一种改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统及方法
【专利摘要】本发明公开一种改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统及方法。该载体系统分为三质粒和二质粒载体系统。三质粒系统包括病毒表达载体、原env沉默质粒或合成的双链siRNA、新env表达质粒、原嗜性病毒包装细胞。二质粒系统包括病毒表达载体、新旧env变换质粒、原嗜性病毒包装细胞。方法一是将三质粒系统中的三种质粒或二质粒系统中的二种质粒瞬时共转染至原嗜性病毒包装细胞内，获得新嗜性的病毒。方法二是将三质粒系统中的原env沉默质粒与新env表达质粒或二质粒系统中新旧env变换质粒稳定转入原嗜性病毒包装细胞，获得新嗜性的病毒。本发明扩展了包装细胞的嗜性，使其在基因工程和基因治疗的应用性得到极大的增强。
【专利说明】一种改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统及方法
【技术领域】
[0001]发明涉及一种改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统及方法，尤其是能包装出与包装细胞原嗜性不同的逆转录病毒的包装载体系统及方法。
【背景技术】
[0002]逆转录病毒是一种转移基因很有效的基因转移载体，在基因工程或基因治疗领域，野生型的逆转录病毒由于在宿主细胞能不断复制，具有毒性。为了阻止其病毒在宿主细胞复制，gag-pol和env (envelope)基因从病毒基因组中被剔除,使得病毒载体不具有复制性，在此病毒载体中可以插入我们想要转移的目的基因，因此变为带有目的基因的无毒性的基因转移病毒载体(通称:逆转录病毒表达载体或逆转录病毒载体)。而gag-pol和env基因通过基因工程的方法被转移到容易培养的细胞(比如293细胞、NIH-3T3细胞等)中稳定表达，当逆转录病毒表达载体转入该稳定表达gag-pol和env基因的细胞中后，产生的病毒RNA就可被包装成具有感染性的带有目的基因的逆转录病毒粒子，因此能稳定表达gag-pol和env基因的细胞我们称之为包装细胞。包装细胞中表达的env蛋白能与要进入的宿主细胞膜表面的受体蛋白结合，因此该env蛋白决定了包装出的逆转录病毒能感染什么种类的细胞，即病毒的嗜性(tropism)。根据env的不同，可以分为单嗜性(ecotropic)、多嗜性(amphotropic)、双嗜性(dualtropic)和泛嗜性(pantropic)的包装细胞，它们分别表达gap70、4070A、10Al、VSV-G包膜蛋白。单嗜性的包装细胞包装出的逆转录病毒只能感染小鼠和大鼠细胞，因为包装出的病毒其包膜蛋白只能与小鼠或大鼠细胞上的受体结合；相似地，由多嗜性(amphotropic)、双嗜性(dualtropic)和泛嗜性(pantropic)的包装细胞包装出的病毒能分别感染表达多嗜性受体Ram-Ι的哺乳动物细胞、能表达Ram-1或GALV受体的哺乳动物细胞、和哺乳动物细胞及非哺乳动物细胞(参考文献1.Burns, J.C.,Friedmann, Τ., Driever, ff., Burrascano, M.& Yee,J.-K.(1993)Vesicular stomatitisvirus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very hightiter and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:8033 - 8037.)。泛嗜性的病毒是由水泡性口炎病毒(vesicularstomatitis virus, VSV)包膜蛋白(VSV-G)包装成的病毒，它进入宿主细胞的方式不同于其他嗜性的病毒，不经过与受体结合，而是通过脂质结合通过细胞膜融合而进入宿主细胞(参考文献 2 Emi, N., Friedmann, T.& Yee, J.-Κ.(1991) Pseudotyped formationof murine leukemia virus with G protein of vesicular stomatitis virus.J.Virol.65:1202 - 1207.)，因此它能进入几乎所有的哺乳动物和非哺乳动物细胞。
[0003]目前已经建立了多种包装细胞并可通过商业途径获得，比如基于NIH-3T3细胞的PT67、PA317 等，基于 HEK293 细胞的 B0SC23、Phoenix-E、Plat-E、GP2_293 等，这些包装细胞在建立时都已稳定转入了特定的包膜蛋白，因此它们`的嗜性都已经决定了。当我们想用这些嗜性决定了的包装细胞包装出其他嗜性的病毒时，往往没有办法做到。到目前为止，直接用现有已确定了嗜性的包装细胞来包装不同嗜性的逆转录病毒的方法还未见到。
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统，可以简单地拓展或改变现有包装细胞的嗜性范围，使包装出的逆转录病毒从原本只能感染某些种类细胞改变为能够感染其他种类细胞或能够感染更大范围种类的细胞，比如使原本只能包装出感染鼠源细胞的逆转录病毒变为能够包装出感染包括人源细胞在内的多种种类的细胞的逆转录病毒，为以逆转录病毒为基因载体的基因工程或基因治疗提供新的方法。
[0005]本发明载体系统分为三质粒载体系统、二质粒载体系统两种类型。
[0006]所述的三质粒载体系统包括逆转录病毒表达载体、原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白沉默载体(简称原env沉默质粒)或沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的双链siRNA、新嗜性病毒包膜蛋白表达载体(简称新env表达质粒)、原嗜性逆转录病毒包装细胞。
[0007]所述的二质粒载体系统包括逆转录病毒表达载体、新旧病毒包膜蛋白基因变换载体(简称新旧env变换质粒)、原嗜性逆转录病毒包装细胞。
[0008]在三质粒载体系统中:
[0009]所述的逆转录病毒表达载体为带有目的基因的无毒性的逆转录病毒载体质粒，具体包含有逆转录病毒的5’ LTR和3’ LTR、包装信号、目的基因序列。
[0010]所述的沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的双链siRNA为靶向原嗜性包装细胞包膜蛋白基因的双链siRNA，可通过RNA合成仪合成获得。
[0011]所述的原env沉默质粒为带有能使原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白表达沉默的表达盒的载体，包含有1个或多个能使原嗜性包膜蛋白表达沉默的表达盒，表达盒包含有启动沉默包装细胞病毒原包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA转录的启动子(驱动转录shRNA、miRNA可以是Pol II或Pol III启动子，驱动转录siRNA为Pol III启动子)核苷酸序列、编码shRNA或siRNA或miRNA的核苷酸序列、终止转录信号序列。表达盒能转录沉默包装细胞原包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA。多个表达盒可转录出多个针对编码原包膜蛋白的编码序列的不同祀点的shRNA或siRNA(对miRNA而言，一个表达盒即可设计达到转录多个针对编码原包膜蛋白的编码序列的不同靶点的miRNA)，使原包膜蛋白沉默得更加彻底。
[0012]所述的表达盒可以头头相对或头尾相连，也可以中间间隔其他元件分开排列。
[0013]所述的表达shRNA的表达盒包含有转录shRNA的启动子序列、编码shRNA的核苷酸序列、终止转录信号序列。
[0014]所述的表达siRNA的表达盒包含有转录双链siRNA的相对的两个pol III启动子序列、编码siRNA的核苷酸序列；其中该两个pol III启动子至少在-5到-1位突变为腺嘌呤A的脱氧核糖核苷酸，·相互为另一个pol III启动子提供终止信号poly T。
[0015]所述的表达miRNA的表达盒包含转录miRNA的启动子序列、编码miRNA的核苷酸序列、终止转录信号序列。
[0016]所述的pol II启动子包括CMV、MSCV、SV40、PGK等启动子(但不限于这些启动子)，相对应的终止转录信号可为poly A,为pol II提供转录终止信号。
[0017]所述的pol III启动子包括人源性的H1、U6、7SK等启动子或小鼠源性的U6、H1等启动子(但不限于这些启动子)；相对应的转录终止信号可为poly T，为Pol III提供转录终止信号。
[0018]所述的新env表达质粒为不同于包装细胞原嗜性的其他嗜性包膜蛋白表达质粒，具体包含有其他嗜性包膜蛋白的表达盒，该表达盒包含POL II启动子核苷酸序列、编码其他嗜性包膜蛋白的核苷酸序列、终止信号序列。
[0019]在二质粒载体系统中:
[0020]所述的逆转录病毒表达载体为带有目的基因的无毒性的逆转录病毒载体质粒，具体包含有逆转录病毒的5’ LTR和3’ LTR、包装信号、目的基因序列。
[0021]所述的新旧env变换质粒为载有沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的元件和表达新嗜性病毒包膜蛋白的元件的组合载体质粒，其中沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的元件包含1个或多个沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA表达盒，表达新嗜性病毒包膜蛋白的元件为表达新嗜性病毒包膜蛋白的表达盒，表达miRNA的表达盒与表达新嗜性包膜蛋白表达盒共用一个Pol II启动子与poly A终止信号或分别使用不同的启动子与终止信号。
[0022]本发明的另一个目的是利用上述改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统制备不同嗜性的逆转录病毒的方法。
[0023]本方法之一是将三质粒载体系统中逆转录病毒表达载体质粒、原env沉默质粒或沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的双链siRNA、新env表达质粒瞬时共转染至原嗜性逆转录病毒包装细胞内，或者二质粒载体系统中的逆转录病毒表达载体质粒、新旧env变换质粒瞬时共转染至原嗜性逆转录病毒包装细胞内，各质粒中表达盒在细胞中瞬时表达，得到新嗜性的逆转录病毒。
[0024]所述的瞬时表达为转入的基因物质不整合进原嗜性逆转录病毒包装细胞的染色体DNA中，只在转入的细胞中表达，在后代细胞中不一定表达。
[0025]本方法之二是将三质粒载体系统中的原env沉默质粒与新env表达质粒或二质粒载体系统中的新旧env变换质粒转染至原嗜性逆转录病毒包装细胞，然后用药物筛选出稳定表达细胞株，获得稳定的新嗜性逆转录病毒包装细胞，然后把逆转录病毒表达载体质粒转染至此新嗜性逆转录病毒包装细胞，得到新嗜性的逆转录病毒。
[0026]所述的稳定表达为转入的基因物质整合入原嗜性逆转录病毒包装细胞的染色体DNA中，在后代细胞中能稳定表达。
[0027]本发明通过沉默包装细胞的原包膜蛋白基因的表达，利用转入其他不同嗜性包膜蛋白的基因，可以使包装细胞包装出不同嗜性的逆转录病毒，扩展了包装细胞的嗜性，使其在基因工程和基因治疗的应用性得到极大的增强。
[0028]本发明与现有技术相比，所具有的优点、特点或积极效果，说明现有技术之缺陷:
[0029]到目前为止，直接改变现有已确定了嗜性的包装细胞的嗜性的方法还未见到。
[0030]现有技术的缺陷在于无法改变或拓展现有已确定了嗜性的包装细胞的嗜性范围，当我们手头只有某种嗜性的包装细胞时，便不可能用该包装细胞包装出其他嗜性的逆转录病毒。
[0031]本发明与现有技术相比，改变逆转录病毒嗜性不用通过使用不同嗜性的包装细胞，而是可以用手头已有的确定了嗜性的包装细胞，只需在包装环节在转染逆转录病毒表达载体质粒时，共转染原env沉默质粒或合成的沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的双链siRNA和新env表达质粒,或共转染新旧env变换质粒，即可包装出不同嗜性的逆转录病毒，简单易行；或者用手头已有的确定了嗜性的包装细胞，稳定转入原env沉默质粒和新env表达质粒，或新旧env变换质粒，即可改变或拓展包装细胞的嗜性范围，方便实用。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1.为实施例1所采用的原env沉默质粒图，其中各元件如下:
[0033]
【权利要求】
1.一种改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统，其特征在于分为三质粒载体系统、二质粒载体系统两种类型；其中三质粒载体系统包括逆转录病毒表达载体、原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白沉默载体或沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的双链siRNA、新嗜性病毒包膜蛋白表达载体、原嗜性逆转录病毒包装细胞；二质粒载体系统包括逆转录病毒表达载体、新旧病毒包膜蛋白基因变换载体、原嗜性逆转录病毒包装细胞。
2.如权利要求1所述的一种改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统，其特征在于沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的双链siRNA为靶向原嗜性包装细胞包膜蛋白基因的双链 siRNA。
3.如权利要求1所述的一种改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统，其特征在于原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白沉默载体为带有能使原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白表达沉默的表达盒的载体，包含有1个或多个能使原嗜性包膜蛋白表达沉默的表达盒，表达盒包含有启动沉默包装细胞病毒原包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA转录的启动子核苷酸序列、编码shRNA或siRNA或miRNA的核苷酸序列、终止转录序列，其中驱动转录shRNA、miRNA是Pol II或Pol III启动子，驱动转录siRNA为Pol III启动子；表达siRNA的表达盒包含有转录双链siRNA的相对的两个Pol III启动子序列、编码siRNA的核苷酸序列，该两个Pol III启动子至少在-5到-1位突变为腺嘌呤A的脱氧核糖核苷酸，相互为另一个PolIII启动子提供终止信号poly T。
4.如权利要求1所述的一种改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统，其特征在于所述的新嗜性病毒包膜蛋白表达载体为不同于包装细胞原嗜性的其他嗜性包膜蛋白表达质粒，包含有其他嗜性包膜蛋白的表达盒，该表达盒包含Pol II启动子核苷酸序列、编码其他嗜性包膜蛋白的核苷酸序列、终止信号序列。
5.如权利要求1所述的一种改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统，其特征在于所述的新旧病毒包膜蛋白基因变换载体为载有沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的元件和表达新嗜性病毒包膜蛋白的`元件的组合载体质粒，其中沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的元件包含1个或多个沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA表达盒，表达新嗜性病毒包膜蛋白的元件为表达新嗜性病毒包膜蛋白的表达盒；其中表达miRNA的表达盒与表达新嗜性包膜蛋白表达盒共用一个Pol II启动子与poly A终止信号或分别使用不同的启动子与终止信号。
6.利用如权利要求1所述的一种改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统制备不同嗜性的逆转录病毒的方法，其特征在于该方法包括两种形式，一种是将三质粒载体系统中逆转录病毒表达载体质粒、原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白沉默载体或沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的双链siRNA、新嗜性病毒包膜蛋白表达载体瞬时共转染至原嗜性逆转录病毒包装细胞内，或者将二质粒载体系统中逆转录病毒表达载体质粒、新旧病毒包膜蛋白基因变换载体瞬时共转染至原嗜性逆转录病毒包装细胞内，各质粒中表达盒在细胞中瞬时表达，得到新嗜性的逆转录病毒；另一种是首先将三质粒载体系统中的原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白沉默载体与新嗜性病毒包膜蛋白表达载体或二质粒载体系统中的新旧病毒包膜蛋白基因变换载体转染至原嗜性逆转录病毒包装细胞，然后用药物筛选出稳定表达细胞株，获得稳定的新嗜性逆转录病毒包装细胞，然后把逆转录病毒表达载体质粒转染至此新嗜性逆转录病毒包装细胞，得到新嗜性的逆转录病毒。
7.如权利要求6所述的利用改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统制备不同嗜性的逆转录病毒的方法，其特征在于沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的双链siRNA为靶向原嗜性包装细胞包膜蛋白基因的双链siRNA。
8.如权利要求6所述的利用改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统制备不同嗜性的逆转录病毒的方法，其特征在于原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白沉默载体为带有能使原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白表达沉默的表达盒的载体，包含有1个或多个能使原嗜性包膜蛋白表达沉默的表达盒，表达盒包含有启动沉默包装细胞病毒原包膜蛋白的shRNA或siRNA或miRNA转录的启动子核苷酸序列、编码shRNA或siRNA或miRNA的核苷酸序列、终止转录序列，其中驱动转录shRNA、miRNA是Pol II或Pol III启动子，驱动转录siRNA为Pol III启动子；表达siRNA的表达盒包含有转录双链siRNA的相对的两个Pol III启动子序列、编码siRNA的核苷酸序列，该两个Pol III启动子至少在-5到-1位突变为腺嘌呤A的脱氧核糖核苷酸，相互为另一个Pol III启动子提供终止信号poly T。
9.如权利要求6所述的利用改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统制备不同嗜性的逆转录病毒的方法，其特征在于所述的新嗜性病毒包膜蛋白表达载体为不同于包装细胞原嗜性的其他嗜性包膜蛋白表达质粒，包含有其他嗜性包膜蛋白的表达盒，该表达盒包含Pol II启动子核苷酸序列、编码其他嗜性包膜蛋白的核苷酸序列、终止信号序列。
10.如权利要求6所述的利用改变逆转录病毒包装细胞嗜性的载体系统制备不同嗜性的逆转录病毒的方法，其特征在于所述的新旧病毒包膜蛋白基因变换载体为载有沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的元件和表达新嗜性病毒包膜蛋白的元件的组合载体质粒，其中沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的元件包含1个或多个沉默原嗜性包装细胞病毒包膜蛋白的ShRNA或SiRNA或miRNA表达盒，表达新嗜性病毒包膜蛋白的元件为表达新嗜性病毒包膜蛋白的表达盒；其中表达miRNA的表达盒与表达新嗜性包膜蛋白表达盒共用一个Pol II启动子与poly A终止信号或分别使用不同的启动子与终止信号。
【文档编号】C12N15/867GK103667350SQ201310681131
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】王彦刈 申请人:杭州电子科技大学