控制害虫的方法
【专利摘要】本发明涉及一种控制东方黏虫害虫的方法，包括：将东方黏虫害虫与Cry1A蛋白接触。本发明通过植物体内产生能够杀死东方黏虫的Cry1A蛋白来控制东方黏虫害虫；与现有技术使用的农业防治方法、化学防治方法和物理防治方法相比，本发明对植物进行全生育期、全植株的保护以防治东方黏虫害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定、彻底，简单、方便、经济。
【专利说明】控制害虫的方法
【技术领域】[0001]本发明涉及一种控制害虫的方法，特别是涉及一种用在植物中表达的CrylA蛋白来控制东方黏虫为害植物的方法。
【背景技术】
[0002]东方黏虫(Mythimna seperata)属鳞翅目夜蛾科,是一种主要以小麦、玉米、高粱、水稻等粮食作物和牧草为危害对象的杂食性、迁移性、间歇暴发性害虫，在我国除新疆地区尚未发生外，其他各地均有危害。东方黏虫喜食叶，三龄后能将整片叶咬食成缺刻状，或吃光心叶，形成无心苗。五至六龄达暴食期，能将幼苗地上部分全部吃光，或将整个植株叶片吃掉只留下叶脉，造成严重减产，甚至绝收；东方黏虫除喜食叶片外也可危害果穗。
[0003]玉米和水稻是中国重要的粮食作物，而近两年东方黏虫的危害呈暴发状态，2012年二代东方黏虫危害玉米面积达到6495万亩，2013年则危害玉米5800万亩，水稻亦受到较大危害，严重影响到当地人口的生存状况。为了防治东方黏虫，人们通常采用的主要防治方法有:农业防治、化学防治和生物防治。
[0004]农业防治是把整个农田生态系统多因素的综合协调管理，调控作物、害虫、环境因素、创造一个有利于作物生长而不利于东方黏虫发生的农田生态环境。如在成虫产卵盛期前选叶片完整、不霉烂的稻草8-10根扎成一小把，每亩30-50把，每隔5-7天更换一次(若草把经用药剂浸泡可减少换把次数)，可显著减少田间虫口密度；还可在幼虫发生期间放鸭啄食。因农业防治必须服从作物布局和增产的要求，应用有一定的局限性，不能作为应急措施，在东方黏虫爆发时就显得无能为力。
[0005]化学防治即农药防治，是利用化学杀虫剂来杀灭害虫，是东方黏虫综合治理的重要组成部分，它具有快速、方便、简单和高经济效益的特点，特别是东方黏虫大发生的情况下，是必不可少的应急措施。目前化学防治方法主要是药液喷雾。但化学防治也有其局限性，如使用不当往往会导致农作物发生药害、害虫产生抗药性，以及杀伤天敌、污染环境，使农田生态系统遭到破坏和农药残留对人、畜的安全构成威胁等不良后果。
[0006]物理防治主要根据害虫对环境条件中各种物理因素的反应，利用各种物理因素如光、电、色、温湿度等以及机械设备进行诱杀、辐射不育等方法来防治害虫。目前应用最广泛的是频振式杀虫灯诱杀，它利用害虫成虫的趋光性，近距离用光，远距离用波，引诱害虫靠近，对东方黏虫成虫的防治效果非常好；但是频振式杀虫灯需要每天及时清理高压电网上的污垢，否则会影响杀虫效果；并且在雷雨天不能开灯，在操作上还有电击伤人的危险；此外安装灯的一次性投入较大。
[0007]为了解决农业防治、化学防治和物理防治在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。CrylA杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是由苏云金芽孢杆菌库斯塔基亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki, B.t.k.)产生的不溶性伴抱结晶蛋白。
[0008]Cry IA蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性pH环境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏细胞膜内外的渗透压变化及pH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。
[0009]已证明转CrylA基因的植株可以抵抗玉米螟、棉铃虫、秋粘虫等鳞翅目(Lepidoptera)害虫的侵害,然而,罕有关于通过产生表达CrylA蛋白的转基因植株来控制东方黏虫对植物危害的报道。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种控制害虫的方法，首次提供了通过产生表达CrylA蛋白的转基因植株来控制东方黏虫对植物危害的方法，且有效克服现有技术农业防治、化学防治和物理防治等技术缺陷。
[0011]为实现上述目的，本发明提供了一种控制东方黏虫害虫的方法，包括将东方黏虫害虫与CrylA蛋白接触。
[0012]优选地,所述CrylA蛋白为CrylAb蛋白、CrylAc蛋白、CrylAh蛋白或CrylA.105蛋白。
[0013]进一步地,所述CrylAb蛋白存在于产生所述CrylAb蛋白的植物细胞中，所述东方黏虫害虫通过摄食所述植物细胞与所述CrylAb蛋白接触。
[0014]更进一步地,所述CrylAb蛋白存在于产生所述CrylAb蛋白的转基因植物中，所述东方黏虫害虫通过摄食所述转基因植物的组织与所述CrylAb蛋白接触，接触后所述东方黏虫害虫生长受到抑制并最终导致死亡，以实现对东方黏虫危害植物的控制。
[0015]进一步地,所述CrylA.105蛋白存在于产生所述CrylA.105蛋白的植物细胞中,所述东方黏虫害虫通过摄食所述植物细胞与所述CrylA.105蛋白接触。
[0016]更进一步地，所述CrylA.105蛋白存在于产生所述CrylA.105蛋白的转基因植物中，所述东方黏虫害虫通过摄食所述转基因植物的组织与所述CrylA.105蛋白接触，接触后所述东方黏虫害虫生长受到抑制并最终导致死亡，以实现对东方黏虫危害植物的控制。
[0017]所述转基因植物可以处于任意生育期。
[0018]所述转基因植物的组织可以为叶片、茎杆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝。
[0019]所述对东方黏虫危害植物的控制不因种植地点的改变而改变。
[0020]所述对东方黏虫危害植物的控制不因种植时间的改变而改变。
[0021]所述植物可以来自玉米、水稻、小麦、高粱、谷子、青稞或禾本科牧草。
[0022]所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述CrylA蛋白的多核苷酸的植物。[0023]优选地，所述CrylA蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2或SEQ IDN0:3所示的氨基酸序列。所述CrylA蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列。
[0024]在上述技术方案的基础上，所述植物还可以产生至少一种不同于所述CrylA蛋白的第二种核苷酸。
[0025]进一步地，所述第二种核苷酸可以编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。
[0026]优选地,所述第二种核苷酸可以编码CrylF蛋白、Vip3A蛋白或Cry2Ab蛋白。[0027]更进一步地，所述第二种核苷酸包括SEQ ID NO:7, SEQ ID N0:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
[0028]可选择地，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
[0029]为实现上述目的，本发明还提供了一种CrylA蛋白质控制东方黏虫害虫的用途。
[0030]在本发明中，CrylA蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物(第I亲本)可以通过遗传工程操作表达CrylA蛋白质，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质。通过第I亲本和第2亲本杂交获得表达引入第I亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。
[0031]RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。因此在本发明中可以使用RNAi技术特异性剔除或关闭目标昆虫害虫中特定基因的表达。
[0032]东方黏虫(Mythimnaseperata)与秋粘虫(Spodoptera frugiperda)同属鱗翅目夜蛾科，为杂食性害虫，但明显嗜好禾本科，最常为害玉米、水稻、高粱等。尽管如此，东方黏虫与秋粘虫(又称草地贪夜蛾)分属黏虫属和灰翅夜蛾属，在生物学上是清晰的、截然不同的两个物种，至少存在以下主要区别:
[0033]1、分布区域 不同。东方黏虫主要分布于亚洲和澳洲，目前已有27个国家和岛屿发生，在我国除新疆地区尚未发生外，其他各地均有危害。秋粘虫主要分布在境外，包括美洲的加拿大、墨西哥、美国、阿根廷、玻利维亚、巴西、智利、哥伦比亚、厄瓜多尔、法属圭亚那、圭亚那、巴拉圭、秘鲁、苏里南、乌拉圭、委内瑞拉及整个中美洲和加勒比海地区以及南纬36度左右以南的大部分地区，在中国未见有秋粘虫存在的报道。
[0034]2、为害习性不同。东方黏虫喜食叶,三龄后能将整片叶咬食成缺刻状,或吃光心叶，形成无心苗；五至六龄达暴食期，能将幼苗地上部分全部吃光，或将整个植株叶片吃掉只留下叶脉，造成严重减产，甚至绝收；东方黏虫也可危害果穗。而秋粘虫幼虫取食叶片可造成落叶，其后转移为害；有时大量幼虫以切根方式为害，切断种苗和幼小植株的茎；在大一些的作物上，如玉米穗，幼虫可钻入为害；取食玉米叶时，留有大量孔；低龄幼虫取食后，叶脉成窗纱状；老龄幼虫同切根虫一样，可将30日龄的幼苗沿基部切断；种群数量大时，幼虫如行军状，成群扩散；环境有利时，常留在杂草中。
[0035]3、形态特征不同。
[0036]I)卵形态不同:东方黏虫卵呈半球形，直径0.5mm,初产时乳白色,表面有网状脊纹，孵化前呈黄褐色至黑褐色；卵粒单层排列成行成块，常夹于叶鞘缝内或枯叶卷内，在水稻和谷子叶片尖端上产卵时常卷成卵棒。而秋粘虫卵半球形，卵块聚产在叶片表面，每卵块含卵100-300粒，有时成Z层，卵块表面有雌虫腹部灰色毛形成的带状保护层。
[0037]2)幼虫形态不同:东方黏虫老熟幼虫体长36_40mm，体色黄褐色至墨绿色；头红褐色，头盖有网文，额扁，头部有棕黑色“八”字纹；背中线白色较细，两边为黑细线，亚背线红褐色。而秋粘虫幼虫初孵时全身绿色，具黑线和斑点；生长时，仍保持绿色或成为浅黄色，并具黑色背中线和气门线；如密集时(种群密度大，食物短缺时)，末龄幼虫在迁移期几乎为黑色；老熟幼虫体长35-40_，在头部具黄色倒Y型斑，黑色背毛片着生原生刚毛(每节背中线两侧有2根刚毛)；腹部末节有呈正方形排列的4个黑斑；幼虫有6个龄期，偶为5个。
[0038]3)蛹形态不同:东方黏虫蛹呈红褐色，体长19_23mm，腹部第5、6、7节背面近前缘处有横列的马蹄形刻点，臀棘上有刺4根。而秋粘虫蛹棕色，有光泽，长18-20_。
[0039]4)成虫形态不同:东方黏虫成虫体色呈淡黄色或淡灰褐色，体长17_20mm，翅展35-45mm,触角丝状，前翅灰黄褐色、黄色或橙色，变化很多；内横线往往只现几个黑点，环纹与肾纹褐黄色，界限不显著，肾纹后端有一个白点，其两侧各有一个黑点；外横线为一列黑点；亚缘线自顶角内斜至M2 (第2中脉)；缘线为一列黑点；后翅暗褐色，向基部色渐淡。而秋粘虫成虫粗壮，灰棕色，翅展32-38_ ;雌虫前翅灰色至灰棕色，但雄虫前翅更黑，具黑斑和浅色暗纹；后翅白色，后翅翅脉棕色并透明；雄虫前翅浅色圆形，翅痣呈明显的灰色尾状突起；微虫外生殖器抱握瓣正方形，抱器末端地抱器缘刻缺；雌虫交配囊无交配片。
[0040]4、生长习性和发生规律不同。东方黏虫是典型的迁飞性害虫，每年3月份至8月中旬顺气流由南往偏北方向迁飞，8月下旬至9月份又随偏北气流南迁；国内由南到北每年依次发生8-2代；在我国东半部，北纬27度以南1年发生6-8代，以秋季危害晚稻世代和冬季危害小麦世代发生较多；北纬27-33度地区1年发生5-6代，以秋季危害晚稻世代发生较多；北纬33-36度地区I年发生4-5代，以春季危害小麦世代发生较多；北纬36-39度地区1年发生3-4代，以秋季世代发生较多，危害麦、玉米、粟、稻等；北纬39度以北I年发生2-3代，以夏季世代发生较多，危害麦、粟、玉米、高粱及牧草等；在I月等温线0°C(北纬33度以北地区)不能越冬，每年由南方迁入；1月等温线0-8°C (北纬33-27度北半部)多以幼虫或蛹在稻茬、稻田埂、稻草堆、菰丛、莲台、杂草等处越冬，南半部多以幼虫在麦田杂草地越冬，但数量较少；1月等温线8°C (约北纬27度以南)可终年繁殖，主要在小麦田越冬危害。而秋粘虫成虫可以迁飞，能自行扩散相当距离，蔬菜或水果夹带幼虫是重要的国际间传播方式。
[0041]综合上述，可确定东方黏虫与秋粘虫是两种害虫，且亲缘关系较远，无法交配产生后代。
[0042]本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。
[0043]本发明中所述的“接触”，是指昆虫和/或害虫触碰、停留和/或取食植物、植物器官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达杀虫蛋白，还可以是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或具有广生杀虫蛋白的微生物。
[0044]本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。
[0045]本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了 DNA的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将DNA的一条链转录为一条mRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mRNA实际上是从DNA的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子(密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸)，其可作为开放阅读框(ORF)阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的DNA有相当功能的RNA和PNA (肽核酸)。
[0046]本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明CrylA基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明CrylA基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。
[0047]本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45°C条件下用6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理，然后在50°C条件下用
2.0XSSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0父55(:、501:到高度严格条件的约0.2\55(:、501:。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22°C，升高到高度严格条件的约65°C。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6XSSC、0.5%SDS溶液中，在65°C下与SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO: 6发生特异性杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC、0.1%SDS各洗膜I次。
[0048]因此，具有抗虫活性并在严格条件下与本发明SEQ ID NO:4、SEQ ID N0:5或SEQID N0:6杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40%-50%同源，大约 60%、65% 或 70% 同源，甚至`至少大约 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%,99%或更大的序列同源性。
[0049]本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的杀虫活性特征的部分和/片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有杀虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗东方黏虫害虫的生物活性的蛋白。
[0050]本发明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)蛋白质为昆虫毒素。
[0051]使用标准技术可以修饰基因和容易的构建基因变异体。例如，本领域熟知制造点突变的技术。又例如美国专利号5605793描述了在随机断裂后使用DNA重装配产生其它分子多样性的方法。可以使用商业化核酸内切酶制造全长基因的片段，并且可以按照标准程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶诸如Bal31或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。还可以使用多种限制性内切酶获取编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶直接获得这些毒素的活性片段。
[0052]本发明可以从B.t.分离物和/或DNA文库衍生出等价蛋白和/或编码这些等价蛋白的基因。有多种方法获取本发明的杀虫蛋白。例如，可以使用本发明公开和要求保护的杀虫蛋白的抗体从蛋白质混合物鉴定和分离其它蛋白。特别地，抗体可能是由蛋白最恒定和与其它B.t.蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通过免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)或western印迹方法使用这些抗体专一地鉴定有特征活性的等价蛋白。可使用本领域标准程序容易的制备本发明中公开的蛋白或等价蛋白或这类蛋白的片段的抗体。然后可以从微生物中获得编码这些蛋白的基因。
[0053]由于遗传密码子的丰余性，多种不同的DNA序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的DNA序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响杀虫活性的序列，亦包括保留杀虫活性的片段。
[0054]本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为:小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。
[0055]保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代:碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如 谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hi 11在1979年纽约学术出版社(Academic Press)出版的《Protein》中进行了描述。最常见的互换有Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它们相反的互换。
[0056]对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(如参见，Cunningham 和 Wells, 1989, Science244: 1081-1085)。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的抗虫活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定(参见，如de Vos等，1992，Science255:306-312 ;Smith 等，1992，J.Mol.Biol224:899-904 ；fflodaver 等，1992，FEBSLetters309:59_64)。
[0057]在本发明中，CrylA蛋白包括但不限于CrylAb、CrylA.105或CrylAh蛋白，或者与上述蛋白的氨基酸序列具有至少70%同源性且对东方黏虫具有杀虫活性的杀虫片段或功能区域。
[0058]因此，与序列1、2和/或3所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于60%，优选的大于75%，更优选的大于80%，甚至更优选的大于90%，并且可以大于95%。也可以根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的相同性和 / 或类似性。
[0059]本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子，增强子，前导序列，内含子以及其它可操作地连接到所述CrylA蛋白、Vip3A蛋白和其它Cry类蛋白的调节序列。
[0060]所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、玉米Ubi启动子、水稻G0S2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)，如PEP羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(Pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。
[0061]所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。
[0062]所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列，如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV (玉米矮缩花叶病毒)前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(BiP);苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列(AMV RNA4);烟草花叶病毒(TMV)前导序列。
[0063]所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)增强子、玄参花叶病毒(FMV)增强子、康乃馨风化环病毒(CERV)增强子、木薯脉花叶病毒(CsVMV)增强子、紫茉莉花叶病毒(MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)和花生褪绿线条花叶病毒(PCLSV)增强子。
[0064]对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Actl内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，CAT-1内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和“超级泛素”内含子。
[0065]所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。
[0066]本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示:启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于:提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。
[0067]本发明中所述的“杀虫”是指对农作物害虫是有毒的。更具体地，目标昆虫是东方黏虫害虫。
[0068]本发明中CrylA蛋白对东方黏虫害虫具有毒性。本发明中的植物，特别是高粱和玉米，在其基因组中含有外源DNA，所述外源DNA包含编码CryIA蛋白的核苷酸序列，东方黏虫害虫通过摄食植物组织与该蛋白接触，接触后东方黏虫害虫生长受到抑制并最终导致死亡。抑制是指致死或亚致死。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，该植物可基本消除对化学或生物杀虫剂的需要(所述化学或生物杀虫剂为针对CrylA蛋白所靶向的东方黏虫害虫的杀虫剂)。
[0069]植物材料中杀虫晶体蛋白(ICP)的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码杀虫蛋白质的mRNA进行定量，或直接特异性检测产生的杀虫蛋白质的量。
[0070]可以应用不同的试验测定植物中ICP的杀虫效果。本发明中目标昆虫主要为东方黏虫。
[0071]本发明中，所述CrylA蛋白可以具有序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。除了包含CrylA蛋白的编码区外，也可包含其他元件，例如编码选择性标记的蛋白质。
[0072]此外，包含编码本发明CrylA蛋白的核苷酸序列的表达盒在植物中还可以与至少一种编码除草剂抗性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敌草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、对除草剂茅草枯的抗性基因、对氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制剂(如PPT)的抗性基因，从而获得既具有高杀虫活性、又具有除草剂抗性的转基因植物。[0073]本发明中，将外源DNA导入植物，如将编码所述CrylA蛋白的基因或表达盒或重组载体导入植物细胞，常规的转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。
[0074]本发明提供了一种控制害虫的方法，具有以下优点:
[0075]1、内因防治。现有技术主要是通过外部作用即外因来控制东方黏虫害虫的危害，如农业防治、化学防治和物理防治；而本发明是通过植物体内产生能够杀死东方黏虫的CrylA蛋白来控制东方黏虫害虫的，即通过内因来防治。
[0076]2、无污染、无残留。现有技术使用的化学防治方法虽然对控制东方黏虫害虫的危害起到了一定作用，但同时也对人、畜和农田生态系统带来了污染、破坏和残留；使用本发明控制东方黏虫害虫的方法，可以消除上述不良后果。
[0077]3、全生育期防治。现有技术使用的控制东方黏虫害虫的方法都是阶段性的，而本发明是对植物进行全生育期的保护，转基因植物(CrylA蛋白)从发芽、生长，一直到开花、结果，都可以避免遭受东方黏虫的侵害。
[0078]4、全植株防治。现有技术使用的控制东方黏虫害虫的方法大多是局部性的，如叶面喷施；而本发明是对整个植株进行保护，如转基因植物(CrylA蛋白)的叶片、茎杆、雄穗、雌穗、花药、花丝等都是可以抵抗东方黏虫侵害的。[0079]5、效果稳定。现有技术使用的频振式杀虫灯不仅需要每天及时清理高压电网的污垢，而且在雷雨天不能使用；本发明是使所述CrylA蛋白在植物体内进行表达，有效地克服了频振式杀虫灯的效果受外界因素影响的缺陷，且本发明转基因植物(CrylA蛋白)的防治效果在不同地点、不同时间、不同遗传背景也都是稳定一致的。
[0080]6、简单、方便、经济。现有技术使用的频振式杀虫灯的一次性投入较大，且操作不当还有电击伤人的危险；本发明只需种植能够表达CrylA蛋白的转基因植物即可，而不需要采用其它措施，从而节省了大量人力、物力和财力。
[0081]7、效果彻底。现有技术使用的控制东方黏虫害虫的方法，其效果是不彻底的，只起到减轻作用；而本发明转基因植物(CrylA蛋白)可以造成初孵东方黏虫幼虫的大量死亡，且对小部分存活幼虫发育进度造成极大的抑制，3天后幼虫基本仍处于初孵状态，都是明显的发育不良，且已停止发育，而转基因植物大体上只受到轻微损伤。
[0082]下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
【专利附图】
【附图说明】
[0083]图1为本发明控制害虫的方法的含有CrylAb-Ol核苷酸序列的重组克隆载体DBNOl-T构建流程图；
[0084]图2为本发明控制害虫的方法的含有CrylAb-Ol核苷酸序列的重组表达载体DBN100124构建流程图；
[0085]图3为本发明控制害虫的方法的转基因玉米植株接种东方黏虫的叶片损伤图；
[0086]图4为本发明控制害虫的方法的转基因水稻植株接种东方黏虫的叶片损伤图。
【具体实施方式】
[0087]下面通过具体实施例进一步说明本发明控制害虫的方法的技术方案。[0088]第一实施例、CrylA基因的获得和合成
[0089]1、获得CrylA核苷酸序列
[0090]CrylAb-Ol杀虫蛋白质的氨基酸序列(818个氨基酸)，如序列表中SEQ IDN0:1所示；编码相应于所述CrylAb-Ol杀虫蛋白质的氨基酸序列(818个氨基酸)的CrylAb-Ol核苷酸序列(2457个核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:4所示。CrylAb_02杀虫蛋白质的氨基酸序列(615个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO: 2所示；编码相应于所述CrylAb-02杀虫蛋白质的氨基酸序列(615个氨基酸)的CrylAb-02核苷酸序列(1848个核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO:5 所示。
[0091]CrylA.105杀虫蛋白质的氨基酸序列(1177个氨基酸)，如序列表中SEQ ID N0:3所示；编码相应于所述CrylA.105杀虫蛋白质的氨基酸序列(1177个氨基酸)的CrylA.105核苷酸序列(3534个核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:6所示。
[0092]2、获得Vip类核苷酸序列
[0093]编码Vip3Aa杀虫蛋白质的氨基酸序列(789个氨基酸)的Vip3Aa核苷酸序列(2370个核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:7所示。
[0094]3、获得Cry类核苷酸序列
[0095]编码CrylFa杀虫蛋白质的氨基酸序列(605个氨基酸)的CrylFa核苷酸序列(1818个核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:8所示；编码Cry2Ab杀虫蛋白质的氨基酸序列(634个氨基酸)的Cry2Ab核苷酸序列(1905个核苷酸)，如序列表中SEQ ID NO: 9所示。
[0096]4、合成上述核苷`酸序列
[0097]所述CrylAb-Ol核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:4所示)、所述CrylAb-02核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 5所示)、所述CrylA.105核苷酸序列(如序列表中SEQ IDN0:6所示)、所述Vip3Aa核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 7所示)、所述CrylFa核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:8所示)和所述Cry2Ab核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:9所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成的所述CrylAb-Ol核苷酸序列(SEQ IDNO:4)的5’端还连接有NcoI酶切位点，所述CrylAb-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的3’端还连接有SpeI酶切位点；合成的所述CrylAb-02核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)的5’端还连接有NcoI酶切位点，所述CrylAb-02核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)的3’端还连接有SpeI酶切位点；合成的所述CrylA.105核苷酸序列(SEQ ID N0:6)的5’端还连接有NcoI酶切位点，所述CrylA.105核苷酸序列(SEQ ID N0:6)的3，端还连接有HindIII酶切位点；合成的所述Vip3Aa核苷酸序列(SEQ ID N0:7)的5’端还连接有ScaI酶切位点，所述Vip3Aa核苷酸序列(SEQ ID NO: 7)的3’端还连接有SpeI酶切位点；合成的所述CrylFa核苷酸序列(SEQ ID NO:8)的5’端还连接有AscI酶切位点，所述CryIFa核苷酸序列(SEQ ID NO:8)的3’端还连接有BamHI酶切位点；合成的所述Cry2Ab核苷酸序列(SEQ ID NO:9)的5’端还连接有NcoI酶切位点，所述Cry2Ab核苷酸序列(SEQ ID N0:9)的3’端还连接有SpeI酶切位点。
[0098]第二实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌
[0099]1、构建含有CrylA基因的重组克隆载体
[0100]将合成的CrylAb-Ol核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT:A3600)上，操作步骤按Promega公司产品pGEM_T载体说明书进行，得到重组克隆载体DBN01-T，其构建流程如图1所示(其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；fl表示噬菌体fl的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；CryIAb-OI为CrylAb-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO:4) ；MCS为多克隆位点)。
[0101]然后将重组克隆载体DBNOl-T用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501 )，其热激条件为:50 μ 1大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ 1质粒DNA(重组克隆载体DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C振荡培养I小时(IOOrpm转速下摇床摇动)，在表面涂有IPTG(异丙基硫代-β -D-半乳糖苷)和X-gal(5_溴-4-氯-3- 吲哚-β -D-半乳糖苷)的氨苄青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5)上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒:将菌液在12000rpm转速下离心Imin,去上清液,沉淀菌体用100 μ 1冰预冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)悬浮；加入150μ I新配制的溶液II (0.2Μ NaOH,1%SDS(十二烷基硫酸钠))，将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ 1冰冷的溶液III (4Μ醋酸钾，2Μ醋酸)，立即充分混匀，冰上放置5-10min ;于温度4°C、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min ;于温度4V、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度(V/V)为70%的乙醇洗涤后晾干；加入 30μ 1 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (1OmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于温度37°C下水浴30min，消化RNA ;于温度_20°C保存备用。
[0102]提取的质粒经KpnI和BglI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01-T中插入的所述CrylAb-Ol核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列，即CrylAb-Ol核苷酸序列正确插入。
[0103]按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将合成的所述CrylAb-02核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体DBN02-T，其中，CrylAb-02为CrylAb_02核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。酶切和测序验证重组克隆载体DBN02-T中所述CrylAb-02核苷酸序列正确插入。
[0104]按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将合成的所述CrylA.105核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体DBN03-T，其中，CrylA.105为CrylA.105核苷酸序列(SEQ ID N0:6)。酶切和测序验证重组克隆载体DBN03-T中所述CrylA.105核苷酸序列正确插入。
[0105]按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将合成的所述Vip3Aa核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T上，得到重组克隆载体DBN04-T，其中，Vip3Aa为Vip3Aa核苷酸序列(SEQ ID N0:7)。酶切和测序验证重组克隆载体DBN04-T中所述Vip3Aa核苷酸序列正确插入。
[0106]按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将合成的所述CrylFa核苷酸序列连入克隆载体PGEM-T上，得到重组克隆载体DBN05-T，其中，CrylFa为CrylFa核苷酸序列(SEQ ID N0:8)。酶切和测序验证重组克隆载体DBN05-T中所述CrylFa核苷酸序列正确插入。
[0107]按照上述构建重组克隆载体DBN01-T的方法，将合成的所述Cry2Ab核苷酸序列连入克隆载体PGEM-T上，得到重组克隆载体DBN06-T，其中，Cry2Ab为Cry2Ab核苷酸序列(SEQ ID N0:9)。酶切和测序验证重组克隆载体DBN06-T中所述Cry2Ab核苷酸序列正确插入。
[0108]2、构建含有CrylA基因的重组表达载体
[0109]用限制性内切酶NcoI和SpeI分别酶切重组克隆载体DBNOl-T和表达载体DBNBC-Ol (载体骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA机构可以提供))，将切下的CrylAb-Ol核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-Ol的NcoI和SpeI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100124，其构建流程如图2所示(Kan:卡那霉素基因;RB:右边界;Ub1:玉米Ubiquitin (泛素)基因启动子(SEQ ID NO: 10)；CrylAb-Ol:CryIAb-Ol核苷酸序列(SEQ ID N0:4) ;Nos:胭脂碱合成酶基因的终止子(SEQID NO: 11) ；PM1:磷酸甘露糖异构酶基因(SEQ ID NO: 12) ;LB:左边界)。[0110]将重组表达载体DBN100124用热激方法转化大肠杆菌Tl感受态细胞，其热激条件为:50μ I大肠杆菌Tl感受态细胞、10 μ I质粒DNA (重组表达载体DBN100124)，42 °C振荡培养30秒；37°C水浴I小时(IOOrpm转速下摇床摇动)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固体平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaC110g/L,琼脂15g/L,用NaOH调pH至7.5)上于温度37°C条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5)中于温度37°C条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶NcoI和SpeI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100124在NcoI和SpeI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID N0:4所示核苷酸序列，即CrylAb-Ol核苷酸序列。
[0111]按照上述构建重组表达载体DBN100124的方法，将NcoI和SpeI酶切重组克隆载体DBN02-T切下的所述CrylAb-02核苷酸序列插入表达载体DBNBC-Ol，得到重组表达载体DBN100053。酶切和测序验证重组表达载体DBN100053中的核苷酸序列含有为序列表中SEQID NO:5所示核苷酸序列，即CrylAb-02核苷酸序列，所述CrylAb-02核苷酸序列可以连接所述Ubi启动子和Nos终止子。
[0112]按照上述构建重组表达载体DBN100124的方法，将NcoI和Spe1、ScaI和SpeI分别酶切重组克隆载体DBNOl-T和DBN04-T切下的所述CrylAb-Ol核苷酸序列和Vip3Aa核苷酸序列插入表达载体DBNBC-Ol，得到重组表达载体DBN100003。酶切和测序验证重组表达载体DBN100003中的核苷酸序列含有为序列表中SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:7所示核苷酸序列，即CrylAb-Ol核苷酸序列和Vip3Aa核苷酸序列，所述CrylAb-Ol核苷酸序列和所述Vip3Aa核苷酸序列可以连接所述Ubi启动子和Nos终止子。
[0113]按照上述构建重组表达载体DBN100124的方法，将NcoI和Spe1、AscI和BamHI分别酶切重组克隆载体DBN02-T和DBN05-T切下的所述CrylAb-02核苷酸序列和CrylFa核苷酸序列插入表达载体DBNBC-Ol，得到重组表达载体DBN100075。酶切和测序验证重组表达载体DBN100075中的核苷酸序列含有为序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:8所示核苷酸序列，即CrylAb-02核苷酸序列和CrylFa核苷酸序列，所述CrylAb-02核苷酸序列和所述CrylFa核苷酸序列可以连接所述Ubi启动子和Nos终止子。
[0114]按照上述构建重组表达载体DBN100124的方法，将NcoI和HindIII酶切重组克隆载体DBN03-T切下的所述CrylA.105核苷酸序列插入表达载体DBNBC-Ol，得到重组表达载体DBN100029。酶切和测序验证重组表达载体DBN100029中的核苷酸序列含有为序列表中SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，即CrylA.105核苷酸序列，所述CrylA.105核苷酸序列可以连接所述Ubi启动子和Nos终止子。
[0115]按照上述构建重组表达载体DBN100124的方法，将NcoI和HindII1、NcoI和SpeI分别酶切重组克隆载体DBN03-T和DBN06-T切下的所述CrylA.105核苷酸序列和Cry2Ab核苷酸序列插入表达载体DBNBC-Ol，得到重组表达载体DBN100076。酶切和测序验证重组表达载体DBN100076中的核苷酸序列含有为序列表中SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:9所示核苷酸序列，即CrylA.105核苷酸序列和Cry2Ab核苷酸序列，所述CrylA.105核苷酸序列和所述Cry2Ab核苷酸序列可以连接所述Ubi启动子和Nos终止子。
[0116]3、重组表达载体转化农杆菌
[0117]对己经构建正确的重组表达载体DBN100124、DBN100053、DBN100003、DBN100075、DBN100029 和 DBN100076 用液氮法转化到农杆菌 LBA4404 (Invitrgen, Chicago, USA, CAT:18313-015)中，其转化条件为:100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA (重组表达载体)；置于液氮中10分钟，37°C温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28°C、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶AhdI和StyI对重组表达载体DBN100124和DBN100075，用限制性内切酶AhdI和XhoI对重组表达载体DBN100053和DBN100003，用限制性内切酶StyI和XhoI对重组表达载体DBN100029和DBN100076酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体 DBN100124、DBN100053、DBN100003、DBN100075、DBN100029 和 DBN100076 结构完全正确。
[0118]第三实施例、转入CrylA基因的玉米植株的获得及验证
[0119]1、获得转入CrylA基因的玉米植株
[0120]按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31 (Z31)的幼胚与第二实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2构建的重组表达载体DBN100124、DBN100053、DBN100003、DBN100075、DBN100029 和 DBN100076 中的 T-DNA (包括玉米Ubiquitin基因的启动子序列、CrylAb-Ol核苷酸序列、CrylAb-02核苷酸序列、CrylA.105核苷酸序列、Vip3Aa核苷酸序列、CrylFa核苷酸序列、Cry2Ab核苷酸序列、PMI基因和Nos终止子序列)转入到玉米染色体组中，获得了转入CrylAb-Ol核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb-02核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb-01_Vip3Aa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb-02-CrylFa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylA.105核苷酸序列的玉米植株和转入CrylA.105_Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株；同时以野生型玉米植株作为对照。
[0121]对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将CrylAb-Ol核苷酸序列、CrylAb-02核苷酸序列、CrylAb-01_Vip3Aa核苷酸序列、CrylAb-02-CrylFa核苷酸序列、CrylA.105核苷酸序列和/或CrylA.105_Cry2Ab核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1:侵染步骤),在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(OD66tl=0.4-0.6，侵染培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、鹿糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2, 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L，pH5.3))中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2:共培养步骤)。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、鹿糖 20g/L、葡萄糖 10g/L、乙酰丁香酮(AS) 100mg/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)lmg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、琼脂8g/L,pH5.8)中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3:恢复步骤)。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂(甘露糖)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4:选择步骤)。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物(步骤5:再生步骤)，优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。
[0122]筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、琼脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上，25°C下培养至约IOcm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28°C下培养16小时，再于20°C下培养8小时。
[0123]2、用TaqMan验证转入CrylA基因的玉米植株
[0124]分别取转入CrylAb-Ol核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb-02核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb_01_Vip3Aa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb_02_CrylFa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylA.105核苷酸序列的玉米植株和转入CrylA.105_Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株的叶片约IOOmg作为样品,用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测CrylA基因、CrylFa基因、Vip3Aa基因和Cry2Ab基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。
[0125]检测CrylA基因、CrylFa基因、Vip3Aa基因和Cry2Ab基因拷贝数的具体方法如下:
[0126]步骤11、分别取转入CrylAb-Ol核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb-02核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb_01_Vip3Aa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb_02_CrylFa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb-02-CrylFa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylA.105核苷酸序列的玉米植株、转入CrylA.105_Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各lOOmg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；
[0127]步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA,具体方法参考其产品说明书；
[0128]步骤13、用NanoDrop2000 (Thermo Scientific)测定上述样品的基因组DNA浓度；
[0129]步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80_100ng/μ I ；
[0130]步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是:
[0131]以下引物和探针用来检测CrylAb-Ol核苷酸序列:
[0132]引物I (CFl):CGAACTACGACTCCCGCAC 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；
[0133]引物2 (CRl):GTAGATTTCGCGGGTCAGTTG 如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示；
[0134]探针I (CPl):CTACCCGATCCGCACCGTGTCC 如序列表中 SEQ ID NO: 15 所示；
[0135]以下引物和探针用来检测CrylAb-02核苷酸序列:
[0136]引物3 (CF2):TGCGTATTCAATTCAACGACATG 如序列表中 SEQ ID NO: 16 所示；
[0137]引物4 (CR2):CTTGGTAGTTCTGGACTGCGAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 17 所示；
[0138]探针2 (CP2):CAGCGCCTTGACCACAGCTATCCC 如序列表中 SEQ ID NO: 18 所示；
[0139]以下引物和探针用来检测Vip3Aa核苷酸序列:
[0140]引物5 (VFl):ATTCTCGAAATCTCCCCTAGCG 如序列表中 SEQ ID NO: 19 所示；
[0141]引物6 (VRl):GCTGCCAGTGGATGTCCAG 如序列表中 SEQ ID NO: 20 所示；
[0142]探针3 (VPl):CTCCTGAGCCCCGAGCTGATTAACACC 如序列表中 SEQ ID NO:21 所示；
[0143]以下引物和探针用来检测CrylFa核苷酸序列:
[0144]引物7 (CF3):CAGTCAGGAACTACAGTTGTAAGAGGG 如序列表中 SEQ ID NO: 22 所示；
[0145]引物8 (CR3):ACGCGAATGGTCCTCCACTAG 如序列表中 SEQ ID NO: 23 所示；
[0146]探针4 (CP3):CGTCGAAGAATGTCTCCTCCCGTGAAC 如序列表中 SEQ ID NO: 24 所示；
[0147]以下引物和探针用来检测CrylA.105核苷酸序列:
[0148]引物9 (CF4):GCGCATCCAGTTCAACGAC 如序列表中 SEQ ID NO: 25 所示；
[0149]引物10 (CR4):GTTCTGGACGGCGAAGAGTG 如序列表中 SEQ ID NO: 26 所示；
[0150]探针5 (CP4):TGAACAGCGCCCTGACCACCG 如序列表中 SEQ ID NO: 27 所示；
[0151]以下引物和探针用来检测Cry2Ab核苷酸序列:
[0152]引物11 (CF5):CTGATACCCTTGCTCGCGTC 如序列表中 SEQ ID NO: 28 所示；
[0153]引物12 (CR5):CACTTGGCGGTTGAACTCCTC 如序列表中 SEQ ID NO: 29 所示；
[0154]探针6 (CP4):CGCTGAGCTGACGGGTCTGCAAG 如序列表中 SEQ ID NO: 30 所示；
[0155]PCR反应体系为:
[0156]JumpStart? Taq ReadyMix? (Sigma)10 μ I
[0157]50 X引物/探针混合物I μ I
[0158]基因组DNA3μ I
[0159]水(ddH20)6μ I
[0160]所述50Χ引物/探针混合物包含ImM浓度的每种引物各45 μ 1，100 μ M浓度的探针50μI和860μ I I X TE缓冲液，并且在4°C，贮藏在琥珀试管中。
[0161]PCR反应条件为:
[0162]步骤 温度时间
[0163]2195 0C5 分钟
[0164]2295 0C30 秒
[0165]2360 0CI 分钟
[0166]24回到步骤22，重复40次[0167]利用SDS2.3 软件(Applied Biosystems)分析数据。
[0168]实验结果表明，CrylAb-Ol核苷酸序列、CrylAb-02核苷酸序列、CrylAb_01_Vp3Aa核苷酸序列、CrylAb-02-CrylFa核苷酸序列、CrylA.105核苷酸序列和CrylA.105_Cry2Ab核苷酸序列均己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入CrylAb-Ol核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb-02核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb-01_Vip3Aa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb-02-CrylFa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylA.105核苷酸序列的玉米植株和转入CrylA.105_Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株均获得了含有单拷贝CrylA基因、CrylFa基因、Vip3Aa基因和/或Cry2Ab基因的转基因玉米植株。
[0169]第四实施例、转基因玉米植株的抗虫效果检测
[0170]将转入CrylAb-Ol核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb-02核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb_01_Vip3Aa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb_02_CrylFa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylA.105核苷酸序列的玉米植株、转入CrylA.105_Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株对东方黏虫进行抗虫效果检测。`
[0171]分别取转入CrylAb-Ol核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb-02核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb_01_Vip3Aa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylAb_02_CrylFa核苷酸序列的玉米植株、转入CrylA.105核苷酸序列的玉米植株、转入CrylA.105_Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株(V3-V4期)的新鲜叶片(心叶)，用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将玉米叶片去除叶脉，同时剪成约IcmX4cm的长条状，取3片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部的滤纸上，所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头人工饲养的东方黏虫(初孵幼虫)，虫试培养皿加盖后放入底部放有湿纱布的方盒中，在温度25-28°C、相对湿度70%-80%、光周期(光/暗)16:8的条件下放置3天后，统计东方黏虫幼虫的死亡情况和叶片损伤情况，计算各样品中东方黏虫的平均死亡率。转入CryIAb-OI核苷酸序列的共3个株系(S1、S2和S3)，转入CrylAb-02核苷酸序列的共3个株系(S4、S5和S6)，转入CrylAb-01_Vip3Aa核苷酸序列的共3个株系(S7、S8和S9)，转入CrylAb-02-CrylFa核苷酸序列的共3个株系(S10、Sll和S12)，转入CrylA.105核苷酸序列的共3个株系(S13、S14和S15)，转入CrylA.105-Cry2Ab核苷酸序列的共3个株系(S16、S17和S18)，经Taqman鉴定为非转基因的(NGM1)共I个株系,野生型的(CKl)共I个株系；从每个株系选5株进行测试，每株重复6次。结果如表1和图3所示。
[0172]表1、转基因玉米植株接种东方黏虫的抗虫实验结果
[0173]
【权利要求】
1.一种控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，包括将东方黏虫害虫与CrylA蛋白接触。
2.根据权利要求1所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述CrylA蛋白为CrylAb 蛋白、CrylAc 蛋白、CrylAh 蛋白或 CrylA.105 蛋白。
3.根据权利要求2所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述CrylAb蛋白存在于产生所述CrylAb蛋白的植物细胞中，所述东方黏虫害虫通过摄食所述植物细胞与所述CrylAb蛋白接触。
4.根据权利要求3所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述CrylAb蛋白存在于产生所述CrylAb蛋白的转基因植物中，所述东方黏虫害虫通过摄食所述转基因植物的组织与所述CrylAb蛋白接触，接触后所述东方黏虫害虫生长受到抑制并最终导致死亡，以实现对东方黏虫危害植物的控制。
5.根据权利要求2所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述CrylA.105蛋白存在于产生所述CrylA.105蛋白的植物细胞中，所述东方黏虫害虫通过摄食所述植物细胞与所述CrylA.105蛋白接触。
6.根据权利要求5所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述CrylA.105蛋白存在于产生所述CrylA.105蛋白的转基因植物中，所述东方黏虫害虫通过摄食所述转基因植物的组织与所述CrylA.105蛋白接触，接触后所述东方黏虫害虫生长受到抑制并最终导致死亡，以实现对东方黏虫危害植物的控制。
7.根据权利要求4或6所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述转基因植物可以处于任意生育期。
8.根据权利要求4或6所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述转基因植物的组织可以为叶片、茎杆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝。
9.根据权利要求4或6所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述对东方黏虫危害植物的控制不因种植地点的改变而改变。
10.根据权利要求4或6所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述对东方黏虫危害植物的控制不因种植时间的改变而改变。
11.根据权利要求3至10任一项所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述植物可以来自玉米、小麦、高粱、谷子、青稞或禾本科牧草。
12.根据权利要求1至11任一项所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述CrylA蛋白的多核苷酸的植物。
13.根据权利要求1至12任一项所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述CrylA蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述CrylA蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
15.根据权利要求3至14任一项所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述植物还可以产生至少一种不同于所述CrylA蛋白的第二种核苷酸。
16.根据权利要求15所述的控制东方黏虫害虫的方法,其特征在于,所述第二种核苷酸可以编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α _淀粉酶或过氧化物酶。
17.根据权利要求16所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸可以编码CrylF蛋白、Vip3A蛋白或Cry2Ab蛋白。
18.根据权利要求17所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸包括SEQ ID NO:7, SEQ ID N0:8或SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
19.根据权利要求15所述的控制东方黏虫害虫的方法，其特征在于，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
20.一种CrylA蛋白质控制东方黏虫害虫的用途。
【文档编号】C12N15/84GK103688974SQ201310681139
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】李胜兵, 王利君, 刘敬, 庞洁, 韩超, 岳昌锋 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心