用于检测菊黄东方鲀生长速度的引物对及方法
【专利摘要】本发明涉及检测菊黄东方鲀生长速度的引物对及方法，该引物对由碱基序列为SEQ?ID?NO：1的上游引物和SEQ?ID?NO:2的下游引物组成，提取多个样品菊黄东方鲀的DNA序列，采用上述引物对作为PCR扩增的引物进行PCR扩增；将扩增产物进行PAGE、染色处理；观察对比各个样品的条带，含有较多条带的个体是胜正速度快的个体。通过本发明的引物对和检测方法，能够有效的对于不同个体的菊黄东方鲀的生长速度进行筛选，为人工育种提供有效的信息，筛选后能够得到生长速度块的个体养殖时间短，节约了养殖成本。并且其方法简单、速度快，能够广泛的用于各个地域。
【专利说明】用于检测菊黄东方鈍生长速度的引物对及方法
[【技术领域】]
[0001]本发明涉及菊黄东方飩的检测引物和方法，具体涉及检测菊黄东方飩生长速度的引物对及方法。
[【背景技术】]
[0002]菊黄东方飩(Fugu flavidus)俗称艇巴、乖鱼、菊黄、满天星等,分类上隶属飩形目(Tetraodontif-ormes)飩科(Tetraodontidae)东方飩属(Fugu),主要分布于我国黄海、东海和渤海。由于其味道鲜美，营养丰富，颇受欢迎，是一种名贵的养殖种类。在养殖过程中，生长速度快的个体可以缩短养殖时间，提高饲料的利用率，节约养殖成本，因此培育筛选生长速度快菊黄东方飩是水产养殖者追求的目标。目前在菊黄东方飩中，与生长相关的分子标记研究是空白。
[0003]肌肉生长抑制因子(Myostatin，MSTN)最先从小鼠骨骼肌cDNA文库克隆到，它主要在肌肉组织中大量表达，属于TGF-β超级家族。对MSTN基因敲除小鼠地研究表明，突变小鼠的体重比杂合体和野生型小鼠体重增加约30%，其中肌细胞增生(hyperplasia)和肌纤维肥大(hypertrophy)双重作用所造成的肌肉肥大是造成体重增加的主要原因，并且这一特性与动物的性别及年龄无关，而且不影响动物的繁殖能力。因此，MSTN是肌肉生长的一个重要负调控主效基因。活化的MSTN与细胞膜表面受体(活化素受体蛋白II B (ACVR2B)和活化素受体蛋白IB (ACVRB))相结合，可以激活下游的S妈的2/3和p38MAPK细胞内信号传导途径，从而调节各组织的生长发育。
[0004]在《黄颡鱼MSTN基因多肽性及其与生长性状的相关分析》(朱媛媛等，遗传，2012年I月34 (I):72-78页)一文中，披露了 MSTN对黄颡鱼生长速度的影响，通过转基因技术和DNAi技术抑制斑马鱼的MSTN基因发现实验鱼的肌肉明显比正常鱼发达，因此认为该基因在动物肌肉生长发育中起到重要抑制作用，也可能参与脂肪的生成和调节。在鱼类中，MSTN mDNA可以在肌肉，眼，脑、肠`、腮、肾、心、脾中发现，并且在不同的鱼种中MSTN还分为两类，MSTN1、MSTN2(牙鲆肌肉生长抑制素(MSTN)基因克隆，徐建勇、陈松林，水产学报第32卷第 4 期，2008 年 7 月，497-498 )。
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【发明内容】
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[0005]为了弥补现有技术的空白，提供一种能够对于菊黄东方飩生长速度进行检测的引物对。
[0006]菊黄东方飩中存在可用于筛选生长相关的片段，该片段位于菊黄东方飩MSTN2基因3端非翻译区域如序列SEQ ID NO:3及附图1所示。其中框里阴影部分为GT重复的微卫星核心区域。在菊黄东方飩中存在染色体加倍现象，在扩增过程中，其他拷贝上的片段也会出现扩增现象。
[0007]在上述发现的基础上，发明一种检测菊黄东方飩生长速度的引物对，该引物对由碱基序列为SEQ ID NO:1的上游引物和SEQ ID NO:2的下游引物组成。[0008]本发明还包括一种检测菊黄东方飩生长速度的方法，于由以下步骤组成，
[0009]提取样品菊黄东方飩的肌肉生长抑制因子的DNA序列，
[0010]采用上述引物对作为PCR扩增的引物对样品进行PCR扩增；
[0011 ] 将扩增产物进行PAGE、染色处理；
[0012]观察对比各个样品的条带，条带越多的个体生长速度越快。
[0013]上述方法还具有如下优化方案:
[0014]所述的PCR扩增的反应体系20 μ L，包括2ul 10 XPCR缓冲液，0.8ul IOmmoI/L的dNTP mix, 0.4 μ mol/L的上游引物，0.4 μ mol/L的下游引物，30ng的样品菊黄东方飩DNA0
[0015]所述的PCR扩增反应条件如下，94°C变性3分钟，然后94°C变性30秒，55°C复性30秒，及72°C延伸30秒，42个循环，最后72°C延伸10分钟。
[0016]通过本发明的引物对和检测方法，能够有效的对于不同个体的菊黄东方飩的生长速度进行筛选，为人工育种提供有效的信息，筛选后能够得到生长速度块的个体养殖时间短，节约了养殖成本。并且其方法简单、速度快，能够广泛的用于各个地域。
[【专利附图】
【附图说明】]
[0017]图1为菊黄东方飩MSTN2基因中的微卫星核心区域示意图；
[0018]图2位不同样品菊黄东方飩的PAGE条带对比图。
[【具体实施方式】]`
[0019]下面通过具体实施例结合附图对本发明做进一步说明，下述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。
[0020]实施例1:选用取自半龄的菊黄东方飩，按照体重体长分成两组，按常规方法采用酚氯仿抽提法(参见黄培堂等译《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002年9月)提取菊黄东方飩DNA，设计合成一对选择性扩增引物:
[0021]MSTN2SSR3F1 5 ’-CCTGTTTCTTTGGGACGTTTTGG-3’，
[0022]MSTN2SSR3R1 5’ -GATTCTGTGGGAAGATGCGGT-3’ ；
[0023]对其DNA进行PCR扩增，反应体系20 μ L，包括2ul 10XPCR缓冲液，0.8ull0mmol/L的dNTP mix, 0.4 μ mol/L的上游引物,0.4 μ mol/L的下游引物，30ng的样品菊黄东方飩DNA，反应条件如下，94°C变性3分钟，然后94°C变性30秒，55°C复性30秒，及72°C延伸30秒，42个循环，最后72°C延伸10分钟。
[0024]产物经6%的变性PAGE电泳，经过染色显色，观察结果,操作如下:取等量变性上样缓冲液加入PCR产物(配方见分子克隆手册)，99°C变性10分钟，在尿素变性PAGE (6%)中进行电泳至溴酚蓝跑出PAGE。进行银染，固定，染色及显色。如图2所示，观察条带大小，含有187-189bp大小条带的个体，是生长速度快的个体。
[0025]图中GT-3表示在序列中GT重复次数为3，GT_4表示GT重复次数为4次，GT_5表示GT重复次数为5次，GT-6表示GT重复次数为6次。
[0026]其中GT次数为3-4次的个体，为生长速度慢的个体,GT重复次数在5_6次的为生长速度快的个体。
[0027]养殖户可以通过该种方法，选择生长速度快的个体进行养殖，养殖速度快，经济效益高。
【权利要求】
1.一种用于检测菊黄东方飩生长速度的引物对，其特征在于由碱基序列为SEQ ID NO:I的上游引物和SEQ ID NO:2的下游引物组成。
2.一种检测菊黄东方飩生长速度的方法，其特征在于由以下步骤组成， 提取样品菊黄东方飩的肌肉生长抑制因子的DNA序列， 采用权利要求1引物对作为PCR扩增的引物对样品进行PCR扩增； 将扩增产物进行PAGE、染色处理； 观察对比各个样品的条带，条带越多的个体生长速度越快。
3.如权利要求2所述的检测菊黄东方飩生长速度的方法，其特征在于所述的PCR扩增的反应体系 20yL，包括 2ul 10 X PCR 缓冲液，0.8ul 10mmol/L 的 dNTP mix, 0.4 μ mol/L 的上游引物，0.4ymol/L的下游引物，30ng的样品菊黄东方飩DNA。
4.权利要求2所述的检测菊黄东方飩生长速度的方法，其特征在于所述的PCR扩增反应条件如下，94°C变性3分钟，然后94°C变性30秒，55°C复性30秒，及72°C延伸30秒，42个循环，最后72°C 延伸10分钟。
【文档编号】C12N15/11GK103805694SQ201310654636
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】张之文, 施永海, 张根玉, 张海明, 张中华, 徐嘉波, 邓平平 申请人:上海市水产研究所