大大缩短检测周期。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为人类⑶NF基因示意图注:1、据EMBL-bank、GenBank中数据修订，原图自Baecker et al.(1999)，黑色方框表示外线子，黑色实线表示内含子；2、虚线内所示区域为外显子I至外显子4序列结构，基因在转录过程中该区域发生的选择性剪接，可转录为不同的mRNA序列。
[0020]图2为⑶NF基因选择性剪接位点及引物设计位点示意图。(A)由于⑶NF基因在转录过程中在外显子4和5之间存在选择性剪接，导致对应转录为不同的mRNA，其Genecode N0.分别为:ΝΜ_000514.3、ΝΜ_001190469.1、ΝΜ_001190468.1、ΝΜ_199231.2。由于ΝΜ_001190469.1和ΝΜ_199231.2都存在5’选择性剪接，两个剪接变异体存在相同的78bp剪接片段缺失，该种类型剪接变异体被称之为pre-( β )pix)-GDNF，78bp剪接片段没有缺失的 NM_000514.3 和 ΝΜ_001190468.1 称之为 pre- ( a ) pro-GDNF ; (B)该 SEQ ID N0.1 和 SEQIDN0.2的引物对组合可特异性扩增pre-W )pro-GDNF。[0021]图3为该荧光定量引物的特异性评价。其中，A为采用该引物获得的目的基因的电泳图谱，I为DNA Marker，2-7为PCR产物，采用该对引物获得目的片段，其大小为lOObp，符合设计要求为荧光定量产物熔解曲线，多个重复的熔解曲线具有单一峰值。
[0022]图4为引物扩增效率标准曲线:采用该引物，荧光定量体系条件下，采用标准品cDNAlO倍系列稀释的扩增效率曲线，误差为0.00817，扩增效率为1.968，斜率为:-3.400，截距为:26.93，相关系数为:0.999。
[0023]图5为引物精确度评价:采用该引物，荧光定量体系条件下，采用标准品cDNAlO倍系列稀释及阴性对照的扩增曲线。
[0024]图6为在60°C条件采用荧光定量体系和引物检测，神经胶质细胞中SYBRGreen I实时荧光定量PCR检测pre-(i3)pro-GDNF表达量。A为Ct值曲线；B为Ct值数值；C为熔解曲线检测整个过程中荧光实时信号。
【具体实施方式】
[0025]以下实施例进一步说明本方法的内容，但不以任何形式限制本发明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领技术人员所熟知的常规手段。
[0026]实施例1
[0027]pre-( β ) pro-GDNF表达检测特异性引物的设计，针对研究背景所述pre_(3 )pro-⑶NF mRNA的特殊序列,应用Primer Premier5.0软件设计引物序列。交由上海生工生物有限公司合成。
[0028]本发明得到的引物序列为:
[0029]上游引物:CCGCCGGACGGGACTTTA(SEQID N0.1),
[0030]下游引物:ATATTTGCGGCGGGCAGC(SEQ ID N0.2)。
[0031]实施例2RNA提取
[0032]在培养U251细胞的培养板中加入TRIzol (Invitrogen公司)裂解细胞，每IOcm2面积加入Iml Trizol，移液器吸打后，室温静置5min，加入0.2ml氯仿，颠倒混匀15s，静置2min后，4°C条件下1000Og离心lOmin，吸取上层水相至另一干净EP管中，加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置IOmin后，4°C条件下1000Og离心lOmin，弃上清；加入lml85%乙醇洗涤沉淀。4°C，5000g离心30s，弃上清；晾干，加入30 μ I的DEPC H2O溶解。
[0033]实施例3mRNA 反转录:按照 1st strand cDNA synthesis kit (TAKARA D6210S)试剂盒说明进行反转录。
[0034]Ist-Strand cDNA 合成反应
[0035]1.在 Microtube 中配制下列反应混合液:01igo dT Primer (50 μ Μ) I μ I, dNTPMixture (IOmM each) I μ I, Total RNA:5 μ g 以下，加入 RNase free dH20 至 10μ1。
[0036]2.65°C保温5min后，冰上迅速冷却。
[0037]3.在上述Microtube管中配制下列反转录反应液,总量为20 μ I。上述变性后反应液 10 μ I, 5XPrimeScript II Buffer4 μ I, RNase Inhibitor (40U/ μ I) 0.5 μ I (20U),PrimeScript II RTase (200U/μ I) I μ I (200U)，加入 RNase free dH20 至 20μ1。缓慢混匀。
[0038]4.按下列条件进行反转录反应:30°C IOmin,42°C 40min,95°C 5min,冰上冷却。获得 cDNA。
[0039]实施例4胶质瘤细胞内检测pre-(i3)pro-GDNF mRNA表达水平的实时荧光定量方法的建立。本发明提供的优选实时荧光定量扩增反应程序:
[0040]应用LightCycler? 480System Real Time PCR 扩增仪，将所有 DNA 样品分别配置 Realtime PCR 反应体系。体系配置如下:SYBR? Premix Ex Taq (TAKARA DRR041A)10 μ I,PCR Forward Primer (SEQ ID N0.1,10 μ M) 0.5 μ I,PCR Reverse Primer (SEQ IDN0.2，10 μ M) 0.5 μ 1，cDNA模板I μ 1，dH208 μ 1，轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心；将19 μ I混合液加到PCR板对应的每个孔中，再加入对应的I μ I DNA,小心粘上封口膜，并短暂离心混合。在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上。
[0041]所有的指 标均按以下程序进行:
[0042]95°C预变性30秒，ICycle ;95°C变性5秒，60°C退火20秒，72°C延伸10秒(收集荧光)，40Cycles ;从601:缓慢加热到95°C执行熔解曲线检测。
【权利要求】
1.用于检测GDNF剪接变异体2、4的实时荧光定量PCR专用引物及方法，其特征在于:实时荧光定量PCR专用引物，主要用于检测人组织或细胞内剪接变异体2(Gene code N0.:NM_001190469.1)和剪接变异体4 (Gene code N0.: NM_199231.2)表达量，其核苷酸序列分别如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
2.用于检测GDNF剪接变异体2、4的实时荧光定量PCR专用引物及方法，其实时荧光定量PCR方法，主要用于检测人组织或细胞内pre-( β )pro-GDNF实时荧光定量检测的方法，其特征在于:应用 LightCycler--480 System Real Time PCR 扩增仪，95°C预变性 30 秒，ICycle ;95°C变性5秒，60°C退火20秒，72°C延伸10秒，40 Cycles ;本发明提供的优选配制PCR 反应液，包括:SYBR--Premix Ex Taq (TAKARA DRR041A)10 μ I,PCR Forward Primer(SEQ ID N0.1,10 μ M) 0.5 μ I, PCR Reverse Primer (SEQ ID N0.2,10 μ M) 0.5 μ I,cDNA 模板 I μ 1，dH20 8 μ I。
【文档编号】C12N15/11GK103614481SQ201310648187
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】李 亨, 高殿帅, 张宝乐, 柴祥, 何涛 申请人:徐州医学院