一种溶栓豆豉的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种溶栓豆豉的制备方法，包括菌种活化，毛霉种子液的制备，纳豆菌种子液的制备，黄豆的处理，接种，培养，后熟等步骤。本发明以毛霉和纳豆菌产蛋白酶以及纳豆菌产纤溶酶作为评价指标的情况，接种纳豆菌后毛霉生长良好，对蛋白酶含量影响不大，获得的豆豉中纳豆激酶活力达到823.51U/g，蛋白酶活力达到1983.91U/g。本发明寻找到豆豉发酵的最佳条件，在不影响豆豉风味的同时，大大缩短了传统豆豉发酵工艺所需的时间。同时在操作过程中，条件控制方便，有利于生产化操作；本发明在不额外增加任何设备的情况下，仅利用豆豉的原始生产线就能完成纳豆菌和毛霉的对黄豆的共发酵，大大的节省了生产成本。
【专利说明】一种溶栓豆豉的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于健康食品制造领域，涉及一种豆豉的制备方法，特别涉及一种溶栓豆豉的制备方法。
【背景技术】
[0002]豆豉(Fermented soya beans)古代称为幽菽,始创于中国，系大豆浸泡蒸煮后，经幽闭发酵而成的，味甘咸，无毒，香气浓郁，滋味鲜美既可用于烹饪，也可代菜佐餐，富含蛋白质和人体所需氨基酸，不仅营养价值高，而且还有开胃助食，解表祛汗，除烦平喘、祛风散寒之功效。豆豉作为大众消费的豆制品，且在中医药学上是一味中药，日益引起国内外消费者及食品、医学甚至工业界的广泛关注。
[0003]我国的豆豉按使用的微生物不同，可分为三大类:传统毛霉型发酵豆豉、米曲霉发酵豆豉及细菌型发酵豆豉。在目前广泛食用的豆豉，常用毛霉进行发酵。毛霉的酶系丰富，水解蛋白质无苦味，且无毒无害，不产生怪味和异色等。
[0004]纳豆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，为革兰氏阳性菌，好氧，有芽孢，极易成链，自身没有致病性，只具有单层细胞外膜，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。在极端的条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源胞子。纳豆菌在发酵过程中还产生很多其他物质如维生素K、蛋白酶、氨基酸及多种消化酶促生长因子等并参与机体的生长代谢等等，这些物质均有利于人体健康。此外，纳豆菌本身作为一种益生菌对调理人体肠道也有很好的作用。
[0005]目前我国的豆制品大都采用单菌发酵或传统自然发酵，存在酶系不全，风味单一，杂菌较多，产物不确定等问题。传统的纳豆菌其发酵产物纳豆激酶虽然有预防心脑血管疾病的作用，但是有氨臭味及黏丝，国人很难接受其风味，让人敬而远之，而毛霉能产生出一些烃、醇、酯、酸等芳香物质。这意味着如果将二者结合，找到混合发酵的最佳条件，其发酵产品风味更好，同时还能预防高血压、抗肿瘤、抗氧化、降低胆固醇、血压、血粘度等作用，达到治疗心脑血管疾病的效果。目前，利用毛霉和纳豆菌混合发酵豆豉的技术尚未见报道。采用此法制备的豆豉，经后熟发酵，可用于生产不同口味的具有溶栓功能的豆豉产品。
【发明内容】
[0006]为解决上述现有技术的不足，本发明提出一种溶栓豆豉的制备方法，该方法在豆豉发酵中接入毛霉和纳豆菌HT8，毛霉产生的蛋白酶和纤维素酶对蒸煮后的黄豆的营养物质的分解有助于纳豆菌的利用，能产生更多的纳豆激酶。同时毛霉发酵的产物无毒、无害，不产生怪味和异色。纳豆菌本身作为人体内的一种肠道益生菌在发酵过程中能产生维生素K、蛋白酶、多肽等多种有利于人体健康的物质。在发酵豆豉时，加入此两种菌在不改变豆豉口感风味的同时得到产纳豆激酶的豆豉产品，健康，经济，口感好。
[0007]为达到上述目的，本发明的技术方案:
[0008]一种溶栓豆豉的制备方法，其中所使用纳豆菌HT8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC7168，保藏日期:2013年Ol月18日，分类命名:枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ;毛霉从忠县忠州腐乳毛还中分离获得,包括如下步骤:
[0009]步骤一、菌种活化:将斜面保藏毛霉菌种于无菌操作下接种到PDA斜面培养基，于恒温培养箱18-20°C培养72h，于冰箱中保存备用；吸取IOOuL纳豆菌HT8到IOmL LB培养基，37°C，160r / min培养12h，于冰箱保存备用；
[0010]步骤二、毛霉种子液的制备:将PDA斜面培养基活化的毛霉菌种加入适量的无菌生理盐水，用移液器吸取适量菌液，接种于麸皮培养基,20 °C下培养96h,至三角瓶内鼓皮长满菌丝和灰色孢子后取出备用，在培养好的种曲培养瓶中加入500mL灭菌生理盐水充分摇匀，双层纱布过滤，滤渣再加500mL灭菌生理盐水洗涤一次过滤，两次滤液混合制成孢子悬液，将此孢子悬浮液置于4°C冰箱中，作为菌种保存；
[0011]步骤三、纳豆菌种子液的制备:取200uL的活化纳豆菌HT8菌种到20mL液体种子培养基，37°C，160r / min 培养 18h ；
[0012]步骤四、黄豆的处理:选取颗粒饱满，大小均匀的黄豆，称量洗净，与水以1:3的比例于30°C下浸泡3h，浙干，再称取一定量于小烧杯中，在高温高压灭菌锅下，121°C蒸煮30min，冷却，待用；
[0013]步骤五、接种:将HT8纳豆菌和毛霉按1:10的比例接种，其接种总量为黄豆总质量的4%，接种时可用移液枪进行操作；
[0014]步骤六、培养:在25°C的温度下培养，在22h时拌菌一次，待培养到48h，即得到豆豉前发酵产物；
[0015]步骤七、后熟:发酵成熟的豆豉加入一定比例的配料，拌匀，装罐，在4°C条件下，进行后熟处理48h，制得溶栓豆豉。
[0016]所述步骤一中LB培养基为:蛋白胨IOg / L，酵母粉5g / L，氯化钠IOg / L，磷酸二氢钾Ig / L及余量的水。
[0017]所述步骤二中麸皮培养基为:麸皮10g，黄豆粉IgwK 13.2g。
[0018]所述步骤六中黄豆与配料的配比为:每IOOOkg黄豆(干重)添加白酒50L，食盐180kg,花椒粉IOkg,五香粉5kg。
[0019]相对于现有技术，本发明的有益效果为:
[0020]1、本发明以毛霉和纳豆菌产蛋白酶以及纳豆菌产纤溶酶作为评价指标的情况，接种纳豆菌后毛霉生长良好，对蛋白酶含量影响不大，获得的豆豉中纳豆激酶活力达到823.51U / g，蛋白酶活力达到1983.91U / g。
[0021]2、本发明寻找到豆豉发酵的最佳条件，在不影响豆豉风味的同时，大大缩短了传统豆豉发酵工艺所需的时间。同时在操作过程中，条件控制方便，有利于生产化操作；
[0022]3、本发明在不额外增加任何设备的情况下，仅利用豆豉的原始生产线就能完成纳豆菌和毛霉的对黄豆的共发酵，这大大的节省了生产成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1、为L-酪氨酸标准曲线图；
[0024]图2、为尿激酶标准曲线图；[0025]图3、为溶栓效果对比图，图中1:生理盐水测试组，2:豆豉粗酶液测试组；
[0026]图4、溶栓豆豉制备流程图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图和实施例更详细地说明本发明的实施方案。但本发明的实施并不局限于以下所述，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0028]在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0029]一种溶栓豆豉的制备方法，其中所使用纳豆菌HT8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC 7168，毛霉从忠县忠州腐乳毛坯中分离获得，包括如下步骤:
[0030]步骤一、菌种活化:将斜面保藏毛霉菌种于无菌操作下接种到PDA斜面培养基，于恒温培养箱18-20°C培养72h，于冰箱中保存备用；吸取IOOuL纳豆菌HT8到IOmL LB培养基，37°C，160r / min培养12h，于冰箱保存备用；
[0031]步骤二、毛霉种子液的制备:将PDA斜面培养基活化的毛霉菌种加入适量的无菌生理盐水，用移液器吸取适量菌液，接种于麸皮培养基,20 °C下培养96h,至三角瓶内鼓皮长满菌丝和灰色孢子后取出备用，在培养好的种曲培养瓶中加入500mL灭菌生理盐水充分摇匀，双层纱布过滤，滤渣再加500mL灭菌生理盐水洗涤一次过滤，两次滤液混合制成孢子悬液，将此孢子悬浮液置于4°C冰箱中，作为菌种保存；
[0032]步骤三、纳豆菌种子液的制备:取200uL的活化纳豆菌HT8菌种到20mL液体种子培养基，37°C，160r / min 培养 18h ；
[0033]步骤四、黄豆的处理:选取颗粒饱满，大小均匀的黄豆，称量洗净，与水以1:3的比例于30°C下浸泡3h，浙干，再称取一定量于小烧杯中，在高温高压灭菌锅下，121°C蒸煮30min，冷却，待用；
[0034]步骤五、接种:将HT8纳豆菌和毛霉按1:10的比例接种，其接种总量为黄豆总质量的4%，接种时可用移液枪进行操作；
[0035]步骤六、培养:在25°C的温度下培养，在22h时拌菌一次，待培养到48h，即得到豆豉前发酵产物；
[0036]步骤七、后熟:发酵成熟的豆豉加入一定比例的配料，拌匀，装罐，在4°C条件下，进行后熟处理48h，制得溶栓豆豉。
[0037]所述步骤一中LB培养基为:蛋白胨IOg / L，酵母粉5g / L，氯化钠IOg / L，磷酸二氢钾Ig / L及余量的水。
[0038]所述步骤二中麸皮培养基为:麸皮10g，黄豆粉lg，水13.2g。
[0039]所述步骤六中黄豆与配料的配比为:每IOOOkg黄豆(干重)添加白酒50L，食盐180kg,花椒粉IOkg,五香粉5kg。
[0040]试验例:
[0041]粗酶液制备:将豆豉置于50mL离心管中，每Ig豆豉加入2ml磷酸缓冲液，摇匀，置于4°C冰箱中浸提IOh,取出于高速冷冻离心机中IOOOOr / min离心IOmin,取上清液得粗酶液。[0042]酶活测定:纤溶酶活力测定依据中华人民共和国药典(二部)和邵荣军的方法，进行综合改进后，制备纤维蛋白平板方法。将粗酶液加入纤维蛋白平板，在37°C恒温培养箱中培养18h，测定溶圈的直径。以尿激酶标准曲线(见图2)计算样品的相对酶活力大小；蛋白酶活力测定按照GB / T 23527-2009(福林法)进行测定(L-酪氨酸标准曲线见附图1)。
[0043]按此法制备的豆豉毛霉长势接近毛霉单独生长，纤溶酶活性为823.51U / g，蛋白酶活性为1983.91U / g0
[0044]体外溶栓试验:
[0045]取新鲜兔血，待自然凝固后切成相同大小的血块，用吸水纸吸干表面水分后称量，加入IOmL豆豉粗酶液的试管中，同时以生理盐水为空白对照，放置于37°C恒温培养箱内，定时观察溶栓效果。结果如附图3显示，2h后豆豉粗酶液试管中的血块消失，而生理盐水对照组中血块大小无明显变化。
[0046]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
【权利要求】
1.一种溶栓豆豉的制备方法，其特征在于，其中所使用纳豆菌HT8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC 7168，毛霉从忠县忠州腐乳毛坯中分离获得，包括如下步骤: 步骤一、菌种活化:将斜面保藏毛霉菌种于无菌操作下接种到PDA斜面培养基，于恒温培养箱18-20°C培养72h，于冰箱中保存备用；吸取IOOuL纳豆菌HT8到IOmL LB培养基，37°C，160r / min培养12h，于冰箱保存备用； 步骤二、毛霉种子液的制备:将PDA斜面培养基活化的毛霉菌种加入适量的无菌生理盐水，用移液器吸取适量菌液，接种于麸皮培养基，20°C下培养96h，至三角瓶内鼓皮长满菌丝和灰色孢子后取出备用，在培养好的种曲培养瓶中加入500mL灭菌生理盐水充分摇匀，双层纱布过滤，滤渣再加500mL灭菌生理盐水洗涤一次过滤，两次滤液混合制成孢子悬液，将此孢子悬浮液置于4℃冰箱中，作为菌种保存； 步骤三、纳豆菌种子液的制备:取200uL的活化纳豆菌HT8菌种到20mL液体种子培养基，37°C，160r / min 培养 18h ； 步骤四、黄豆的处理:选取颗粒饱满，大小均匀的黄豆，称量洗净，与水以1:3的比例于30°C下浸泡3h，浙干，再称取一定量于小烧杯中，在高温高压灭菌锅下，121°C蒸煮30min，冷却，待用； 步骤五、接种:将HT8纳豆菌和毛霉按1:10的比例接种，其接种总量为黄豆总质量的4%，接种时可用移液枪进行操作； 步骤六、培养:在25°C的温度下培养，在22h时拌菌一次，待培养到48h，即得到豆豉前发酵产物； 步骤七、后熟:发酵成熟的豆豉加入一定比例的配料，拌匀，装罐，在4°C条件下，进行后熟处理48h，制得溶栓豆豉。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中LB培养基为:蛋白胨IOg/L，酵母粉5g / L，氯化钠10g/L，磷酸二氢钾Ig / L及余量的水。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中麸皮培养基为:麸皮10g，黄豆粉 IgjJc 13.2g。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤七中黄豆与配料的配比为:每IOOOkg黄豆(干重)添加白酒50L，食盐180kg，花椒粉10kg，五香粉5kg。
【文档编号】A23L1/29GK103829166SQ201310681809
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】陈斌, 和七一, 方雅洁, 陈治霖 申请人:重庆师范大学