一种小麦籽粒硬度基因的ssr分子标记方法
【专利摘要】本发明公开了一种小麦籽粒硬度基因的SSR分子标记方法,它涉及小麦分子标记辅助育种【技术领域】,它通过在与硬度基因紧密连锁的一个具有微卫星特征的核苷酸序列中设计包含该微卫星重复区段的PCR引物,对目标品种进行PCR扩增后,通过聚丙烯酰胺电泳,可以对品种间Pina和Pinb基因的等位变异进行判定,具有简便、快速、稳定性高和等位基因多样性高等优点,仅采用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳即可完成。
【专利说明】—种小麦籽粒硬度基因的SSR分子标记方法
【技术领域】:
[0001]本发明属于小麦分子标记辅助育种【技术领域】,涉及一种小麦籽粒硬度基因的SSR分子标记方法。
【背景技术】:
[0002]籽粒硬度是国内外小麦市场分级和定价的重要依据。它能够影响面粉颗粒度大小、出粉率、润麦加水量、破损淀粉粒数量。硬度值小的小麦磨制的面粉颗粒度较小、破损淀粉含量低,吸水能力较弱,而硬度值大的小麦磨制的面粉颗粒度大、破损淀粉含量高,具有较强的吸水能力。这些特性的差异影响揉制面团特性,从而影响制作食品的类型。如软质小麦适合于制作饼干和糕点等甜食类食品;硬质麦面粉适合制作面包和优质面条等食品。
[0003]小麦的籽粒硬度性状主要由位于小麦染色体短臂上紧密连锁的Puroindoinea (Pina)和Puroindoine b (Pinb)基因调节,两个基因编码区在染色体上的间距为17kb。Pina和Pinb基因都处于野生状态时,籽粒表现为软质;当Pina或Pinb基因任一基因缺失或突变时,籽粒表现为硬质;当缺乏D组染色体时,籽粒硬度最大,称硬粒麦,又称杜伦麦(Durum)。目前,已在普通小麦中发现大量Pina和Pinb基因的突变类型,除少部分为片段缺失以外,多为单碱基突变。如常见的硬质小麦类型Pinb-Dlb,是Pinb基因中223位点的鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A),导致该基因的氨基酸序列中第46位点的甘氨酸(Glycine,Gly)突变为丝氨酸(Serine, Ser)。
[0004]而目前SNP主要检测方法有如下缺陷:一、以凝胶电泳为基础的传统检测方法,如限制性片段长度多态性、变性梯度凝胶电泳、等位基因特异PCR等,检测灵敏度低;二、核苷酸测序法,需要昂贵的3730测序仪,每个样品的成本在10元左右;三、基因芯片,同样需要昂贵的仪器,四、Taqman探针法,合成一条荧光引物的成本在300元左右。`
【发明内容】
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[0005]针对上述问题,本发明要解决的技术问题是提供一种小麦籽粒硬度基因的SSR分子标记方法。
[0006]在NCBI数据库中检索到包含pina和pinb基因的BAC序列,该BAC库包含187kb的核苷酸序列,通过SSRfinder软件寻找到20个具有简单重复的序列,根据SSR位点的重复序列的特征和Pina和pinb基因的距离核苷酸长度设计了 4对PCR引物。SSR5的正向引物为 GTTCGGGAGGTACCATAITT,反向引物为 AGTGGGGGTTAAGGAGTG ;SSR7 的正向引物为 CAAGTTTAGTTTCGCAAAA,反向引物为 TGTATGTGCAACTTTGTGAAG ;SSR9 的正向引物为 TTCAGCTTAACCATTCCTACA,反向引物为 CCTTCGAACCTAATGAAATCT ;SSR15 的正向引物为TCGTACAGAGGGAAGTTCAG,反向引物为 GCAGATGGAGTCTACACACTT。SSR5 和 SSR7 引物具有有效扩增,而SSR7具有明显的多态性。在187个普通小麦品种中发现4种等位变异,测序后发现核苷酸长度分别为 149bps, 151bps, 153bps, 155bps。SSR7-1 中 AG 重复 17 次,SSR7-2 中 AG重复18次,SSR7-3中AG重复19次,SSR7-4中AG重复20次,利用聚丙烯酰胺电泳可以清晰地将目标类型分开。对4中类型的不同品种的pina和pinb基因进行测序后发现,SSR7-3类型检测到野生型,SSR7-4类型中检测到Pinb-DlC突变,而SSR7-2类型检测到Pinb-DIB,而 SSR7-1 检测至Ij Pinb-Dlx0
[0007]本发明的有益效果为:SSR7所包含的由A和G两个碱基组成的基本序列串联重复组成的短片段,设计的SSR分子标记为共显性标记,仅采用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳即可完成,具有简便、快速、稳定性高和等位基因多样性高等优点。
【具体实施方式】:
[0008]本【具体实施方式】采用以下技术方案:它通过在与硬度基因紧密连锁的一个具有SSR特征的核苷酸序列中设计包含该SSR的PCR引物,对目标品种进行PCR扩增后,通过聚丙烯酰胺电泳,可以对品种间Pina和Pinb基因的等位变异进行判定。
[0009]所述的核苷酸序列为:
[0010]TTATTACTCACCTCGATTTTTGTTTGTAAGTGTGTTTATTTATTGGTCAAAGATAATTGTTTCTGGGGAAAAATGAAGGATTAGAAGAAGCTTGTCATGTGCCGAATCTCAATCTTCGATAAACCAAGGGAGAATAATTAGAAAAGATGGCTATCTAATATGACTCATTGCACTTTCTAGGTCAGAATCAAAACCCTTTTATGGCATTGTACATGGGGAGGTGAGCTCTGTTCTAAGGTTAATCCTAACCCGTGTTGTTTGAAATACCTATTTACCCCCTCCGATGCATCTAGATCCTCGGACACCTTGTTAAAAAAAATTACTTCCTTGGAGACAAATACTATTTTGGAGAATAATGAAAATCATTTAGAAACATTTGACATGAACGACATGATTCCAGAGACAATAAAAAACTTAAAAACAAACGATGGATAAGAAGATGATGTCTTGATAAATCATTACTTGTCGAGTTGTCGTGTACTACTAGTCTGTAAAATACAGTCTCTAACAAATTTGGTACAATCTGAGATCCATCTTGAACAACCTGCACAATCCTACAAGTTTAGTTTCGCAAAAGAATAACAATATGAACCATGTGACTTTCTTGGTACGTACAAAACCACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAGGGTCACACATCATTAGATAAGGTCTATCTTCACAAAGTTGCACATACATGTACAGTACAGGAAGCGACATGTATCTCAATACCACATGGTTCTAGATACTGGACGAAAAAGCAGTGGCTAGAAAGATGACGATATATAGATGCATTACTTATCATATACTACTACCTAGAAAAATACAATATCTAATTTCCTCTTGATCCTTCTTGAACAACCTGCACAACACTACAAGTTCAGTTTCACAAAAGCGTAAGTCTAAAGCTTTGGTACAACAACAACTTATGGTTTATTTTGAGAAAAGGTCAGATTCAGTACACGGAACATCACATATCTCAACAACTTCCACCAGTTTTGTGTGCTTTCAAAGTAACTTTGATTGGTATCCAGCTATACAACACACAACCGCACACAGAAATCGTGCCACCTCAATTATAAATAAAGGTGTGGCCTCATCTCATCTATTCATCTCCACCTGCACCAAAACACACTGACAACATGAAGGCCCTGATCTTCAGAGCAG,其所包含的 SSR 区段为 624-659。
[0011]本【具体实施方式】的具体标记的方法为:
[0012]I,按照CTAB法提取小麦品种新鲜叶片中的DNA,在热电公司的Nanodrop2000c仪器测定DNA浓度为1245ng/l.! L,稀释到100ng/ul。
[0013]2,从NCBI数据库中检索到包含pina和pinb基因的BAC序列,该BAC库包含187kb的核苷酸序列,通过SSRfinder软件寻找到20个具有简单重复的序列,根据SSR位点的重复序列的特征和Pina和pinb基因的距离核苷酸长度设计了 4对PCR引物。SSR5的正向引物为 GTTCGGGAGGTACCATAITT,反向引物为 AGTGGGGGTTAAGGAGTG ;S SR7 的正向引物为 CAAGTTTAGTTTCGCAAAA,反向引物为 TGTATGTGCAACTTTGTGAAG ;SSR9 的正向引物为 TTCAGCTTAACCATTCCTACA,反向引物为 CCTTCGAACCTAATGAAATCT ;SSR15 的正向引物为TCGTACAGAGGGAAGTTCAG,反向引物为 GCAGATGGAGTCTACACACTT。
[0014]3,PCR 反应体系为: 模板 DNA50ng,dNTP0.25mmol/L, 10*buffer,2.5 μ L,引物浓度0.4 μ mol/L, Taq DNA聚合酶0.5U,总体积为25 μ L。反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性lmin,55°C退火lmin,72°C延伸lmin,共40个循环;72°C延伸IOmin0
[0015]4,PCR产物电泳:扩增产物变性:在扩增产物中加入6μ I Loading buffer,95°C变性6min后立刻置于冰水混合物中待用。聚丙烯酰胺变性胶:60ml胶中加入210 μ I APS和70 μ I TEMED0预电泳:恒定功率(参数为80W),约30min。加入变性的扩增样品DNA4~6 μ 1,电泳约Ih (视SSR分子量大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间)。扩增产物的银染显色:放入染色液(lgAgN03+lL H20)中,轻轻摇动约5min以上。用蒸馏水冲洗约5sec立刻放入显影液(20g氢氧化钠溶入IL ddH20后,加入4ml甲醒和200 μ 110mg/ml硫代硫酸钠)中,至DNA条带显出。
[0016]5,记载SSR引物扩展条带的类型。首先利用10个小麦品种进行引物筛选,SSR9和SSR15引物未能有有效扩展,而有效扩增的SSR5和SSR7引物中SSR7具有明显的多态性。用SSR7引物对所有品种进行带型分析,SS7共分为4种类型:SS7-1,SS7-2,SS7-3,SS7-4。
[0017]6,将目标条带进行回收后送华大基因测序后发现SS7-1,SS7-2,SS7-3,SS7-4分另为 149bps, 151bps, 153bps, 155bps。SSR7-1 中 AG 重复 17 次,SSR7-2 中 AG 重复 18 次,SSR7-3中AG重复19次,SSR7-4中AG重复20次,
[0018]7,结合前人对这187份材料硬度基因测序结果发现:SSR7_1对应等位变异Pinb-Dlx, SSR7-2类型对应Pinb-DIB, SSR7-3类型对应野生型,SSR7-4类型中对应Pinb-DlC 突变。
[0019]本【具体实施方式】发现小麦基因组中一个与pina和pinb基因紧密连锁的多态性SSR位点,可以用于分子标记辅助选择育种。
[0020]以上显示和描述了`本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【权利要求】
1.一种小麦籽粒硬度基因的SSR分子标记方法,其特征在于:它通过在与硬度基因紧密连锁的一个具有SSR特征的核苷酸序列中设计包含该SSR的PCR引物,对目标品种进行PCR扩增后,通过聚丙烯酰胺电泳,可以对品种间Pina和Pinb基因的等位变异进行判定。
2.根据权利I中所述的一种小麦籽粒硬度基因的SSR分子标记方法,其特征在于:所述的核苷酸序列为:
TTATTACTCACCTCGATTTTTGTTTGTAAGTGTGTTTATTTATTGGTCAAAGATAATTGTTTCTGGGGAAAAATGAAGGATTAGAAGAAGCTTGTCATGTGCCGAATCTCAATCTTCGATAAACCAAGGGAGAATAATTAGAAAAGATGGCTATCTAATATGACTCATTGCACTTTCTAGGTCAGAATCAAAACCCTTTTATGGCATTGTACATGGGGAGGTGAGCTCTGTTCTAAGGTTAATCCTAACCCGTGTTGTTTGAAATACCTATTTACCCCCTCCGATGCATCTAGATCCTCGGACACCTTGTTAAAAAAAATTACTTCCTTGGAGACAAATACTATTTTGGAGAATAATGAAAATCATTTAGAAACATTTGACATGAACGACATGATTCCAGAGACAATAAAAAACTTAAAAACAAACGATGGATAAGAAGATGATGTCTTGATAAATCATTACTTGTCGAGTTGTCGTGTACTACTAGTCTGTAAAATACAGTCTCTAACAAATTTGGTACAATCTGAGATCCATCTTGAACAACCTGCACAATCCTACAAGTTTAGTTTCGCAAAAGAATAACAATATGAACCATGTGACTTTCTTGGTACGTACAAAACCACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAGGGTCACACATCATTAGATAAGGTCTATCTTCACAAAGTTGCACATACATGTACAGTACAGGAAGCGACATGTATCTCAATACCACATGGTTCTAGATACTGGACGAAAAAGCAGTGGCTAGAAAGATGACGATATATAGATGCATTACTTATCATATACTACTACCTAGAAAAATACAATATCTAATTTCCTCTTGATCCTTCTTGAACAACCTGCACAACACTACAAGTTCAGTTTCACAAAAGCGTAAGTCTAAAGCTTTGGTACAACAACAACTTATGGTTTATT TTGAGAAAAGGTCAGATTCAGTACACGGAACATCACATATCTCAACAACTTCCACCAGTTTTGTGTGCTTTCAAAGTAACTTTGATTGGTATCCAGCTATACAACACACAACCGCACACAGAAATCGTGCCACCTCAATTATAAATAAAGGTGTGGCCTCATCTCATCTATTCATCTCCACCTGCACCAAAACACACTGACAACATGAAGGCCCTGATCTTCAGAGCAG,其所包含的 SSR 区段为 624-659。
【文档编号】C12Q1/68GK103757096SQ201310655956
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】张怀刚, 刘宝龙, 李善福, 刘登才, 张波, 陈文杰, 沈裕虎, 李建民, 魏乐 申请人:中国科学院西北高原生物研究所